Methodenartikel

Het bestuderen van de activiteit van neuropeptiden en andere regulatoren van het uitscheidingssysteem in de volwassen mug

DOI:

10.3791/61849

⸱

24 augustus 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, York University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst methodologieën achter de Ramsay-assay, ionselectieve micro-elektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) en in vitro contractie-assays, toegepast om het uitscheidingssysteem van volwassen muggen te bestuderen, bestaande uit de Malpighian tubuli en hindgut, om gezamenlijk ionen- en vloeistofsecretiesnelheden, contractiele activiteit en transepitheliaal ionentransport te meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studies van insectenfysiologie, met name in die soorten die vectoren zijn van pathogenen die ziekte veroorzaken bij mensen en andere gewervelde dieren, bieden de basis om nieuwe strategieën voor ongediertebestrijding te ontwikkelen. Hier wordt een reeks methoden beschreven die routinematig worden gebruikt om de functionele rollen van neuropeptiden en andere neuronale factoren (d.w.z. biogene aminen) op het uitscheidingssysteem van de mug, Aedes aegypti, te bepalen. De Malpighian tubuli (MT's), verantwoordelijk voor de primaire urinevorming, kunnen urenlang blijven functioneren wanneer ze uit de mug worden verwijderd, waardoor vloeistofsecretiemetingen na hormoonbehandelingen mogelijk zijn. Als zodanig is de Ramsay-test een nuttige techniek om secretiesnelheden te meten van geïsoleerde MT's. Ionselectieve micro-elektroden (ISME) kunnen achtereenvolgens worden gebruikt om ionconcentraties (d.w.z. Na + en K +) in de uitgescheiden vloeistof te meten. Deze test maakt het mogelijk om op een bepaald moment verschillende MT's te meten en de effecten van verschillende hormonen en geneesmiddelen te bepalen. De Scanning Ion-selective Electrode Technique maakt gebruik van ISME om spanning te meten die representatief is voor ionische activiteit in de ongestirreerde laag naast het oppervlak van iontransporterende organen om transepitheliaal transport van ionen in bijna realtime te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van hormonen en andere regulatoren op ionabsorptie of secretie over epithelia te begrijpen. Hindgut contractie assays zijn ook een nuttig hulpmiddel om myoactieve neuropeptiden te karakteriseren, die het vermogen van dit orgaan om overtollig vocht en afval te verwijderen kunnen verbeteren of verminderen. Gezamenlijk geven deze methoden inzicht in hoe het uitscheidingssysteem wordt gereguleerd bij volwassen muggen. Dit is belangrijk omdat functionele coördinatie van de uitscheidingsorganen cruciaal is bij het overwinnen van uitdagingen zoals uitdrogingsstress na eclosie en voor het vinden van een geschikte gewervelde gastheer om een bloedmeel te verkrijgen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Handhaving van zout- en waterniveaus bij insecten stelt hen in staat om te slagen in vele ecologische en ecologische niches, met behulp van een verscheidenheid aan voedingsstrategieën1. De meeste insecten hebben mechanismen ontwikkeld om de samenstelling van hun hemolymfe binnen nauwe grenzen te reguleren om de verschillende uitdagingen in verband met hun specifieke omgeving te weerstaan2. Terrestrische insecten worden vaak geconfronteerd met de uitdaging om water te besparen en het uitscheidingssysteem ondergaat anti-diurese om verlies van water en enkele essentiële zouten te voorkomen, waardoor uitdroging wordt vermeden. Diurese treedt daarentegen op wanneer het insect zich voedt en wordt uitgedaagd met overtollig water en mogelijk zouten3,4. Door hun gespecialiseerde en zeer actieve uitscheidingssysteem hebben insecten regulerende mechanismen ontwikkeld die werken om hun osmoregulatoire uitdagingen tegen te gaan. Bij volwassen Aedes aegypti-muggen bestaat het uitscheidingssysteem uit de Malpighian tubuli (MT's) en hindgut, waarvan de laatste bestaat uit het voorste ileum en het achterste rectum5. MT's zijn verantwoordelijk voor het genereren van primaire urine, meestal rijk aan NaCl en / of KCl. De primaire urine wordt vervolgens gemodificeerd door secretoire en reabsorptieve processen terwijl deze stroomafwaarts van de tubulus reist en het achtergut5 binnengaat. De uiteindelijke uitwerpselen kunnen hyper- of hypoosmotisch zijn voor de hemolymfe, afhankelijk van de voedings-/omgevingsomstandigheden, en zijn verrijkt met toxische en stikstofhoudende afvalstoffen2.

MT's zijn ideaal voor het bestuderen van vele kenmerken van epitheelvloeistof en opgeloste stoftransport omdat ze een grote verscheidenheid aan transport- en excretiefuncties uitvoeren2,6. Door hormonale regulatie2 functioneren MT's door ionen en andere opgeloste stoffen uit het bloed af te scheiden in het tubuluslumen7, waardoor een osmotische gradiënt ontstaat waardoor water kan worden getransporteerd door aquaporinen8,9, die gezamenlijk de primaire urine creëren, voordat ze naar het reabsorptieve achtergut2 reizen. Dus, door het verzamelen van de uitgescheiden vloeistof van geïsoleerde MT's, kan men continu het transepitheliale transport van vloeistof en ionen controleren. Het meten van secretiesnelheid en urinesamenstelling geeft inzicht in mechanismen die verantwoordelijk zijn voor transepitheliaal ionen- en vloeistoftransport. Een populaire methode voor het bestuderen van vloeistofsecretiesnelheden is de Ramsay-test, die voor het eerst werd geïntroduceerd door Ramsay in 195310. Bij deze methode wordt het distale (gesloten) uiteinde van de tubulus behandeld met een hormoon (of een ander testmiddel / medicijn), terwijl het proximale (open) uiteinde rond een speld in met water verzadigde paraffineolie wordt gewikkeld, die de primaire urine afscheidt en zich ophoopt als een druppel op de punt van de pin. Geïsoleerde MT's kunnen overleven en functioneren gedurende lange perioden (tot 24 uur) onder geoptimaliseerde in vitro omstandigheden, waardoor ze geschikte en efficiënte modellen zijn voor vloeistofsecretiemeting. Insecten hebben een open bloedsomloop, dus de MT's kunnen gemakkelijk worden ontleed en verwijderd omdat ze meestal vrij in de hemolymfe zweven6. Bovendien, met uitzondering van bladluizen - die geen MT's11 hebben - kan het aantal MT's in een bepaalde insectensoort aanzienlijk variëren van vier tot honderden (vijf in Aedes-muggen) waardoor meerdere metingen van één insect mogelijk zijn.

