Methodenartikel

Een Murine Staart Lymfoedeem Model

DOI:

10.3791/61848

⸱

10 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Indiana Center for Regenerative Medicine and Engineering, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem is zwelling van de extremiteit veroorzaakt door lymfatische disfunctie. We beschrijven een chronisch muizenstaartmodel van lymfoedeem en het nieuwe gebruik van weefselnanotransfectietechnologie (TNT) voor genetische ladingafgifte aan de staart.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem is zwelling van de extremiteit veroorzaakt door lymfatische disfunctie. De aangedane ledemaat vergroot door ophoping van vocht, vetweefsel en fibrose. Er is geen remedie voor deze ziekte. Een muisstaartmodel dat een focale huidexcisie van volledige dikte gebruikt in de buurt van de basis van de staart, resulterend in staartzwelling, is gebruikt om lymfoedeem te bestuderen. Dit model kan echter resulteren in vasculaire omvattende en daaruit voortvloeiende staartnecrose en vroege staartzwelling, waardoor de klinische vertaalbaarheid ervan wordt beperkt. Het chronische murinestaartlymfedeemmodel induceert aanhoudend lymfoedeem gedurende 15 weken en een betrouwbare perfusie aan de staart. Verbeteringen van het traditionele murinestaartlymfedeemmodel omvatten 1) nauwkeurige excisie van volledige dikte en lymfatisch knippen met behulp van een chirurgische microscoop, 2) bevestiging van postoperatieve arteriële en veneuze perfusie met behulp van laserspikkel met hoge resolutie, en 3) functionele beoordeling met behulp van indocyaninegroene nabij-infraroodlaserlymfangiografie. We gebruiken ook weefsel nanotransfectietechnologie (TNT) voor nieuwe niet-virale, transcutane, focale levering van genetische lading aan de muizenstaart vasculatuur.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem is zwelling van de extremiteit veroorzaakt door lymfatische disfunctie. De aangedane ledemaat vergroot door de ophoping van vocht, vet en fibrose1. Lymfoedeem treft wereldwijd 250 miljoen mensen2,3,4. Geschat wordt dat 20-40% van de patiënten die een behandeling ondergaan voor solide maligniteiten, zoals borstkanker, melanoom, gynaecologische / urologische tumoren of sarcomen, lymfoedeem ontwikkelen2,4,5. Morbiditeit van lymfoedeem omvat terugkerende infecties, pijn en misvorming6. Er is geen remedie voor deze progressieve, levenslange ziekte. De huidige therapieën zijn variaby effectief7 en omvatten compressie, volledige decongestieve therapie door fysiotherapeuten, excisieprocedures en microchirurgische operaties, waaronder gevasculariseerde lymfeklieroverdracht en lymfooveneuze bypass7,8,9,10,11,12,13,14. De ideale behandeling voor lymfoedeem moet nog worden ontdekt.

Het bestuderen van het mechanisme en de therapie van lymfoedeem is beperkt. Er is een gemiddeld vertraagd begin van een jaar na het lymfeletsel15,16 en de meeste personen die iatrogene belediging ervaren met bestraling en chirurgie ontwikkelen geen lymfoedeem4,6,17. Hoewel grote diermodellen, waaronder honden, schapen en varkens, zijn beschreven18,19,20,is het muisstaartmodel het meest toegepast vanwege gemak, kosten en reproduceerbaarheid. Muismodellen voor het onderzoeken van lymfoedeem omvatten een staartmodel, diptheria-toxine gemedieerde lymfatische ablatie en okselachtige of popliteale lymfeklierdissectie21,22,23,24,25,26. De meeste staartmodellen gebruiken een focale, volledige dikte huidexcisie met lymfatische kanaalknipsel die wordt uitgevoerd in de buurt van de basis van destaart 22, wat resulteert in staartzwelling en histologische kenmerken vergelijkbaar met menselijk lymfoedeem24,27,28,29. Het standaard muizenstaartmodel verdwijnt echter meestal spontaan in slechts 20 dagen en gaat gepaard met periodieke staartnecrose30. Het lymfoedeem muisstaartmodel verlengt een aanhoudend lymfoedeem na 15 weken, toont bevestigde arteriële en veneuze doorgankelijkheid en maakt functionele lymfatische disfunctiebeoordeling mogelijk.

