Dit protocol introduceert een methode om een steiger te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Het protocol omvat decellularisatie- en recellularisatieprocessen om de biologische beschikbaarheid te bevestigen. Decellularisatie wordt uitgevoerd met Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van gedecellulariseerde niersteigers bij ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tissue engineering is een geavanceerde discipline in de biogeneeskunde. Celkweektechnieken kunnen worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Steigers zijn nodig om de generatie van driedimensionale organen of weefsels te vergemakkelijken met behulp van gedifferentieerde stamcellen in vivo. In dit rapport beschrijven we een nieuwe methode voor het ontwikkelen van gevasculariseerde steigers met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Acht weken oude Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in deze studie, en heparine werd geïnjecteerd in het hart om de stroom in de niervaten te vergemakkelijken, waardoor heparine in de niervaten kon doordringen. De buikholte werd geopend en de linkernier werd verzameld. De verzamelde nieren werden gedurende 9 uur geperfuseerd met behulp van detergentia, zoals Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat, om het weefsel te decellulariseren. Gedecellulariseerde niersteigers werden vervolgens voorzichtig gewassen met 1% penicilline/streptomycine en heparine om cellulair puin en chemische residuen te verwijderen. Transplantatie van stamcellen met de gedecellulariseerde vasculaire steigers zal naar verwachting de generatie van nieuwe organen vergemakkelijken. Zo kunnen de gevasculariseerde steigers in de toekomst een basis vormen voor weefseltechnologie van orgaantransplantaten.
Inleiding
Celkweektechnieken worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Allogene orgaantransplantatie is momenteel de meest voorkomende behandeling voor onomkeerbare orgaanschade; deze aanpak vereist echter het gebruik van immunosuppressie om afstoting van het getransplanteerde orgaan te voorkomen. Bovendien kan, ondanks de vooruitgang in de transplantatieimmunologie, 20% van de transplantatieontvangers binnen 5 jaar acute afstoting ervaren en binnen 10 jaar na transplantatie kan 40% van de ontvangers hun getransplanteerde transplantaat verliezen of sterven1.
Vooruitgang in weefseltechnologietechnologieën heeft geleid tot een nieuw paradigma voor transplantatie van nieuwe organen zonder immuunafstoting met behulp van gedifferentieerde stamcellen. Na stamceldifferentiatie is een steiger nodig, een synthetische extracellulaire matrix genaamd, om de generatie van driedimensionale organen te vergemakkelijken en het nieuwe weefsel in staat te stellen te gedijen in de ontvanger. Steigers van gedecellulariseerde inheemse organen hebben voordelen, waaronder een effectievere omgeving voor de vestiging van cellen en verbetering van de proliferatie van stamcellen, hoewel deze mechanismen niet volledig zijn opgehelderd2. In het bijzonder is de nier een geschikt orgaan voor steigergeneratie omdat het een overvloedige circulatie heeft en een niche voor stamcelinrichting. Bovendien is het vanwege de complexe structuur van de nier moeilijk om nieren kunstmatig te regenereren voor orgaantransplantatie.
In dit rapport introduceren we een methode om gevasculariseerde steigers te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde organen in een rattenmodel om toekomstige dierstudies voor weefseltechnologiedoeleinden te vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de administratie van de Pusan National University of Medicine en werd uitgevoerd in overeenstemming met ethische richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren. (certificaatnr. 2017-119). Voorafgaand aan dierproeven moet een institutionele goedkeuring worden verkregen.
OPMERKING: Alle chirurgische en verdovingsinstrumenten/apparatuur en reagentia die worden aanbevolen voor een succesvolle chirurgische presentatie en beeldvorming van buikorganen zijn beschreven in tabel 1.
1. Voorbereidingsprocedures voor het oogsten van rattennieren
- Ter voorbereiding op de operatie plaatst u 8 weken oude Sprague-Dawley ratten (met een gewicht van 200-250 g) op een warmhoudkussen. Plaats een rectale thermometersonde in het rectum om de kerntemperatuur te controleren.
- Verdoof de rat met een mengsel van isofluraangas van 5% (inductie: 5%, onderhoud: 3%).
- Om de operatie te starten, plaatst u de rat in een liggende positie na toediening van anesthesie. Monteer de vier ledematen van de rat op de operatietafel met tape.
- Scheer en reinig de buik van de donorrat met kiemdodende zeep. Breng 2% betadine aan gedurende ten minste 1-2 minuten en veeg af met een 70% ethanoloplossing. Herhaal deze reeks drie keer.
- Bedek het operatiegebied met een steriel fenestrated laken.
- Maak een verticale abdominale incisie en stel de linkernier, ureter, abdominale aorta en inferieure vena cava bloot.
- Visualiseer en ontleed de linkernier, ureter, abdominale aorta en inferieure vena cava net voordat je de pedikel snijdt.
2. Transcardiale perfusie
- Bereid voor de operatie de perfusieoplossing voor.
- Maak 50 ml perfusieoplossing per rat.
- Meng 1x PBS met ongeveer 10 U/ml heparine (1 25 kU flacon maakt 2,5 L PBS+Hep).