De MT's in Aedes-muggen zijn, net als andere endopterygote-insecten, samengesteld uit twee celtypen die een eenvoudig epitheel vormen2,12; grote hoofdcellen, die actief transport van kationen (d.w.z. Na + en K +) naar het lumen vergemakkelijken, en dunne stellaatcellen, die helpen bij transepitheliale Cl-secretie13. De MT's worden niet geïnnerveerd2, maar worden in plaats daarvan gereguleerd door verschillende hormonen, waaronder zowel diuretische als antidiuretische factoren, waardoor de controle van ionentransport (voornamelijk Na +, K + en Cl-) en osmotisch verplicht water2 mogelijk is. Talrijke studies hebben de hormonale regulatie van Aedes MT's onderzocht om de rol van endocriene factoren op transepitheliaal transport14,15,16,17,18 te begrijpen. Zoals te zien is in de representatieve resultaten, tonen de protocollen hierin de effecten aan van verschillende hormonale factoren op geïsoleerde MT's van volwassen vrouwelijke A. aegypti-muggen, waaronder zowel diuretische als antidiuretische controle (figuur 1). De Ramsay-test wordt gebruikt om aan te tonen hoe een antidiuretisch hormoon, AedaeCAPA-1, de vochtafscheiding van MT's remt die worden gestimuleerd door diureticumhormoon 31 (DH31) (figuur 1).

De kleinere omvang van insecten heeft de ontwikkeling van micromethoden vereist voor het meten van ionische activiteit en concentraties in vloeistofmonsters, of in de buurt van het oppervlak van geïsoleerde weefsels zoals de MT's en de darm. Er zijn verschillende methoden geïmplementeerd, waaronder het gebruik van radio-isotopen van ionen19, waarvoor het verzamelen van de uitgescheiden vloeistofdruppels nodig is voor het meten van ionenconcentraties20. Gestimuleerde Aedes-tubuli scheiden in vitro meestal ~ 0,5 nL / min21 af, dus het verwerken van dergelijke kleine volumes kan een uitdaging vormen en mogelijk fouten veroorzaken bij overdracht. Als gevolg hiervan zijn ionselectieve micro-elektroden (ISME's) op grote schaal gebruikt om ionenconcentraties in uitgescheiden druppels VAN MT's in vitro te meten. Bij deze methode worden een referentie-elektrode en ISME, gevuld met de juiste opvuloplossing en ionofoor, in de uitgescheiden urinedruppel geplaatst om de ionenconcentraties te bepalen22. Aangepast van Donini en collega's23, gebruikt dit huidige protocol een Na + -selectieve ionofoor om ionenactiviteit te meten in uitgescheiden druppels van gestimuleerde MT's bij volwassen Aedes-muggen. Aangezien ionselectieve micro-elektroden de ionenactiviteit meten, kunnen deze gegevens worden uitgedrukt als ionconcentraties na de veronderstelling dat de kalibratieoplossingen en experimentele monsters dezelfde ionenactiviteitscoëfficiënt delen21 (figuur 1B,C).

De Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) maakt ook gebruik van ISME's om ionenconcentratiegradiënten te meten in de niet-gestirreerde laag naast organen, weefsels of cellen die ionen transporteren. De ISME's meten spanningsgradiënten die vervolgens kunnen worden gebruikt om de ionenconcentratiegradiënten en richting en grootte van ionenflux over het orgaan, weefsel of cel20 te berekenen20. Bij deze techniek wordt de ISME gemonteerd op een manipulator met drie assen die wordt bestuurd door geautomatiseerde microstapmotoren, zodat de 3D-positie wordt geregeld tot op micrometerniveau20. Spanningen worden gemeten op twee punten binnen de niet-gestirreerde laag met behulp van een bemonsteringsprotocol dat is geprogrammeerd in en bestuurd door computersoftware. De twee punten worden meestal gescheiden door een afstand van 20-100 μm met één punt binnen 5-10 μm van het oppervlak van het orgaan, weefsel of cel en het tweede punt nog eens 20-100 μm afstand. Het verschil in grootte van de spanningen tussen de twee punten wordt berekend om een spanningsgradiënt24,25,26 te verkrijgen, die vervolgens wordt gebruikt om de concentratiegradiënt en vervolgens de nettoflux te berekenen met behulp van de Wet van Fick24,27. Deze methode is nuttig voor het beoordelen van het transport van specifieke ionen over verschillende regio's van de insectendarm en MT's, of op specifieke tijdstippen na blootstelling aan bloedmeel of behandeling. De SIET kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te begrijpen hoe absorberende en secretoire processen in het uitscheidingssysteem van muggen worden gereguleerd door hormonen28, evenals verschillende voedingsgedragingen en opfokomstandigheden25. Eerder werk met behulp van de SIET onthulde locaties die betrokken zijn bij ionentransport langs de anale papillen en het rectum van larvale en volwassen muggen24,28. Het huidige protocol, eerder beschreven door Paluzzi en collega's26, meet de Na+ flux over de rectale pad epithelia van het volwassen vrouwelijke rectum (figuur 2).

Het laatste segment van het uitscheidingssysteem van de mug vereist gecoördineerde spierbewegingen om voedsel te mengen en afval af te scheiden26. Niet-absorbeerbare producten van de spijsvertering uit het middendarm, samen met primaire urine die door de MT's wordt uitgescheiden, worden door de pylorusklep geleid en aan het achtergut afgegeven2. Spontane achterbeencontracties beginnen bij de pylorusklep en komen voor in peristaltische golven, die over het ileum worden doorgegeven door de gecoördineerde samentrekking van cirkelvormige en longitudinale spieren rond het basale oppervlak van epitheelcellen26. Ten slotte helpen de spieren in het rectum om afvalstoffen door het anale kanaal voort te stuwen en te elimineren. Hoewel de beweeglijkheid van het achterdarm van insecten myogeen is en extracellulaire Ca2+ nodig heeft om spontane weeën te produceren, kunnen deze processen ook neuronaal worden gereguleerd26,29,30. Deze exogene regulatie door het zenuwstelsel is belangrijk na het voeden, omdat het dier afvalstoffen uit de darm moet verdrijven en het hemolymfeevenwicht moet herstellen31. Als gevolg hiervan is het uitvoeren van in vitro bioassays om myostimulerende of myoinhibitory neuropeptiden te identificeren nuttig bij het beoordelen van hoe neurochemicaliën de beweeglijkheid van hindgut beïnvloeden. Het huidige protocol, uitgevoerd door Lajevardi en Paluzzi28, maakt gebruik van video-opnames om de ileale motiliteit in reactie op neuropeptiden te onderzoeken (figuur 3). Evenzo kan een krachtomvormer of impedantieomvormer ook worden gebruikt om sporen van samentrekkingen te observeren via een data-acquisitiesoftware32,33. Het gebruik van videotechnologie stelt ons echter in staat om het orgaan visueel te beoordelen en verder te analyseren met behulp van een subset van parameters om de rol van hormonen op de beweeglijkheid van het achterbeen te identificeren.

