Methodenartikel

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 maart 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genereren van menselijke cardiomyocyten (CMs), cardiale fibroblasten (CF's) en endotheelcellen (EC's) uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) heeft een unieke kans geboden om de complexe wisselwerking tussen verschillende cardiovasculaire celtypen te bestuderen die weefselontwikkeling en ziekte stimuleert. Op het gebied van hartweefselmodellen gebruiken verschillende geavanceerde driedimensionale (3D) benaderingen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) om fysiologische relevantie en inheemse weefselomgeving na te bootsen met een combinatie van extracellulaire matrices en crosslinkers. Deze systemen zijn echter complex om te fabriceren zonder microfabricage-expertise en vereisen enkele weken om zichzelf te assembleren. Het belangrijkste is dat veel van deze systemen geen vasculaire cellen en cardiale fibroblasten hebben die meer dan 60% van de niet-myocyten in het menselijk hart uitmaken. Hier beschrijven we de afleiding van alle drie de hartceltypen van iPSC's om cardiale microtissues te fabriceren. Deze gemakkelijke replica molding techniek maakt cardiale microtissue cultuur in standaard multi-well cel kweekplaten gedurende enkele weken mogelijk. Het platform biedt door de gebruiker gedefinieerde controle over microtissuegroottes op basis van de initiële zaaidichtheid en heeft minder dan 3 dagen nodig voor zelfassemblage om waarneembare cardiale microtissue-contracties te bereiken. Bovendien kunnen de cardiale microtissues gemakkelijk worden verteerd met behoud van een hoge cel levensvatbaarheid voor eencellige ondervraging met behulp van flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq). We stellen ons voor dat dit in vitro model van cardiale microtissues zal helpen bij het versnellen van validatiestudies in medicijnontdekking en ziektemodellering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geneesmiddelenontdekking en ziektemodellering op het gebied van cardiovasculair onderzoek worden geconfronteerd met verschillende uitdagingen als gevolg van een gebrek aan klinisch relevante monsters en ontoereikende translationele hulpmiddelen1. Zeer complexe preklinische modellen of overgesimplificeerde in vitro eencellige modellen vertonen geen pathofysiologische omstandigheden op een reproduceerbare manier. Daarom zijn verschillende geminiaturiseerde weefselmanipulatieplatforms geëvolueerd om de kloof te helpen overbruggen, met als doel een balans te bereiken tussen gebruiksgemak op een manier met hoge doorvoer en getrouwe recapitulatie van weefselfunctie2,3. Met de komst van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) kunnen tissue engineering-instrumenten worden toegepast op patiëntspecifieke cellen met of zonder onderliggende cardiovasculaire hartziekte om onderzoeksvragen te beantwoorden4,5,6. Dergelijke weefselmanipulatiemodellen met cellulaire samenstelling vergelijkbaar met het hartweefsel kunnen worden gebruikt bij de ontwikkeling van geneesmiddelen om te testen op cardiotoxiciteit en disfunctie veroorzaakt door pathologische gedragsveranderingen van een of meerdere celtypen.

Zelfgeassembleerde microtissues of organoïden afgeleid van menselijke iPSC's zijn driedimensionale (3D) structuren die miniatuur weefselachtige assemblages zijn die functionele overeenkomsten vertonen met hun in vivo tegenhangers. Er zijn verschillende benaderingen die de vorming van organoïden in situ mogelijk maken via gerichte differentiatie van iPSC's of door de vorming van embryoïde lichamen4. De resulterende organoïden zijn een onmisbaar hulpmiddel om morfogenetische processen te bestuderen die de organogenese aansturen. De aanwezigheid van een verscheidenheid aan celpopulaties en verschillen in zelforganisatie kunnen echter leiden tot variabiliteit in uitkomsten tussen verschillende organoïden5. Als alternatief zijn vooraf gedifferentieerde cellen die zelf geassembleerd zijn tot microtissues met weefselspecifieke celtypen om lokale cel-celinteracties te bestuderen uitstekende modellen, waarbij het mogelijk is om de zelfgeassembleerde componenten te isoleren. Met name in menselijk cardiaal onderzoek is de ontwikkeling van 3D-cardiale microtissues met meercellige componenten een uitdaging gebleken wanneer cellen zijn afgeleid van verschillende patiëntenlijnen of commerciële bronnen.