- Meng gelijke volumes van 8% paraformaldehyde met 1x PBS om de 4% PFA/1xPBS oplossing te maken.
OPMERKING: 8% PFA gemaakt in water kan maximaal 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. 4% PFA verdund in PBS is echter slechts 1 week stabiel bij 4 °C. Maak de verdunning vers.
- Strek de verticale abdominale incisie cranially. Zorg ervoor dat u de schaar bij het snijden van de organen wegtrekt om beschadiging van de interne organen te voorkomen.
- Ga verder met de incisie door de ribbenkast en snijd vervolgens door het middenrif door het borstbeen op te tillen.
- Speld de losse flap van de huid uit de weg en bevrijd het hart door bindweefsel met de tang te scheuren.
LET OP: Gebruik de schaar niet om het hart te bevrijden en dit kan leiden tot ongewenste bloedingen. - Open de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en zorg ervoor dat de lijn stroomt voordat u de naald in de linkerventrikel plaatst. Houd het hart voorzichtig vast met een stompe tang en gebruik een hemostase om de naald te bedienen. De naald mag niet meer dan 1/4 inch worden ingebracht.
OPMERKING: Inbrengen groter dan 1/4 inch kan leiden tot perforatie aan de andere kant van het weefsel. - Terwijl u het hart ondersteunt met de naald en hemostase, zoekt u het juiste atrium en knipt u er doorheen met een iridectomieschaar. Rust de hemostase op het lichaam van de rat en zorg ervoor dat de naald nog steeds in het hart is geplaatst.
OPMERKING: Als de snede voldoende is, moet er bloed in de lichaamsholte zijn, omdat de druk van de PBS die in de rat stroomt, wordt verlicht. - Maak de voorpoten en de huidflap voorzichtig los.
- Blijf PBS 4 minuten of langer perfusing als er nog bloed zichtbaar is in de nieren en lever.
3. Nieroogst en decellularisatie
- Oogst de linker nier met de abdominale aorta en inferieure vena cava.
- Ligateer de ureter, thoracale aorta, superieure vena cava en takken van de abdominale aorta.
- Houd het orgel gehydrateerd in Dulbecco's PBS (DPBS) in een Petrischaal van 10 cm.
- Cannulate de abdominale aorta en inferieure vena cava met een 23 Gauge katheter. Om restbloed te verwijderen, sluit u de canule aan met een peristaltische pomp en wast u deze gedurende 90 minuten met DPBS (500 ml) en 16 U/ml heparine bij een snelheid van 5 tpm bij 37 °C.
- Om de nier te decellulariseren, perfuseert u de nier met 1% Triton X-100 (1 L) gedurende 3 uur en vervolgens met 0,75% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing (2 L) gedurende 6 uur bij een constante druk van 40 mmHg.
OPMERKING: De nier wordt na 8 uur transparant. - Om de resterende SDS te verwijderen, perfuseert u het monster met 1% penicilline in gedestilleerd water (6 L) gedurende 18 uur ('s nachts) en vervolgens met steriel DPBS (500 ml) en 16 U/ml heparine gedurende 90 minuten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De grove morfologie van rattennieren was donkerrood (figuur 1A). Na decellularisatie werd de nier bleek en doorschijnend (figuur 1D). Resterend genomisch DNA werd beoordeeld met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant, in gedecellulariseerde niersteigers en vergeleken met dat in inheemse nieren (controle). Kwantitatieve analyse bevestigde dat weefsel genomisch DNA bijna werd geëlimineerd na decellularisatie. Uit 14 gevallen was de gemiddelde ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende protocollen zijn gebruikt voor decellularisatie van organen en andere weefsels. Het optimale decellularisatieprotocol moet de driedimensionale architectuur van de extracellulaire matrix (ECM) behouden. Over het algemeen bestaan dergelijke protocollen uit het lyseren van het celmembraan door fysieke verwerking of ionische oplossingen, het scheiden van het cytoplasma en de kern van het ECM door enzymatische verwerking of detergentia, en vervolgens het verwijderen van cellulair puin uit het weefsel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een Biomedical Research Institute Grant van pusan National University Hospital.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 cc-spuit (injecteer sondes en voertuig oplossingen | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon voor vaat anastomose | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch gidsnaald (voor vaatkatheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incisiesluiting rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incisiesluiting rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 zijden spoel vaat toegang/ligatie in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incisiesluiting muis | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incisiesluiting muis | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 zijden spoel vaat toegang/ligatie in muis | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fijne schaar om fascia/bindweefsel te snijden | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey naaldhouder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat voor ratten: spierklem om bloeden te minimaliseren bij het snijden | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyetheen 50 slang, katheterslang 100 ft | Braintree Scientific | .023" ×.038" | |
| Schwartz microserrefine vaatklemmen | Fine Science Tools | 18052-01 (recht) | |
| 18052-03 (gebogen) | |||
| Chirurgische schaar om huid te snijden | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Veer schaar voor arteriotomie | Fine Science Tools | 15003-08 |
Referenties
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