Een muizenstaartmodel van lymfoedeem maakt het mogelijk om nieuwe therapieën te evalueren om lymfoedeem te behandelen. Gengebaseerde strategieën zijn gebruikt in het muismodel gemedieerd door virale vectoren31,32. We gebruiken ook een nieuwe weefsel nanotransfectietechnologie (TNT) voor genetische ladingafgifte aan de lymfoedemateuze muizenstaart. TNT faciliteert directe, transcutane genafgifte met behulp van een chip met nanokanalen in een snel gericht elektrisch veld33,34,35,36. Het model omvat het gebruik van TNT2.0 om focale genafgifte van potentiële gengebaseerde therapeutica aan de lymfatische verwondingsplaats van de muizenstaart mogelijk te maken35.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor dieronderzoek van de instelling. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Dieren werden gehuisvest onder een 12-uur durende licht-donker cyclus met voedsel en water ad libitum.

1. Chirurgische verstoring van de lymfevaten van de muizenstaart

  1. Gebruik acht weken oude C57BL/6 muizen met een gelijke geslachtsverdeling.
  2. Plaats een muis onder algemene anesthesie in een inductiekamer met 3-4% isofluraan in 100% zuurstof gevolgd door onderhoudssedatie bij 1-3% tijdens de procedure.
  3. Dien 0,5 mg/kg buprenorfine subcutaan met aanhoudende afgifte (SR) toe voor pijnbestrijding.
    OPMERKING: Aanvullende pijnstillende geneesmiddelen die post-op worden toegediend: Carprofen eenmaal per 24 uur gedurende ten minste 48 uur en Bupivacaïne eenmaal nadat de incisie is gemaakt of vóór het sluiten van de incisie, aangebracht door op huidranden te druppelen (duurt maximaal 4 - 6 uur).
  4. Plaats de muis dorsaal en prep de staart met 70% isopropylalcohol.
  5. Meet de staartdiameter voorafgaand aan de procedure in stappen van 5 mm vanaf 20 mm vanaf de basis van de staart met behulp van een remklauw. Deze metingen zullen worden gebruikt om het volume te berekenen met behulp van de afgeknotte kegelvergelijking37.
  6. Markeer een omtrekexcisie van 3 mm op de staart op 20 mm van de basis.
  7. Voer een zorgvuldige huidexcisie van 3 mm uit met een steriel chirurgisch mes (maat 15), waarbij alle onderliggende vasculatuur intact blijft onder chirurgische microscopische vergroting. Insneden het superieure omtrekmerk (20 mm vanaf de staartbasis) eerst door de dermis, gevolgd door een omtrekkende incisie van volledige dikte 3 mm uit de verbinding tot de eerste incisie.
    1. Maak een loodrechte verticale incisie van volledige dikte om de twee incisies met elkaar te verbinden. Gebruik een getande fijne pick-up om een voorrand vast te pakken en gebruik microscisors om zorgvuldig diep in het avasculaire vlak naar de dermis en oppervlakkig naar de ader adventitia te ontleden.
  8. Injecteer 0,1 ml isosulfanblauw (1%) subcutaan proximaal tot de punt van de staart.
  9. Identificeer de twee lymfekanalen naast de laterale staartaderen onder de chirurgische microscoop. De lymfevaten zullen blauw lijken vanwege isosulfan injectie. Transect de lymfevaten met behulp van een rechte microchirurgische schaar. Gebruik de schaar om zorgvuldig een vlak tussen de laterale ader en de lymfe te ontleden. Passeer vervolgens de punt van een schaarblad tussen het lymfevat en de laterale ader en sluit de messen om het lymfevat te transecteren.
  10. Kleed de staartwond aan met een steriel hechtend helder verband. Controleer post-op incisies dagelijks om ervoor te zorgen dat ze niet geïnfecteerd of bloedend zijn en bied wondverzorging gedurende 2 weken.
  11. Huisvest de dieren afzonderlijk om verder letsel aan de staart te voorkomen en om te voorkomen dat de dieren elkaar bijten, wat zou leiden tot chirurgische complicaties.