Om ons mechanistisch begrip van celgedrag in een fysiologisch relevant, gepersonaliseerd, in vitro model te verbeteren, moeten idealiter alle componentceltypen worden afgeleid van dezelfde patiëntenlijn. In de context van een menselijk hart zou een echt representatief cardiaal in vitro model de overspraak tussen overheersende celtypen vastleggen, namelijk cardiomyocyten (CMs), endotheelcellen (EC's) en cardiale fibroblasten (CF's)6,7. De getrouwe recapitulatie van een myocardium vereist niet alleen biofysische rek en elektrofysiologische stimulatie, maar ook cel-celsignalering die ontstaat uit ondersteunende celtypen zoals EC's en CF's8. CF's zijn betrokken bij de synthese van extracellulaire matrix en het behoud van de weefselstructuur; en in pathologische toestand kunnen CF's fibrose induceren en de elektrische geleiding in de CM's veranderen9. Evenzo kunnen EC's contractiele eigenschappen van CM's reguleren door paracriene signalering en het leveren van vitale metabolische eisen10. Daarom is er behoefte aan menselijke cardiale microtissues die zijn samengesteld uit alle drie de belangrijkste celtypen om fysiologisch relevante high-throughput experimenten uit te voeren.

Hier beschrijven we een bottom-up benadering in de fabricage van cardiale microtissues door afleiding van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs), iPSC-afgeleide endotheelcellen (iPSC-EC's) en iPSC-afgeleide cardiale fibroblasten (iPSC-CFs) en hun 3D-cultuur in uniforme cardiale microtissue-arrays. Deze gemakkelijke methode voor het genereren van spontaan kloppende cardiale microtissues kan worden gebruikt voor ziektemodellering en het snel testen van geneesmiddelen voor functioneel en mechanistisch begrip van hartfysiologie. Bovendien kunnen dergelijke meercellige cardiale microtissueplatforms worden benut met genoombewerkingstechnieken om de progressie van hartaandoeningen in de loop van de tijd na te bootsen onder chronische of acute kweekomstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Medium, reagens, kweekplaatvoorbereiding