Het gebruik van deze technieken kan helpen bij het karakteriseren van factoren die het vloeistof- en ionentransport langs het uitscheidingssysteem reguleren en coördineren, samen met de beweeglijkheid van het achterdarm. Belangrijk is dat een functioneel verband tussen de diuretische respons door de MT's en de beweeglijkheid van het achterdarm wordt ondersteund, aangezien diuretische hormonen, zoals DH31 en 5HT, gekenmerkt door hun vermogen om vochtafscheiding door de MT's te stimuleren, ook myotrope acties langs de muggenachterdarm vertonen21,34,35 . Deze bevindingen benadrukken het belang van strikte coördinatie tussen de MT's en hindgut tijdens gebeurtenissen zoals postprandiese bij insecten die een snelle afvalverwijdering vereisen.

Hierin wordt de gedetailleerde benadering achter de Ramsay-testtechniek beschreven om de vloeistofsecretiesnelheid in de mug, A. aegypti, te meten en het gebruik van ionselectieve micro-elektroden om Na + -concentraties in de uitgescheiden vloeistof van de MT's te bepalen, waardoor in combinatie transepitheliale ionentransportsnelheden kunnen worden bepaald. Daarnaast worden de Scanning Ion-selective Electrode Technique en hindgut contraction assays beschreven om respectievelijk ionenflux en motiliteit te meten, wat helpt om de hormonale regulatie van het achterbeen op te helderen (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Met siliconen beklede gerechten maken

OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd voorafgaand aan de experimenten. Deze gerechten zullen worden gemaakt om de assay-schotel te bereiden voor dissecties en voor contractie-assay-experimenten.

  1. Bereid de siliconen voor met behulp van een siliconen elastomeerkit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Meng de tweedelige vloeibare componenten in een verhouding van 10 tot 1. Meng voorzichtig en grondig door om te keren, maar zorg ervoor dat u de bubbelvorming minimaliseert.
  2. Giet het siliconenelastomeer in standaard 60 mm wegwerppolystyreencultuurschalen tot een diepte van normaal tussen 7-9 mm. Bereid zoveel gerechten als nodig is. Verwijder eventuele luchtbellen met een fijne speld onder een microscoop kort na het gieten van siliconen in gerechten. Plaats de vaat in een stofvrije kamer of kast bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 48 uur of in de oven bij 50 °C gedurende ongeveer 4 uur om uit te harden (figuur 5A).

2. Het maken van de Ramsay assay schotel

OPMERKING: Het gerecht kan van experiment tot experiment worden hergebruikt, dus herhaal deze stap alleen als het gerecht beschadigd is of breekt. Een apart gerecht wordt gebruikt voor dissecties.

  1. Gebruik een scalpel (met standaard voorzorgsmaatregelen voor scherpe voorwerpen) en maak putjes in een van de met siliconen beklede petrischalen om de testschaal te bereiden, door voldoende van de siliconen, ongeveer ~ 5 mm, van de bovenkant van de schaal te verwijderen (dit zou moeten passen ~ 20 μL baddruppel). Gebruik hiervoor een permanente marker om de posities onder de schaal te markeren om aan te geven waar de putten moeten worden gemaakt. De putten moeten ~ 1 cm uit elkaar liggen, met een diameter van ongeveer ~ 4 mm om het distale uiteinde van de tubulus te laten passen. Elke put bevat één vloeistofafscheidende buis, dus een schotel met 20 putten zal het mogelijk maken om per experiment tot 20 MT's te analyseren.
  2. Om de Minutien-pinnen voor te bereiden, plaatst u de roestvrijstalen pinnen van 0,1 mm op een rij op een stuk etiketteerband, loodrecht op de as van de tape. Knip met behulp van een schaar over de lengte van de tape en creëer gelijke helften van de pinnen. Gebruik een halve pin voor elke put.
  3. Gebruik een stompe tang en steek elke halve pin in de met siliconen beklede testschaal, naast elke put. Afhankelijk van de lengte van de insectentubuli, plaatst u de halve pin op een afstand waardoor het distale uiteinde van de tubulus kan worden ondergedompeld in de badzoutoplossing en het proximale uiteinde om rond de pin te wikkelen. Deze stap kan onder een microscoop worden uitgevoerd om putten gemakkelijk te visualiseren. De pinnen kunnen opnieuw worden gebruikt, maar vervang de halve pin als deze beschadigd of verloren gaat. (Figuur 5B)

3. Het maken van de poly-L-lysine-gecoate SIET schotel

OPMERKING: Deze stap is belangrijk voor het orgaan om zich tijdens SIET-metingen aan de onderkant van de schaal te hechten, zodat de plaats van meting voor elk monster hetzelfde blijft. Bereiding van deze gerechten moet ten minste 2 dagen voorafgaand aan de experimenten worden gedaan. Elk gerecht mag slechts één keer worden gebruikt bij het toepassen van een specifieke behandeling. Gooi na elk monster weg of als de poly-L-lysinelaag is afgekrast of beschadigd.

  1. Plaats voor elk monster een petrischaaltje van 35 mm op een vlakke ondergrond. Verwijder de deksels en pipetteer 70 μL poly-L-lysine (0,1 mg / ml) in het midden van elke schaal. Plaats de deksels er weer op en laat de poly-L-lysine ongestoord drogen (~48 h).
  2. Eenmaal droog, markeert u de bodem van de schotel met een cirkel die de gedroogde poly-L-lysine-laag schetst om beter te visualiseren waar het weggesneden orgaan na dissecties moet worden geplaatst. Indien nodig om volumes zoutoplossing en behandelingsoplossingen in experimenten te minimaliseren, gebruikt u een heet lijmpistool om de poly-L-lysine-coating te omringen, waardoor er voldoende ruimte overblijft voor de elektrode om te bewegen en achtergrondmetingen uit te voeren (~ 20-25 mm diameter van de gelijmde cirkel is voldoende). Deze gecoate schotels kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard bij RT (figuur 5C).

4. Het bereiden van de Ramsay en contractie assay gerechten voor experimenten

OPMERKING: Het gerecht kan opnieuw worden gebruikt (mits de juiste was om eerder gebruikte zoutoplossing / behandelingen te verwijderen), dus herhaal deze stap alleen als de plaat beschadigd is of breekt. Een apart gerecht wordt gebruikt voor dissecties. Deze stap wordt uitgevoerd op de dag van het experiment.

  1. Gebruik voor de contractietestschaal een scalpel (met standaard voorzorgsmaatregelen voor scherpe voorwerpen), maak putjes in een van de met siliconen beklede petrischalen om de testschaal te bereiden. Hoek het scalpel op een manier dat de putjes driehoekig worden om het vastzetten van het ontleedde weefsel aan de randen te vergemakkelijken. Putten moeten groot genoeg zijn om tot 250 μL te bevatten en in het hele spijsverteringskanaal passen (in plaats van te diep te graven, maak de put breder tot ongeveer 0,5-1 cm) (figuur 5D).
  2. Gebruik voor Ramsay-plaat een pipet en vul putjes tot 20 μL oplossing (18 μL 1X Aedes-zoutoplossing : Schneiders medium bereid in stap 5.2 en 2 μL hormoon / medicijn). Voor niet-gestimuleerde controles vult u putten met 20 μL 1X Aedes zoutoplossing: Schneider's medium. Zodra alle putten zijn gevuld, giet u gehydrateerde minerale olie in de testschaal totdat de putten en Minutien-pinnen zijn ondergedompeld. Gebruik een pipetpunt van 20 μL om luchtbellen te laten knallen of te verwijderen die de uitgescheiden druppels kunnen verstoren.