2. Staart vasculaire beoordeling met laser spikkel contrast beeldvorming

  1. Verdoof de muis zoals in stap 1.2.
  2. Als u laserspikkelcontrastafbeeldingen wilt gebruiken om de vasculariteit van de staart te visualiseren, stelt u de breedte in op 0,8 cm, de hoogte op 1,8 cm, de puntdichtheid op hoog, de framesnelheid op 44 afbeeldingen / seconde, de tijd op 30 seconden en de kleurenfoto op 1 per 10 seconden.
  3. Evalueer de veneuze en arteriële perfusie op doorgankelijkheid. Kwalitatief moet de continuïteit van de stroom worden gevisualiseerd.

3. Functionele lymfatische evaluatie met nabij-infrarood laserangiografie

  1. Verdoving het dier zoals in stap 1.2
  2. Reconstitueer indocyaninegroen (ICG) (25 mg/10 ml) en dien 0,1 ml subcutaan toe in de distale muizenstaart in de buurt van de punt.
  3. Dim de kamerverlichting. Plaats nabij-infrarood laserangiografie in buffering-instelling gevolgd door live-opname.

4. Focale levering van nucleïnezuurlading aan muizenstaart met TNT

  1. Verdoven van het dier zoals in stap 1.2.
  2. Exfolieer de muizenstaart met behulp van actuele huid exfoliatie crème.
  3. Dompel de muizenstaart gedurende 5 minuten onder in collagenase-oplossing (10 mg/ml) bij 37 °C.
  4. Laad DNA in het TNT2.0 chipreservoir35.
  5. Plaats het TNT2.0 siliconen chipapparaat over de gewenste brandpuntsplaats van levering op de staart met nanonedles in contact met de staart.
  6. Plaats een positieve elektrische sonde in het reservoir. Bevestig de negatieve sonde aan een naald van 30 G en steek de naald subcutaan in de staart op de plaats van levering.
  7. Pas elektrische stimulatie van de blokgolfpuls toe (pulsen van 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De techniek voor het muizenstaartmodel voor aanhoudend lymfoedeem is weergegeven in figuur 1. De figuur toont de relevante anatomie van het muisstaartmodel. Figuur 2 toont de progressieve zwelling en aanhoudend persistant lymfoedeem in de muizenstaart na lymfoedeeminductie. Het muisstaartvolume, zoals berekend door de afgeknotte kegelvergelijking, piekt in week 4 en plateaus naar week 6 gevolgd door een geleidelijke verbetering d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem wordt gecategoriseerd als een primaire (aangeboren) of secundaire (iatrogene lymfatische) verwonding38,39. Secundair lymfoedeem omvat 99% van de gevallen39. Secundair lymfoedeem wordt meestal veroorzaakt door infectie (filariasis) of post-oncologische behandeling met lymfadenectomie of straling4,39. Een translationeel diermodel is een uitdaging voor secundair lymfoedeem,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidiefinanciering van de American Association of Plastic Surgeons Academic Scholarship en het Ministerie van Defensie W81XWH2110135   aan AHH. Aesthetic Surgery Education and Research Foundation subsidie aan MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 en R01DK125835 aan CKS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tegaderm Film1626W
Chirurgisch MicroscoopLeica, Wetzlar, DuitslandMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, ZwedenPSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (voorheen Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 muizenJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Vuilnisnaald 30GX1Fischer Scientific305128
Operatie schaarFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Juwelierstang, Sklar 4-1/2 inchFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm snijrandFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597(2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 8 Suppl 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468(2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 3 Suppl 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 4S Suppl 3 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254(2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095(2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405(2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940(2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157(2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220(2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lymfatisch afklemmenlaser speckle imagingindocyaninegroen lymfangiografieweefsel nanotransfectievolledige dikte excisiestaartvolumemetinghoge resolutie laser specklenabij infrarood lymfangiografiegenetische vrachtaflevering

Gerelateerde artikelen