  1. Celwasoplossing voor celkweek: Gebruik 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium.
  2. Cardiomyocytendifferentiatiemedia
    1. Bereid differentiatie Medium # 1 voor door 10 ml supplement (50x B27 plus insuline) toe te voegen aan 500 ml cardiomyocyten basaal medium (RPMI 1640).
    2. Bereid differentiatie Medium # 2 door 10 ml supplement (50x B27 minus insuline) toe te voegen aan 500 ml cardiomyocyten basaal medium (RPMI 1640).
    3. Bereid zuiveringsmedium # 3 voor door supplement (50x B27 plus insuline) toe te voegen aan 500 ml cardiomyocyten basaal medium (RPMI 1640) minus glucose.
  3. Endotheel groeimedia en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) reagentia
    1. Bereid endotheel groeimedium (BAVA) voor met in de handel verkrijgbare endotheliale cel groeimedium supplement kit.
    2. Bereid de celscheidingssorteerbufferoplossing door de stamoplossing van runderserumalbumine (BSA) te verdunnen tot 1:20 met spoeloplossing.
  4. Cardiaal fibroblast differentiatiemedium: Bereid cardiale fibroblastdifferentiatiemedium voor met fibroblast basaal medium (DMEM-hoge glucose) en Serum-Free Fibroblast Life Factors kit.
  5. Cardiale microtissue fabricage- en onderhoudsmedium: Bereid gefilterd medium met cardiomyocyten basaal medium (RPMI 1640) met supplement (50x B27 plus insuline) en EGM in 70/30 v/v% verhouding.
  6. Small molecule en groeifactor stock oplossingen
    1. Bereid voor differentiatie van alle drie de celtypen 200 μL aliquots van GSK3-bètaremmer CHIR 99021 (6-[[2-[[[4-(2,4-Dichloordifenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazool-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitril); Wnt-remmer IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; en transformerende groeifactor bèta (TGF-β)-remmer SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazool-2-yl]benzamide) bij een concentratie van 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Bereid voor humane iPSC-EC-differentiatie 100 μL aliquots van de basische fibroblastgroeifactor (bFGF) (20 μg / ml), vasculaire endotheelgroeifactor 165 (VEGF165; 50 μg / ml) en botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4; 20 μg / ml) in 0,1% (w / v) BSA in ultrapuur gedestilleerd water. Bewaar de aliquots bij -20 °C; voor langdurige opslag kunnen aliquots maximaal 1 jaar bij -80 °C worden bewaard.
  7. Voorcoatingplaten voor onderhoud van iPSC-CM's, iPSC-EC's en iPSC-CFs.
    1. Bereid keldermembraanmatrix medium gecoate 6-well platen voor iPSC-CM re-plating voor door het verdunnen van Growth Factor Reduced (GFR) keldermembraanmatrixmedium in DMEM / F12 in een verhouding van 1: 200. Voeg 2 ml verdund keldermembraanmatrixmedium toe aan elke put van de 6-putplaat en laat deze minstens 2 tot 4 uur uitharden.
    2. Voorverdek 6-well plaat of 10 cm schaal met gelatine. Maak 2% gelatineoplossing vloeibaar in een waterbad bij 37 °C en bereid gefilterde 0,2% (v/v) gelatine in PBS in een geschikt volume indien nodig. Bestrijk de kweekplaat vóór gebruik met 10 ml 0,2% gelatine gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Gelatineplaten kunnen worden gebruikt voor zowel iPSC-CF's als iPSC-EC's na MACS.
  8. Fabricage van microtissue mallen: Bereid 2% laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een droge glazen fles van 100 ml. Steriliseer de agarose bij 121 °C, 15 psi gedurende 20 minuten voor gebruik. Autoclaaf de gietsiliconen microvormen bij 121 °C, 15 psi gedurende 15 min.
  9. Oplossingen voor spijsvertering, immunostaining en flowcytometrie
    1. Bereid voor de microtissue-vertering een enzymverteringsbuffer van Dispase I (1 U/ml) en Liberase (3 U/ml) in PBS. Bewaar deze oplossing op ijs.
    2. Gebruik voor zowel cel- als microtissuefixatie ijskoud in de handel verkrijgbaar fixatiereagens dat 4,2% paraformaldehyde (PFA) bevat.
    3. Bereid 0,25% Triton X-100 in PBS voor op permeabilisatie en 0,1% Tween-20 voor wasbeurten. De oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard.
    4. Bereid voor fluorescentie-geactiveerde celsorteringsanalyses (FACS)- (FACS)- [PBS of HBSS met 2% foetaal runderserum (FBS)] en bewaar bij 4 °C.
    5. Bereid voor immunostaining 2% normaal geiten/ezel/konijn serum in PBS. Kies de serumsoort op basis van de gastheer waarin de antilichamen zijn verhoogd.