5. Oplossingen voorbereiden

  1. Bereid 2X Aedes aegypti zoutoplossing en 10x glucose, zoals beschreven in tabel 1, aangepast van Petzel en collega's36. Stockoplossingen moeten bij 4 °C worden bewaard. Maak werkvoorraden van 1X Aedes aegypti zoutoplossing (tabel 1) en bewaar bij 4 °C. Laat op de experimenteerdag de werkvoorraden voor gebruik naar RT komen. Bereid vers voor als er aanwijzingen zijn voor schimmel- of bacteriegroei.
  2. Om de baddruppel te bereiden, mengt u Aedes zoutoplossing (uit stap 5.1) met schneiders medium, in een verhouding van 1:1. Bereid in kleine aliquots, afhankelijk van hoeveel er nodig is. Bewaar het medium van Schneider in de koelkast, gooi het weg als er aanwijzingen zijn voor schimmel- of bacteriegroei. (Deze stap moet worden uitgevoerd op de dag van het experiment).
  3. Bereid voor Na+ fluxmetingen met behulp van de SIET een gemodificeerde Ca2+-vrije Aedes-zoutoplossing voor (tabel 2), zoals eerder beschreven26.

6. Mosquito MT's en hindgut dissecties

  1. Voor volwassen muggendissecties, verzamel pop in een klein bekerglas en plaats in een pot met een sucrose-oplossing voor voeding. Om de leeftijd van de mug te bepalen, isoleer je uitgekomen muggen en plaats je ze in een andere pot met vermelding van de leeftijd en het geslacht van muggen voor toekomstige dissecties.
  2. Plaats muggen kort om te worden ontleed op een CO2-pad en wacht tot ze niet meer reageren. Pak met behulp van een fijne tang de mug van zijn poot of vleugel en plaats op een met siliconen elastomeer bedekte ontleedschaal die in stap 1 is bereid. Plaats de mug aan één kant (laterale kant naar boven) en met een Minutien-pin in de thorax om de mug op zijn plaats te houden. Verwijder eventueel vleugels en poten van muggen voor gemakkelijkere dissectie.
  3. Voeg met behulp van een Pasteur-pipet een druppel RT Aedes-zoutoplossing toe om de mug volledig onder te dompelen in zoutoplossing. Zorg ervoor dat de dissectie helemaal onder zoutoplossing is (zie tabel 1 voor het maken van Aedes-zoutoplossing ).
  4. Leg de ontleedschaal onder een stereoscopische microscoop. Knijp het laatste buiksegment in met een fijne tang en trek langzaam weg van de mug. Deze stap wordt vergemakkelijkt door tegelijkertijd onder de microscoop te kijken. Het midgut, bevestigd met de MT's en hindgut, moet worden blootgesteld (figuur 6).
  5. Verwijder voor de Ramsay-test zorgvuldig elke tubulus van de midgut-hindgut-overgang, zorg ervoor dat de organen niet worden beschadigd. Gebruik een scherpe fijne tang om de buisjes afzonderlijk te verwijderen - gebruik geen beschadigde tubuli voor de test. (Zie stap 7 voor de installatie.)
  6. Ontleed voor de SIET het achterbeen in Ca2+-vrije Aedes-zoutoplossing (stap 5.3). Zorg ervoor dat de poly-L-lysine schotel ook een vast volume Ca2+-vrije Aedes zoutoplossing heeft. Verwijder voorzichtig de cuticula uit het rectum en plaats het achterbeen (kan andere aangehechte organen verwijderen, afhankelijk van wat er wordt gemeten) in de poly-L-lysineschaal. Bij het meten van ionentransport langs de rectale pad epithelia, plaats dan de hemolymfe-gerichte zijde van ten minste één rectale pad om toegankelijk te zijn voor de micro-elektrode (figuur 7).
    1. Gebruik een tang om het meest achterste uiteinde te grijpen en breng het achterbeen naar de bodem van de schaal (zonder structuren te beschadigen die zullen worden gemeten). Zodra het orgaan de poly-L-lysinelaag raakt, zal het zich hechten. Dit ontleedde monster is klaar voor metingen. (Zie stap 14 tot en met 16 voor SIET-instellingen en -metingen.)
  7. Zorg er voor de ileumcontractietest voor dat het achterbeen tijdens de dissectie aan het middendarm blijft zitten (figuur 4D). Verwijder voorzichtig de MT's om een onbelemmerd zicht op het achterbeen te hebben. Dit orgel wordt overgebracht naar een nieuwe schaal bereid zoals beschreven in stap 4.1. (Zie stap 17 voor het verkrijgen van testvideo's.)

7. Het opzetten van de Ramsay assay

  1. Til met behulp van de punt van de tang voorzichtig het proximale (open) uiteinde van de buis op door het over de tang te draperen (knijp niet in de tubulus) en breng over in een put van de testschaal. Deze stap kan ook worden gedaan met behulp van fijnglazen sondes.
  2. Zodra de tubulus in de put is ondergedompeld, pakt u het proximale uiteinde van de tubulus op met de tang, verwijdert u deze uit de baddruppel en wikkelt u het uiteinde rond de pin. Wikkel de buis twee keer rond de pin - en houd de lengte van de tubulus die overblijft in de baddruppel consistent met de andere tubuli. Op dit punt moet het distale uiteinde van de tubulus zich in de baddruppel bevinden, terwijl het proximale uiteinde rond de pin wordt gewikkeld, weg van de baddruppel, waardoor de uitgescheiden vloeistof zich ophoopt op de punt van de pin van het open proximale uiteinde.
  3. Onmiddellijk nadat de tubulus om de pin is gewikkeld, noteer je de putten (bijv. A, B, C), de tijd (wat de begintijd is van wanneer de vloeistof uit de tubulus begint te worden uitgescheiden) en alle andere identificerende informatie (bijv. Hormoon, genotype, enz.).
  4. Elke mug heeft vijf buisjes, dus herhaal stap 7.1-7.3 met de rest van de tubuli. Voor controle- en experimentele behandelingen splitst u de vijf tubuli binnen de verschillende behandelingen. Ga verder met de volgende dissectie, totdat het hele testgerecht gevuld is. Met oefening zou deze techniek meestal 2-3 minuten moeten duren om de tubuli te ontleden, ze over te brengen naar de badzoutoplossing en rond de pin te wikkelen, waardoor een verschil van 2-3 minuten in de starttijd tussen elke tubulus ontstaat.
    OPMERKING: Kalibreer voordat u met het experiment begint de oculaire micrometer van de microscoop met een stadiummicrometer onder het geselecteerde objectief. Uitgescheiden druppels worden routinematig gemeten onder een totale vergroting van 40x-50x.
  5. Na de toegewezen incubatietijd kan de uitgescheiden druppel worden gemeten. Meet en registreer met behulp van de oculaire micrometer van de microscoop de diameter van de uitgescheiden druppel. Bereken de diameter (d) van de uitgescheiden druppel door de diameter van de oculaire eenheid te vermenigvuldigen, gemeten met de kalibratieconversie (tabel 3). Bereken het volume van de uitgescheiden druppel met behulp van de vergelijking, V = πd3/6.
  6. Om de secretiesnelheid (nL min-1) te berekenen, gebruikt u de vergelijking vloeistofsecretiesnelheid = V / secretietijd, waarbij V het volume is van de uitgescheiden druppel berekend in stap 7.5, en de secretietijd verwijst naar de incubatietijd van de tubulus.