2. Cardiale differentiatie en zuivering

OPMERKING: Alle iPSC's moeten worden gehandhaafd op ~ 75% tot 80% confluentie voorafgaand aan cardiomyocytendifferentiatie. iPSC's die voor dit protocol werden gebruikt, werden afgeleid van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van Sendai-virusherprogrammering uitgevoerd aan de Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Voorafgaand aan differentiatie, cultuur iPSC kolonies tot passage (P20).
  2. Verwijder het iPSC-kweekmedium van de 6-putplaat en was de cellen eenmaal met 2 ml PBS.
  3. Begin op dag 0 met mesendoderm-inductie door 2 ml differentiatie Medium # 1 met CHIR (6 μM final) in elke put toe te voegen. De uiteindelijke concentratie kan variëren van 6 tot 9 μM voor verschillende iPSC-lijnen. Daarom wordt aanbevolen om verschillende CHIR-concentraties op een 6-well plaat te testen om optimale cardiale mesoderm-inductie te identificeren.
  4. Herstel op dag 2 de cellen door te vervangen door verse 2 ml Medium # 1 in elke put.
  5. Vervang op dag 3 het medium in elke put door 2 ml differentiatie Medium #1 door Wnt-remmer IWR-1-endo (5 μM) om cardiale afstammingsspecificatie te induceren.
  6. Herstel op dag 5 de cellen door medium te vervangen door verse 2 ml Medium #1 in elke put.
  7. Vervang op dag 7 medium door 2 ml Medium #2 in elke put. Spontaan kloppen van cardiomyocyten kan al op dag 8-9 worden waargenomen. Voor sommige lijnen kunnen kloppende cellen pas op dag 11 verschijnen.
  8. Voor zuivering van de differentiatiecultuur, vervang door 2 ml minus glucose medium # 3 in elke put op dag 10.
  9. Herstel op dag 13 de cellen door het medium te veranderen met 2 ml plus glucosemedium # 2 in elke put.
  10. Voer op dag 16 de tweede zuiveringsronde uit met 2 ml Medium # 3 in elke put.
  11. Herstel de cellen op dag 19 met 2 ml plus glucose medium # 2.
  12. Was de putjes op dag 20 eenmaal met 1 ml PBS en dissocieer de cellen met 1 ml 10x trypsine gedurende 6 minuten bij 37 °C. Na incubatie worden de cellen van het putoppervlak getild in enkele cellen gedurende minder dan 15 s en toegevoegd aan een conische buis van 15 ml met hetzelfde volume medium # 2 om het enzym te neutraliseren. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 270 x g.
  13. Resuspend de celkorrel in 3 ml Medium #3. Tel de cellen en voeg het juiste volume medium # 3 toe om in totaal ~ 3 miljoen cellen in elke put van een nieuwe keldermembraanmatrix medium gecoate 6-well plaat te plaatsen. Vervang op de tweede dag na het opnieuw platen het medium door verse 2 ml Medium # 2 en vul aan met 2 ml Medium # 2 om de andere dag tot trypsinisatie van cardiomyocyten voor bevriezing of toekomstige experimenten.

3. Endotheelceldifferentiatie en MACS

  1. Bij 75% tot 80% iPSC-confluïteit, was de plaat met PBS, 2 ml per put.
  2. Begin met differentiatie op dag 0 door te vervangen door 2 ml differentiatie Medium #1 door 6 μM CHIR.
  3. Vervang op dag 2 het medium door 2 ml differentiatie Medium #1 door 2 μM CHIR.
  4. Vervang op dag 4 het medium door 2 ml BAVA aangevuld met 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 en 20 ng BMP4.
  5. Verander het medium met 2 ml BAV aangevuld met groeifactoren om de 2 dagen van dag 6 tot dag 10. Toevoeging van TGFβ-remmer (SB431542) bij een concentratie van 8 μM is optioneel om endotheelexpansie te bevorderen en differentiatie van andere mesenchymale oorsprongsceltypen te onderdrukken.
  6. Begin op dag 12 met stappen voor MACS door elke put te spoelen met 1 ml PBS gevolgd door celdissociatie met behulp van 1 ml 10x trypsine in elke put van een 6-well plaat gedurende 8 minuten bij 37 °C.
  7. Bereid een gelijk volume EGM-medium in een conische buis van 50 ml om het dissociatie-enzym te neutraliseren. Plaats een celzeef van 40 μm op de conische buis van 50 ml en laat de gedissocieerde celsuspensie door de zeef gaan. Vervang het filter voor elke 2 tot 3 gedissocieerde putten.
  8. Inventariseer de totale levensvatbare cellen met behulp van 0,4% Trypan-blauw met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
  9. Pelleteer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten in een voorgekoelde centrifugeset bij 4 °C.
  10. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in het juiste volume van de sorteerbuffer op basis van het totale aantal in stap 3.8.
    OPMERKING: Voeg 80 μL sorteerbuffer toe per 107 cellen in totaal.
  11. Voeg voor magnetische kraaletikettering 20 μL FcR Blocking-reagens per 107 cellen toe en incubeer gedurende 5 minuten.
  12. Voeg 20 μL CD144 of CD31 Microbeads per 107 cellen toe en meng goed. Incubeer de celsuspensie in het donker bij 4 °C gedurende 15 minuten.
  13. Voeg 20 ml sorteerbuffer toe om de gelabelde cellen te wassen en pellet de cellen 300 x g gedurende 5 minuten in een voorgekoelde centrifuge op 4 °C.
  14. Resuspend de celkorrel in 3 ml sorteerbuffer en laat deze op ijs liggen.
  15. Bereid een magnetische scheidingskolom voor door de kolom in de inkeping van de scheiding te plaatsen.
  16. Breng de kolom in evenwicht door te spoelen met 3 ml sorteerbuffer en vang de stroom op in een conische afvalbuis.
  17. Zodra de spoelbuffer doorstroomt, resuspendeert u de celsuspensie grondig om eventuele klonten te breken en brengt u de celsuspensie op de kolom aan.
  18. Nadat de celsuspensie is doorgestroomd, wast u de kolom drie keer met 3 ml sorteerbuffer om eventuele niet-gelabelde cellen te verwijderen.
  19. Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze in een conische buis van 15 ml voor CD144+/CD31+ celelutie.
  20. Voeg 5 ml sorteerbuffer toe aan de kolom en spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk met de zuiger.
  21. Bepaal het levensvatbare celgetal met behulp van 0,4% Trypan-blauw met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
  22. Centrifugeer de celsuspensie in een voorgekoelde centrifuge bij 300 x g gedurende 3 min.
  23. Resuspend de celkorrel in het juiste volume BAVA met 5-8 μM TGFβ-remmer (SB431542) op basis van het totale aantal in stap 3.21.
  24. Plaats deze passage 0 (P0) cellen met een geschikte celdichtheid (4 x 104 cellen/cm2) op een voorgecoate 0,2% gelatineplaat.
  25. Voor P0 en P1, blijf het medium aanvullen met verse EGM om de 2 dagen met TGFβ-remmer. Vanaf P2 kunnen cellen worden gekweekt in endotheelgroeimedium zonder TGFβ-remmer.

4. Differentiatie van cardiale fibroblasten

  1. Laat iPSC's 90% tot 95% confluent worden; was elke put met 1 ml PBS.
  2. Begin met differentiatie op dag 0 door 2 ml differentiatie Medium #1 toe te voegen met 11 μM CHIR. Voor gevoelige iPSC-lijnen kan de concentratie variëren tussen 9-10 μM.
  3. Observeer op dag 1 de plaat. Het is normaal om significante celdood waar te nemen met ~ 30% tot 40% cellen die aan de plaat zijn gehecht.
  4. Voeg op dag 3 2 ml differentiatie Medium #1 toe met 5 μM IWR-1-endo om de expansie van cardiale voorlopercellen te bevorderen.
  5. Vervang op dag 4 het medium door 2 ml cardiaal fibroblastdifferentiatiemedium. Vervang elke 2 dagen tot dag 16 door vers medium.
  6. Maak op dag 18 de cellen los met behulp van 1 ml 10x trypsine in elke put van een 6-putplaat gedurende 10 minuten bij 37 °C.
  7. Verstoor de cellaag grondig en laat de celsuspensie door een celzeef van 70 μm gaan in een conische buis van 50 ml met een gelijk volume DMEM/F12-medium aangevuld met 5% FBS.
  8. Bepaal het levensvatbare celgetal met behulp van 0,4% Trypan-blauw met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
  9. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g om een pellet te verkrijgen.
  10. Voor de eerste replating, resuspend de celkorrel in een geschikt volume differentiatiemedium en plaat met een celdichtheid (6 x 104 cellen/cm2) op een 0,2% gelatine gecoate plaat tot 90% confluentie.
  11. Splits de plaat en onderhoud de cardiale fibroblasten in gewone DMEM/F12 met 10% serum op met gelatine beklede platen.