8. ISME-installatie

  1. Plaats micromanipulatoren aan weerszijden van de stereomicroscoop om het ISME-station in te stellen. Het chloreren van de zilverdraden kan worden bereikt door onder te dompelen in een oplossing van ijzerchloride en elke zilverdraad in elk van de micro-elektrodehouders te rijgen (of de draden op de coaxkabels te solderen, indien nodig). Herhaal deze stap wanneer de zilverdraden niet meer chloride zijn.
  2. Sluit de zilverdraden aan op een versterker, die zal lezen naar een data-acquisitiesysteem. Stel het systeem in en kalibreer het volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik in geval van verhoogde elektrische interferentie een goed geaarde Kooi van Faraday.

9. Voorbereiding van de micro-elektroden voor ISME en SIET

  1. Trek met behulp van een P-97 Flaming Brown pipettrekker ~ 5-6 ongefilamenteerde borosilicaatglascapillairen (buitendiameter 1,5 mm, binnendiameter 1,12 mm, lengte 100 mm) met een punt van 1-5 μm. Deze zullen worden gebruikt als de ionselectieve micro-elektroden. Voor SIET-micro-elektroden moet de resulterende elektrode een tipopening van ~ 5 μm hebben, gekenmerkt door een korte schacht.
  2. Plaats in een kap de micro-elektroden op een kookplaat (zet voorzichtig neer om de uiteinden van de elektroden niet te breken). Voeg dichlorodimethylsilaan toe in een glazen petrischaaltje van 15 cm en keer om over de elektroden op de kookplaat. Gebruik dichloordellomethylsilaan om de ionselectieve elektroden te silaniseren door een hydrofobe laag toe te voegen aan alle oppervlakken van de elektrode, waardoor deze de hydrofobe ionofoor37 kan behouden. Ongebruikte silanized elektroden kunnen een paar weken worden bewaard; daarom wordt deze stap om de paar weken uitgevoerd, of voor nieuw getrokken elektroden.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het hanteren van dichloordimethylsilaan – ontvlambaar, corrosief en giftig, zie VIB voor een veilige hantering.
    1. Draai de kookplaat op 350 °C en laat 75 minuten op zijn plaats staan. Gebruik een 1:2 verhouding van het aantal micro-elektroden tot volume (μL) van dichloordimethylsilaan om toe te voegen aan de glazen petrischaal. Voeg dus voor 10 micro-elektroden 20 μL dichloordimethylsilaan toe.
  3. Zet na 75 minuten de kookplaat uit. Nadat de elektroden en de kookplaat zijn afgekoeld, verwijdert u de glazen petrischaal en brengt u de elektroden (met een tang) over in een opbergdoos met vormklei. Zorg ervoor dat de punt van de elektrode naar boven wijst om schade te voorkomen.
  4. Om de referentie-elektroden voor ISME te maken, trekt u ~ 4-5 gefilamenteerde borosilicaatglas capillaire buizen (buitendiameter 1 mm, binnendiameter 0,58 mm, lengte 100 mm). Deze elektroden hoeven niet gesilaniseerd te worden. Label en bewaar in een vergelijkbare doos, om schade aan de punt te voorkomen.
  5. SIET-referentie-elektroden zijn gemaakt van standaard glazen haarvaten (buitendiameter 2 mm, binnendiameter 1,12 mm, lengte 102 mm). De haarvaten zijn gevuld met gesmolten 1 M KCl + 3% agar en moeten tot gebruik worden bewaard in een centrifugebuis van 50 ml met 1 M KCl (volledig ondergedompeld). Ze kunnen herhaaldelijk worden gebruikt totdat bubbels zich beginnen te vormen of als de agar breekt. Als er luchtruimte is, gooit u het glas weg en gebruikt u een nieuw glas om ervoor te zorgen dat het circuit compleet is.

10. De opvulspuiten voorbereiden

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om spuiten met fijne punt te maken om elektroden voor ISME op te vullen.

  1. Gebruik een spuit met een slippuntspuit van 1 ml met een wegwerpnaald. Gooi de naald weg en trek de spuit terug tot de 1 ml markering. Zet onder de dampkap de Bunsen-brander aan en verwarm de plastic punt van de spuit totdat deze begint te smelten. Knijp met een oude tang voorzichtig in de gesmolten spuitpunt en trek naar beneden om de punt uit te rekken.
  2. Knip met een schaar de gesmolten punt tot de gewenste lengte, waardoor de diameter klein genoeg blijft om in de elektroden te passen (zie diagram). Nadat de spuit is afgekoeld, test u de druk van de spuit met water om er zeker van te zijn dat er geen verstopping is. Maak er een voor elke vereiste opvuloplossing en label dienovereenkomstig (figuur 8).

11. Vullen van de ionselectieve en referentiemicro-elektrode voor ISME en SIET

OPMERKING: De micro-elektrode mag opnieuw worden gebruikt zolang deze nog werkt (kalibreer vóór elk experiment). Voor ISME kan deze stap worden uitgevoerd terwijl de MT's worden geïncubeerd in de Ramsay-test.

  1. Om een Na+-selectieve micro-elektrode te maken, gebruikt u de spuit van 1 ml die in stap 10 is gemaakt om de elektrode op te vullen met 100 mM NaCl. Zorg ervoor dat de opvuloplossing zich vult tot de punt van de elektrode. Als er luchtbellen verschijnen, veegt u voorzichtig met de micro-elektrode of verwijdert u de oplossing en vult u deze opnieuw. Dit moet worden gedaan onder een stereoscopische microscoop om beter te visualiseren.
  2. Dompel onder een stereoscopische microscoop een pipetpunt van 10 μL in de Na+-selectieve ionofooroplossing. Lijn de elektrode loodrecht op de pipet, plaats een gehandschoende vinger over de onderkant van de punt om druk te creëren en een kleine druppel ionofoor te verdrijven. Kijk onder hoog objectief van een microscoop, raak voorzichtig de druppel ionofoor aan op de micro-elektrodepunt, vermijd het breken van de punt. Normaal gesproken worden micro-elektroden naar voren gevuld met een ionofoorcocktailkolomlengte van 150-300 μm, totdat de grens tussen ionofoor en opvuloplossing vlak is.
    LET OP: Deze ionofoor is giftig, zie VIB voor veilig hanteren.
  3. Vul in een klein bekerglas halverwege met 100 mM NaCl en plaats wat boetseerklei aan de binnenkant aan de bovenkant van het bekerglas. Nadat de Na+ ionofoor is opgenomen, plaatst u de elektrodepunt naar beneden op de wand van het bekerglas, laat u de punt binnen de 100 mM NaCl zitten en houdt u ISME in het bekerglas totdat deze klaar is voor gebruik.
  4. Om de ISME-referentie-elektrode te maken, vult u een elektrode met 500 mM KCl om ervoor te zorgen dat de oplossing tot aan de punt wordt gevuld (volg hetzelfde protocol als hierboven). Bewaar de KCl in een bekerglas.