5. Gieten van cardiale microtissue schimmels en cel zaaien

  1. Smelt de agarose in een magnetron in een glazen fles van 100 ml tot ze kookt. Spuit de agarosefles en plaats deze in de bioveiligheidskast. Laat de agarose ~3 min afkoelen.
  2. Pipetteer 700 μL gesmolten agarose in een siliconen micromal van 9 x 9 array. Vermijd het genereren van bubbels tijdens het pipetteren.
  3. Plaats de mal voorzichtig op een voorgekoeld ijsblok om de agarose-gelation te versnellen.
  4. Zorg ervoor dat zodra de agarose is gelled, deze doorschijnend wordt. Buig voorzichtig rond de randen van de micromal om de agarose-replica los te maken. Pel vervolgens de replica voorzichtig van alle kanten om de agarose-replica los te maken van de siliconen micromal.
  5. Breng de agarose microtissue tray met 81 ronde uitsparingen (800 μm diameter; 800 μm diepte) over in een steriele 12-well plaat.
  6. Voeg 2 ml PBS toe aan de agarose microtissue tray en inspecteer onder de microscoop op gevangen bubbels of onregelmatig gevormde putten.
  7. Dompel de agarosebak een nacht onder in 2 ml 70% ethanol, gevolgd door een UV-behandeling in de bioveiligheidskast gedurende 1 uur.
  8. Verwijder voor gebruik de 70% ethanol en was tweemaal met gedestilleerd water en een laatste wasbeurt met 2 ml PBS.
  9. Trypsiniseren, neutraliseren en tellen van iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs en plaats de celsuspensies op ijs.
  10. Verwijder de PBS voorzichtig uit de put en de celzaaikamer zonder de uitsparingen aan te raken.
  11. Meng in een nieuwe buis iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CF's in respectievelijk 7:2:1-verhouding om een uiteindelijke celdichtheid van 106 cellen / ml te bereiken. Hogere celdichtheden zullen resulteren in grotere microtissues.
    OPMERKING: Niet groter dan 2 x 106 cellen/ml.
  12. Voeg voorzichtig de 200 μL van de celsuspensie druppelsgewijs toe in de zaaikamer.
  13. Laat de cellen gedurende 2 uur bij 37 °C in een CO2-incubator bezinken.
  14. Voeg microtissue fabricagemedium toe rond de agarose-mal om het oppervlak van de binnenkamer te bedekken.
  15. Na 24 uur assembleren en verdichten de cellen zichzelf aanzienlijk in de cirkelvormige uitsparingen. Vervang elke 2 dagen door vers medium voor onderhoud.

6. Fixatie en permeabilisatie van cellen en cardiale microtissues voor immunostaining

  1. Kweek voor elk afzonderlijk celtype de cellen afzonderlijk op het medium van de keldermembraanmatrix of met gelatine beklede kamerglaasjes (ongeveer 2,5-3 x 105 cellen / ml). Cardiale microtissues kunnen worden verzameld in een conische buis van 15 ml door ze voorzichtig uit de cirkelvormige uitsparingen te spoelen.
  2. Zuig het medium op en spoel de cellen of microtissues met 1 ml PBS; daarna fixeren met de fixatiebuffer met 4,2% PFA gedurende 20 minuten voor de kamerglijbanen en 1 uur voor microtissues bij kamertemperatuur.
  3. Zuig de PFA aan en voeg 1 ml permeabiliseeroplossing toe (0,25% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 tot 7 minuten voor kamerglijbanen en 20 minuten voor microtissues in een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Vanaf deze stap kunnen de monsters voorzichtig worden gewiegd op een schommelplatform op een bank.
  4. Zuig de permeabiliserende oplossing aan en spoel eenmaal met 2 tot 3 ml PBS.
  5. Incubeer de cellen met 500-1.000 μL blokkerende oplossing (2% tot 5% normaal geitenserum of ezelserum) gedurende ten minste 1 uur voor de kamerglaasjes en 3 tot 4 uur voor de microtissues.
  6. Incubeer de cellen of cardiale microtissues met geconjugeerde antilichamen bereid in de blokkerende oplossing die voldoende is om het monster te bedekken. Incubeer met anti-cardiale Troponine-T (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) en anti-DDR2/Vimentin (1:50) gedurende 1 uur voor de kamerglijbanen en 's nachts bij 4 °C voor cardiale microtissues.
  7. Was de kamerglijden drie keer met 500 μL 0,1% Tween-20 gedurende 5 minuten tussen elke wasbeurt en een laatste wasbeurt met PBS.
  8. Voor de cardiale microtissues, wassen met 2 ml 0,1% Tween-20 vijf keer met 20 minuten duur tussen elke wasbeurt. Voer nog een laatste wasstap uit gedurende nog eens 20 minuten.
  9. Incubeer de cellen of microtissues met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1 μg/ml) voorafgaand aan confocale microscopie.
  10. Breng voor cardiale microtissues voorzichtig over naar een glazen bodemschaal van 35 mm en voeg PBS toe om microtissues onder te dompelen.
  11. Voor 3D-beeldvorming, met behulp van een 20x of 40x olie-onderdompelingsobjectief, krijgt u de focus van de microtissue en past u de belichtingsparameters voor elke fluorofoor aan.
  12. Voor het verkrijgen van een Z-stack stelt u de eerste en laatste coördinaten in de Live-modus in met een totale beelddiepte van 100-200 μm met een slice-interval van 5-10 μm.

7. Vertering van cardiale microtissues en voorbereiding van cellen voor flowcytometrie

  1. Om microtissues te verteren, spoelt u de microtissues voorzichtig met Medium #1 uit de ronde uitsparingen met behulp van een pipetpunt met brede boring van 1 ml in een conische buis van 15 ml.
  2. Laat de microtissues bezinken en zuig het medium voorzichtig op en spoel de cellen of microtissues met 1 ml PBS en voeg gedurende 20 minuten bij 37 °C 200-300 μL enzymverteringsbuffer toe. Meng na 10 minuten de microtissues voorzichtig gedurende 1 min en incubeer opnieuw bij 37 °C voor de rest van de tijd.
  3. Gebruik na incubatie een gewone pipetpunt van 1 ml om de microtissues krachtig te mengen om een troebele celsuspensie te verkrijgen.
  4. Zodra de microtissues voldoende zijn verteerd tot enkele cellen, neutraliseert u onmiddellijk de celsuspensie met 5 ml medium met 5% FBS en spant u de celsuspensie door een celzeef van 40 μm. Tel het totale aantal cellen en centrifugeer de eencellige suspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Zuig het supernatant op en resuspend 1 x 105-1 x 106 cellen in 100 μL annexinebindende buffer met FITC Annexin V en 100 μg/ml propidiumjodide (PI) of To-Pro3 dode cel uitsluitingskleurstof gedurende 10 minuten op ijs.
  6. Voeg na incubatie 300 μL van de annexinebindingsbuffer toe aan de celsuspensie en breng over naar een FACS-buis met ronde bodem voor flowcytometrieanalyse. Gebruik de juiste lasers en emissiefilters voor de geselecteerde fluoroforen.
  7. Voor de kwantificering van celoppervlakmarkers met behulp van vaste cellen voert u de fixatie en permeabilisatie van de celkorrel uit zoals beschreven in stap 6.2 en 6.3.
  8. Spoel na permeabilisatie de celkorrel en incubeer de cellen met respectievelijke geconjugeerde antilichamen gedurende 1 uur. Was de celkorrel in 4 ml FACS-buffer (2% FBS in PBS) en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 x g . Herhaal de wasstap twee keer.
  9. Resuspend de cellen in 200-300 μL FACS-buffer voor flowcytometrie-analyse.
  10. Pas de voorwaartse en zijverstrooiingseigenschappen aan met een onbevlekt monster en overweeg een isotyperegeling voor elke fluorofoor te gebruiken om de laserspanningen aan te passen. Verzamel minimaal 20.000 gebeurtenissen voor data-analyse.