12. Kalibreren van elektroden voor ISME

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd vlak voordat metingen van de uitgescheiden vloeistof worden uitgevoerd (~ 10-15 minuten eerder). Kalibraties moeten elke ~ 5-6 metingen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de helling consistent is.

  1. Coat de elektrodepunten met een oplossing van ~ 3,5% (w / v) polyvinylchloride opgelost in tetrahydrofuraan, om verplaatsing van de ionofoor te voorkomen wanneer ondergedompeld in paraffineolie.
    LET OP: Dit is ontvlambaar, zie VIB voor veilig hanteren.
  2. Om de Na+ elektrode te kalibreren, plaatst u 10 μL druppels van de volgende NaCl standaardconcentraties op de rand van de Ramsay schotel met de geïncubeerde MT's: 200 mM NaCl en 20 mM + 180 mM LiCl. Plaats de standaard druppels ~ 2 cm uit elkaar, met de hogere concentratie bovenop.
  3. Plaats zowel de referentie-elektrode als de ionselectieve elektrode over de chloridedraden en bevestig ze stevig met behulp van elektrodehouders die aan micromanipulatoren zijn bevestigd. Navigeer beide elektroden naar de 200 mM NaCl-druppel met behulp van de micromanipulatoren en zorg ervoor dat de elektrodepunten de bodem van de schotel niet raken. Schakel de elektrometer in om de opname te starten en laat de meting stabiliseren.
  4. Neem de meting op en ga verder met de volgende standaard (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Bereken de helling en als de elektrodemeting stabiel is en de helling binnen bereik is, gaat u verder met het gebruik van de elektrode voor de uitgescheiden druppelmetingen. Als de meting onstabiel is, geen goede registratie of helling geeft, of een tijdje nodig heeft om te balanceren, bereidt u een nieuwe ionselectieve elektrode voor of breekt u de punt van de referentie-elektrode door een weefsel over de punt te laten lopen. De helling voor Na + moet ~ 58-60 mV38 zijn, hoewel een acceptabel bereik 50-60 mV is.

13. ISME-registraties en -berekeningen

  1. Na metingen van de vloeistofsecretiesnelheid (zie stap 7.7) verplaatst u zowel de referentie- als de ionselectieve elektrode voorzichtig in de uitgescheiden druppel met behulp van de micromanipulatoren. Schakel de opname in en laat de meting stabiliseren en de waarde opnemen. Herhaal deze stap voor de andere druppels (herhaal kalibratiemetingen om de ~5-6 metingen).
  2. Kationconcentraties worden berekend met behulp van de eerder beschreven vergelijking22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, waarbij [C] de concentratie in mmol L-1 is van de ijkoplossing die wordt gebruikt om het ISME te kalibreren, ΔV de spanningsverandering is tussen de spanning die wordt geregistreerd door de uitgescheiden vloeistofdruppel en de spanning van dezelfde ijkoplossing; en m is het spanningsverschil tussen de twee standaardkalibraties, dat ook de helling is.

14. SIET instellen

OPMERKING: Het SIET-systeem is eerder beschreven27,39. Om achtergrondgeluid te verminderen, is een kooi van Faraday geïnstalleerd rond de lichtmicroscoop en het hoofdpodium. Experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, gebruiken de volgende instellingen op de Automated Scanning Electrode Technique (ASET) -software 2.0: een wachttijd van 4 seconden om ionengradiënten volledig te laten herstellen na micro-elektrodebewegingen, waarbij de spanning gedurende 0,5 s na de wachttijd wordt geregistreerd, een excursieafstand van 100 μm en drie herhalingen voor elke opname. Bepaalde instellingen kunnen indien nodig door de gebruiker worden gewijzigd in ASET.

  1. Schakel de IPA-2 ionen/polarografische versterker, de lichtmicroscoop (met een aangesloten videocamera) en de computer(s) die zijn aangesloten op elk van deze computers met ASET en cellSens in.
  2. Bereid micro-elektroden en referentie-elektroden voor die worden beschreven in de stappen 9.1-9.3, 9.5, 10 en 11.1-11.3. De ionselectieve micro-elektrode bevat Na+ ionofoor met 100 mM NaCl-opvulling en de referentie-elektrode (met de agarbruggen) wordt altijd gevuld met 3 M KCl.
  3. Plaats Na+-selectieve micro-elektrode op de houder bestaande uit een zilverchloride (AgCl) draad en bevestig deze in vrouwelijke connector jack. Vul met behulp van een spuit de referentie-elektrodehouder met verse 3 M KCl (kan vóór de experimenteerdag worden gemaakt en bij RT worden bewaard).
    OPMERKING: Na experimenten, was de referentie-elektrodehouder uit met ddH2O.
  4. Verwijder één referentie-elektrode uit het bekerglas met alle referentie-elektroden ondergedompeld in 3 M KCl, plaats één vinger aan het ene uiteinde en kantel het glazen capillair naar deze vinger om te voorkomen dat de agar eruit valt. Plaats voorzichtig het ene uiteinde in de houder en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Als er een bel is, verwijdert u de referentie-elektrode, vult u de houder opnieuw met meer dan 3 M KCl en herhaalt u dit. Plaats de elektrodehouder in de vrouwelijke connectoraansluiting.

15. Kalibreren van elektroden voor SIET

  1. Gebruik voor Na+ metingen een 150 mM NaCl en 15 mM NaCl + 135 mM LiCl oplossingen24. Er zou een 10-voudig verschil in Na+ concentraties tussen de twee oplossingen moeten zijn, met inbegrip van het bereik van Na+ (20 mM) niveaus in de zoutoplossing (tabel 2).
  2. Bewaar kalibratieoplossingen bij RT in een centrifugebuis van 50 ml en aliquot in een petrischaaltje bij het uitvoeren van het experiment. Deze aliquot wordt aan het einde van de dag weggegooid. Als er aanwijzingen zijn voor verontreiniging in de voorraadoplossingen, gooi ze dan weg en maak nieuwe oplossingen.
  3. Om te kalibreren, neemt u de twee kalibratieoplossingen (stap 15.1) op in afzonderlijke petrischalen van 35 mm en plaatst u deze op het microscoopstadium. Gebruik de handmatige instelknoppen die de stappenmotoren bedienen met "uitschakelen" geselecteerd op de motion control-eenheid van de computer, zorg ervoor dat de micro-elektrodepunt in de kalibratieoplossing wordt geplaatst. Dompel de punt niet te ver onder, want deze kan breken. Als de punt breekt, bereidt u een nieuwe ionselectieve micro-elektrode voor en kalibreert u opnieuw.
    1. Open de ASET-software op de computer die op de versterker is aangesloten. Open Kalibratie-instellingen. Selecteer Nernst Slope voor het kalibratietype, stel het monster in op 3 seconden en voer de concentraties van de kalibratieoplossingen in. Voer bijvoorbeeld voor Na+ -metingen 150 mM in oplossing 1 in, plaats de Na+-selectieve micro-elektrodepunt en referentie-elektrode in deze kalibratieoplossing. De spanningsmeting op de versterker moet stabiel zijn. Klik op Oplossing 1, wacht tot de spanning (in mV) is geregistreerd. Plaats vervolgens de micro-elektrode en de referentie-elektrode in de 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-oplossing, voer 15 mM in oplossing 2 in en klik op Oplossing 2 om de spanningsmeting te verkrijgen. De helling is het verschil tussen deze twee spanningen, berekend in deze instellingen. Klik na de kalibratie op OK.
    2. Hellingen voor Na+-selectieve micro-elektroden voor een tienvoudige verandering in ionenconcentratie moeten ongeveer 59,0 ± 1,624 zijn. Als de Nernst-helling sterk afwijkt van dit bereik, bereid dan een nieuwe micro-elektrode voor of aliquot nieuwe normen (omdat ze besmet kunnen zijn). Kalibratie is vereist vóór elke 2-3 monsters, afhankelijk van de spanningsstabiliteit. Als de spanning onstabiel wordt en begint te fluctueren, bereid dan een nieuwe ionselectieve micro-elektrode voor.

16. SIET metingen

OPMERKING: De motorschakelaar op de Computer Motion Control-eenheid moet altijd op Uitschakelen worden gezet, behalve wanneer u de elektrode manipuleert met behulp van computertoetsen via ASET of tijdens meetopnamen (op welk punt de toets moet worden omgeschakeld naar Inschakelen).

  1. Ontleed na de kalibratie het orgel (zie stap 6.6). Plaats de poly-L-lysineschaal met het ontlede monster op het microscoopstadium en plaats de punt van de referentie-elektrode in de zoutoplossing. Dompel de punt van de ionselectieve micro-elektrode onder in de zoutoplossing en zorg ervoor dat de punt niet breekt.
  2. Gebruik de handmatige instelknoppen om de micro-elektrodepositie aan te passen terwijl u onder de lichtmicroscoop kijkt. Pas de verticale positie van de micro-elektrode zodanig aan dat de punt zich op hetzelfde vlak bevindt als het orgaan of weefsel. Eenmaal op de gewenste positie draait u de motorschakelaar op Inschakelen. Op dit punt kunnen de stappenmotoren alleen worden bediend met behulp van de computersoftware.
  3. Gebruik de pijltjestoetsen van de computer om de micro-elektrode horizontaal te verplaatsen naar een positie op 3 mm afstand van het weefsel om achtergrondopnamen te meten. Voeg notities in door op F2 te drukken. Als u klaar bent, begint u met opnemen (door op F5 te drukken). Verkrijg vijf metingen van achtergrondactiviteit. De gemiddelde achtergrondspanningsactiviteit voor elk monster wordt afgetrokken van de spanningsgradiënten die langs het weefsel voor hetzelfde monster zijn gemeten.
  4. Beweeg de micro-elektrodepunt terug dicht bij het weefsel en zorg ervoor dat u het orgaan niet doorboort. Verminder de keyhitgevoeligheid om de micro-elektrodepunt 2 μm direct naar rechts te plaatsen, loodrecht op het weefsel. Verkrijg drie opnames op elke plaats langs het rectale pad om de plaats van de grootste ionenactiviteit te identificeren. Verkrijg basislijn zoutmetingen op de site met de grootste activiteit (de "hotspot" -site).
  5. Zet de motor op Uitschakelen en voeg de juiste behandeling toe aan de schotel om de uiteindelijke gewenste dosis te verkrijgen. Maak na de toepassing een nieuwe notitie (d.w.z. behandelingsnaam en dosis), schakel de motor terug naar Inschakelen en maak spanningsopnamen met F5. Als het doel is om veranderingen in de loop van de tijd waar te nemen, blijf dan metingen uitvoeren met specifieke tijdsintervallen. Met behulp van de SIET kunnen meerdere protocollen worden gemaakt voor specifieke toepassingen, afhankelijk van het doel van de onderzoeker.
  6. Kijk hoe de ASET-software de spanning op de plaats langs het weefsel registreert en deze aftrekt van de spanning op een excursieafstand (figuur 7) van 100 μm afstand van het weefsel. Aangezien de eerste opname bij het weefsel wordt gedaan, geeft een positief spanningsverschil aan dat de spanning hoger is op het epitheel (weefsel) (figuur 7A) dan weg van het epitheel (figuur 7B), en dus wordt het kation geabsorbeerd. Een negatieve spanningsgradiënt is indicatief voor kationsecretie.
  7. Verkrijg opnieuw achtergrondopnamen na de behandeling (op 3 mm afstand) en gebruik deze bij het berekenen van de ionenflux na de behandeling. Maak één set achtergrondopnamen in "baseline" en één set na de behandeling. Schakel de motor in op Uitschakelen wanneer de micro-elektrode niet wordt aangepast met de computertoetsen of wanneer de spanning niet wordt geregistreerd. Exporteer de gegevens naar een tekstbestand en open deze met Excel om alle berekeningen uit te voeren.
  8. Bereken de ionenflux met behulp van eerder beschreven vergelijkingen24,26. De netto ionenflux voor elke behandeling kan worden uitgedrukt als een absolute verandering ten opzichte van de basislijn ionenfluxmetingen. Om de betekenis van de resultaten te verifiëren, kan een voertuigcontrole (d.w.z. alleen zoutoplossing aan de schaal toevoegen in plaats van een behandeling) worden gebruikt. Veranderingen in ionentransport na de hormonale behandeling moeten worden beoordeeld in relatie tot eventuele veranderingen in reactie op deze controle.