8. Uitvoeren van contractieanalyses van spontaan kloppende cardiale microtissues

  1. Neem video's op van cardiale microtissues om ten minste drie slagen vast te leggen. Stel de opnameresolutie in op ten minste 1280 x 720 pixels met een framesnelheid >30 frames per seconde en sla de video op in . AVI-formaat.
  2. Voer het MotionGUI-script11 uit in een MATLAB-omgeving om de gebruikersinterface te starten.
  3. Zoek het . AVI-bestandslocatie in uw map om de video te laden. Voer vervolgens de framesnelheid in waarmee de video is vastgelegd in het deelvenster Invoer.
  4. In het geavanceerde invoerpaneel kan een pixelgrootte worden opgegeven op basis van de resolutie en de opnamevergroting.
  5. Een geschikte macroblokpixelgrootte kan worden opgegeven (standaard 16) en een detecteerbare pixelbeweging afhankelijk van de sterkte van microtissue-contractie.
  6. Nadat u de parameters hebt aangepast, klikt u op Bewegingsvectoren ophalen om de analyse te starten.
  7. Selecteer een interessegebied met het keuzerondje AOI kiezen om gebieden rond de enkele microtissue in de cirkelvormige uitsparing uit te sluiten.
  8. Gebruik de functie Map Time Ave om een gemiddelde contractie heatmap te genereren op basis van beweging gedetecteerd op X- en Y-assen.
  9. Gebruik voor piektraceringsgegevens de functie Contractiegegevens ophalen om automatisch de krimp- en ontspanningspieken te meten.
  10. In het geval van een lage signaal-ruisverhouding, pas een piekhoogte en afstandsdrempel toe om de maximale contractiesnelheid (blauwe stip) en maximale relaxatiesnelheid (rode driehoek) correct te annoteren.
  11. Nadat u de juiste drempelwaarden hebt ingesteld, selecteert u Pieken analyseren om de contractie- en relaxatiewaarden met slagfrequentie en slaginterval te verkrijgen.
  12. Verkrijg metingen van minimaal 25 individuele microtissues voor statistische analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining en flowcytometriekarakterisering van iPSC-afgeleide CM's, EC's en CF's
Om cardiale microtissues te genereren die bestaan uit iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs, worden alle drie de celtypen afzonderlijk gedifferentieerd en gekarakteriseerd. De in vitro differentiatie van iPSC's naar iPSC-CM's is de afgelopen jaren verbeterd. De opbrengst en zuiverheid van iPSC-CMs verschillen echter van lijn tot lijn. Het huidige protocol levert meer dan 75% zuivere iPSC-CMs op die rond dag 9 spon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om cardiale microtissues te genereren uit vooraf gedifferentieerde iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs, is het essentieel om een zeer zuivere cultuur te verkrijgen voor een betere controle van het aantal cellen na contact-geremde celverdichting in de cardiale microtissues. Onlangs heeft Giacomelli et. al.18 hebben de fabricage van cardiale microtissues aangetoond met behulp van iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs. Cardiale microtissues gegenereerd met behulp van de beschreven methode bestaan uit ~ 5.000 c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. is medeoprichter van Khloris Biosciences, maar heeft geen tegenstrijdige belangen, omdat het hier gepresenteerde werk volledig onafhankelijk is. De andere auteurs melden geen conflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Dr. Amanda Chase voor haar nuttige feedback op het manuscript. Financieringssteun werd verstrekt door het Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) van de Universiteit van Californië, T29FT0380 (D.T.) en 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) en 17MERIT33610009 (J.C.W.); en National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 en NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-well platesFisher Scientific08-772-29
3D micro-moldsMicrotissues12-81 format
6-well platesFisher Scientific08-772-1B
AutoMACS Rinsing SolutionThermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Supplement minus InsulinLife TechnologiesA1895601
B27 Supplement plus InsulinLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrixBD Biosciences354277
Cardiac Troponin T AntibodyMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeadsMiltenyi130-097-857
CD31 AntibodyMiltenyi130-110-670
CD31 MicrobeadsMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium11960044
DMEM/F-12 basal mediumGibco11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Fetal bovine serumLife Technologies10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors KitLifeLIne Cell TechnologyLS-1010
Glucose free RPMI mediumLife Technologies11879-020
Goat serumLife Technologies16210-064
Human FGF-basicThermo Fisher Scientific13256029
Human VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Sorting ColumnsMiltenyi130-042-401
MACS BSA Stock solutionMiltenyi130-091-376
MACS Rinsing BufferMiltenyi130-091-222
MidiMACS SeparatorMiltenyi130-042-302
RPMI mediumLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Scientificred
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated AntibodyR&D SystemsIC2105G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64(2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948(2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39(2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886(2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cardiale microweefselsstromale vasculaire fractieflowcytometriesingle cell RNA sequencingconfocale microscopieagarose matrijsmethodecelzaaidichtheidanalyse van de contractiele functieimmunofluorescentiekleuring

Gerelateerde artikelen