17. Hindgut contractie assays

  1. Vul een van de putjes in de schaal beschreven in stap 4.1 met een bekend volume Aedes zoutoplossing (stap 5.1). Breng na de dissectie (stap 6.7) het ontleedde achterbeen dat aan het middengut is bevestigd voorzichtig over naar de put in de andere schaal, zorg ervoor dat u het onderzochte orgaan (ileum) niet knijpt. Dompel de darm onder in de zoutoplossing in de put en plaats Minutien-pinnen in het middenbeen en het rectum. Door dit te doen, mag het ileum niet onder spanning staan en moeten spontane weeën, afkomstig van de pylorische klep bij het voorste ileum, worden waargenomen.
  2. Sluit een videocamera aan op een stereoscopische microscoop en neem video's op met behulp van video-opnamesoftware (bijvoorbeeld Luminera's INFINITY CAPTURE). Leg de schaal met het ontleedde orgaan onder de microscoop en noteer gedurende 2 minuten. Dit is de voorwaarde "Basislijn".
  3. Voeg een bekend volume van 1X Aedes zoutoplossing (stap 5.1) toe aan de put om rekening te houden met eventuele veranderingen in de ileale beweeglijkheid bij toenemende volume in de put. Wacht 1 minuut na het aanbrengen en neem vervolgens opnieuw op gedurende 2 minuten. Dit is de "zoutoplossing" -voorwaarde.
  4. Voeg een bekend behandelingsvolume toe (van een 10x voorraadconcentratie om de gewenste dosis in de put te verkrijgen). Wacht 1 minuut na het aanbrengen en neem vervolgens opnieuw op gedurende 2 minuten. Dit zal de "behandeling" -voorwaarde zijn.
  5. Sla alle video's op en converteer ze naar MP4. Om te analyseren, tel het aantal samentrekkingen in de intervallen van 2 minuten (gedefinieerd als een peristaltische golf die begint bij de pylorische klep en zich uitstrekt over het hele ileum). Deel dit getal door 2 minuten om de krimpsnelheid te verkrijgen. Ook andere parameters kunnen worden beoordeeld, zoals contractie of ontspanningsduur. Na het verzamelen van onbewerkte gegevens drukt u elke parameter uit ten opzichte van de gegevens voor "basislijn"-omstandigheden voor elk monster. Plot de vouwverandering voor de "zoutoplossing" en "behandeling" allemaal ten opzichte van de "basislijn".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toepassing van DH31 tegen niet-gestimuleerde MT's resulteert in een significante toename van de vochtsecretiesnelheid, wat de rol ervan als diuretisch hormoon bij Aedes-muggen bevestigt (figuur 1A). Wanneer tubuli worden behandeld met AedaeCAPA-1, wordt een vermindering van de secretiesnelheid waargenomen in DH31-gestimuleerde MT's. Figuur 1B toont het gebruik van ionselectieve elektroden om Na + -concentraties ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het innemen van een bloedmaaltijd worden hematofagusinsecten geconfronteerd met de uitdaging van overtollige opgeloste stoffen en water in hun hemolymfe2. Om dit het hoofd te bieden, hebben ze een gespecialiseerd uitscheidingssysteem, dat strak wordt gecontroleerd door hormonale factoren, waardoor de insecten snel postprandidese kunnen initiëren. De Ramsay-test en het gebruik van ionselectieve micro-elektroden maken het mogelijk om de vloeistofsecretiesnelheden te meten, samen met ionenconcent...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants aan AD en J-PP. AL en FS ontvingen NSERC CGS-M awards ter ondersteuning van hun graduate onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuitenFisher Scientific14955456
35 mm Petri schotelsCorning Falcon (Fisher Scientific)C351008
Borosilicaat glas capillaire filament buizen
(OD 1 mm, ID 0,58 mm, lengte 100 mm)		World Precision Instruments1B100F-4gebruikt voor ISME referentie elektroden
Borosilicaat glas capillaire filament buizen
(OD 2 mm, ID 1,12 mm, lengte 102 mm)		World Precision Instruments1B200F-4gebruikt voor SIET referentie elektroden
Borosilicaat glas capillaire niet-filament buizen
(OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, lengte 100 mm)		World Precision InstrumentsTW150-4gebruikt voor ISME en SIET elektroden
CO2 padDiamedGEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine oplossingSigma-Aldrich41716
Faraday kooiAangepastKan worden vervaardigd door lokale machine winkel
Ferric chlorideSigma-Aldrich157740
Pincetten (Dumont #5)Fine Science Tools91150-20
Glazen Petri schotelFisher Scientific08-748A
Gehydrateerde minerale olieFisher Scientific8042-47-5Specifiek merk is niet belangrijk
INFINITY1-2CB videocameraLumineraINFINITY1-2CB
Micromanipulatoren (links en rechts handig)World Precision InstrumentsMMJL en MMJRSpecifiek merk is niet belangrijk zolang hoge kwaliteit manipulator
Minerale Olie, LichtFisher Scientific0121-4
Minutienpennen (0,1 mm roestvrij staal)Fine Science Tools26002-10
Niet-hardende modelkleiSargent ArtSpecifiek merk is niet belangrijk
Olympus lichtmicroscoop (VOOR SIET)Olympusaangepast systeem
Plastiek Pasteur (overdracht) pijpjeFisher Scientific13-711-7M
Poly-L-lysine oplossing (0,1 mg/mL)Sigma-AldrichA-005-M84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC)Sigma-Aldrich81395
ScalpelmesFine Science Tools10050-00
ScalpelhandgreepFine Science Tools10053-09
Schneider's Drosophila mediumSigma-AldrichS0146
SIET systeemApplicable Electronicsaangepast systeemDetails beschikbaar op: http://www.applicableelectronics.com/overview
ZilverdraadWorld Precision InstrumentsAGW1010
Natrium ionofoor II cocktail AFluka99357
Standaard polystyreen Petri (kweek) schotelsFisherbrandFB012921Elke maat zou werken, maar 60 mm schotels zijn goed voor zowel dissecties als assay
Stereomicroscoop met oculaire micrometerNikonSMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette pullerSutter InstrumentsFGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Chemical CompanyNC9285739
TetrahydrofuranSigma-Aldrich401757
VWR geavanceerde hotplate roerder - aluminiumVWR9578Specifiek merk is niet belangrijk

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
  2. Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
  3. Bradley, T. J. Physiology of osmoregulation in mosquitoes. Annual Review of Entomology. 32, 439-462 (1987).
  4. Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
  5. Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
  6. Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
  7. Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
  8. Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
  9. Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795(2015).
  10. Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
  11. Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154(2015).
  12. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800(2015).
  13. O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
  14. Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
  15. Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
  16. Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
  17. Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
  18. Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
  19. Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
  20. O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
  21. Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  22. Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
  23. Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
  24. Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
  25. Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
  26. Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386(2014).
  27. Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
  28. Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490(2020).
  29. Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
  30. Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
  31. Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
  32. Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98(2012).
  33. Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
  34. Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
  35. Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
  36. Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
  37. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144(2015).
  38. Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
  39. Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
  40. Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755(2020).
  41. Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
  42. Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
  43. Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
  44. D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997(2020).
  45. Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
  46. Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
  47. O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
  48. Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuropeptide regulatieMalpighische buisjesRamsay assayionselectieve micro elektrodenscanning ion selectieve elektrodetechniekassays voor contractie van de hinderdarmmeting van vloeistofsecretieionentransportanalyseAedes aegypti

Gerelateerde artikelen