Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Summary

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Abstract

De technologische prestaties van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde kwantitatieve proteomics openen veel onontdekte wegen voor het analyseren van het wereldwijde proteoom van een organisme onder wisselende omstandigheden. Deze krachtige strategie die wordt toegepast op de interacties van microbiële pathogenen met de gewenste gastheer karakteriseert beide perspectieven ten opzichte van infectie volledig. Hierin beschrijft de workflow labelvrije kwantificering (LFQ) van het infectoom van Cryptococcus neoformans, een schimmelfaccultatieve intracellulaire ziekteverwekker die de veroorzaker is van de dodelijke ziekte cryptococcosis, in aanwezigheid van vereeuwigde macrofaagcellen. Het protocol beschrijft de juiste eiwitpreparaattechnieken voor zowel pathogene als zoogdiercellen binnen één experiment, wat resulteert in de juiste peptide-indiening voor vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse. Het generieke karakter van LFQ met hoge doorvoer maakt een breed dynamisch scala aan eiwitidentificatie en kwantificering mogelijk, evenals overdraagbaarheid naar elke host-pathogene infectie-instelling, met behoud van extreme gevoeligheid. De methode is geoptimaliseerd om uitgebreide, onbevooroordeelde eiwitrijkdomsprofielen van een ziekteverwekker te catalogiseren binnen infectie-nabootsende omstandigheden. In het bijzonder biedt de hier aangetoonde methode essentiële informatie over C. neoformans pathogenese, zoals eiwitproductie die nodig is voor virulentie en identificeert kritische gastheereiwitten die reageren op microbiële invasie.

Introduction

De prevalentie van invasieve schimmelinfecties neemt enorm toe en is gecorreleerd met onaanvaardbaar hoge sterftecijfers, meestal gerapporteerd bij personen met immunodeficiënte aanleg¹. Cryptococcus neoformans is een beruchte opportunistische schimmelpathogene die in staat is tot intracellulaire overleving in gastheermacrofaagcellen. Ontoereikende antischimmelinterventie resulteert in schimmelverspreiding en levensbedreigende manifestaties van cryptokokken meningitis en meningoencephalitis^2,3. De wereldwijde toename van de immunogecompromitteerde status heeft een parallelle toename van het gebruik van schimmelwerende middelen geëist, waarbij veel schimmelsoorten, waaronder C. neoformans, in toenemende mate resistentie hebben ontwikkeld naar^4,5,6. Daarom is het absoluut noodzakelijk om robuuste en efficiënte technologieën te implementeren om essentiële biologische vragen met betrekking tot de reactie van de gastheerverdediging en microbiële pathogenese te beantwoorden.

Het nieuwe tijdperk van technologische vooruitgang in massaspectrometrie (MS), met inbegrip van de generatie van krachtige computationele en bioinformatische pijpleidingen, vormt de basis voor een integratieve visie voor grootschalige analyse van onderzoek naar gastheerpathogenen^7,8. Conventionele pathogenese-gedreven proteomische analyse profileert gewoonlijk de visie op infectie vanuit het perspectief van de gastheer of de ziekteverwekker, met inbegrip van uitgebreide methodologieën zoals eiwitcorrelatieprofilering, affiniteitschromatografie in combinatie met proteomics en interactomics⁹. Onderzoeken naar de virulentie van gevaarlijke ziekteverwekkers in een gastheersysteem zijn van enorm klinisch belang; de toepassing van een analyse met twee perspectieven in één enkel experiment werd echter voorheen als onbereikbaar beschouwd. Het perspectief van de ziekteverwekker op infectie wordt bijvoorbeeld vaak overweldigd door zeer overvloedige gastheereiwitten, wat resulteert in een verminderde gevoeligheid voor de detectie van laag-overvloedige schimmeleiwitten⁷. Bovendien nodigt de hoge steekproefcomplexiteit veel doelen uit om in één experimenteel systeem te onderzoeken en blijkt het een uitdaging om werkingsmechanismen voor een specifiek ziekteverwekkereiwit op te helderen.

Bottom-up proteomics is een populaire MS-techniek die beheersbare monstervoorbereiding mogelijk maakt, waarbij peptiden worden gegenereerd door sequentiespecifieke enzymatische vertering gevolgd door scheiding, identificatie en kwantificering van vloeibare chromatografie door MS^10,11. Hier presenteren we een methode die een data-afhankelijke acquisitiestrategie demonstreert die is bedoeld om een onbevooroordeelde dekking van een op infecties gebaseerd proteoom of 'infectoom' te bereiken. In het bijzonder werpt labelvrije kwantificering (LFQ) de afhankelijkheid van chemische of metabole etiketten af voor een robuuste en nauwkeurige identificatie van veranderingen in het eiwitgehalte in meerdere proteomen, waardoor de behandeling en verwerking van monsters worden verminderd^12,13. Deze universele toepassing ondervraagt geproduceerde eiwitten op een bepaald moment in een cel onafhankelijk van elke verwachte eiwitproductie; zo kunnen nieuwe inzichten worden ontdekt die van cruciaal belang zijn voor infectie.

De workflow die hierin wordt beschreven, is geoptimaliseerd om veranderingen in het eiwitniveau van C. neoformans te onderzoeken tijdens infectie-nabootsende aandoeningen met gastheer-immuuncellen (figuur 1). In plaats van te vertrouwen op de isolatie en scheiding van celtypen, haalt deze aanpak het gastheer- en ziekteverwekkerproteoom samen en maakt gebruik van bioinformatische scheiding met behulp van twee organismespecifieke databases om soortspecifieke eiwitproductie te onderscheiden. Deze methode biedt voordelen voor een onbeperkt aantal monsters dat moet worden verwerkt zonder de extra dure voorbereidingsstappen die nodig zijn in op isotopen gebaseerde etiketteringsstudies of fractionering. Bovendien ondersteunt deze workflow geoptimaliseerde eiwitextractieprotocollen die kunnen worden overgedragen op een breed scala aan schimmel- en bacteriële pathogenen die gastheer immuuncellen kunnen richten en infecteren. Over het algemeen schetst dit protocol de stappen om een onbevooroordeelde eiwitextractie en monsterverwerking voor ms met hoge resolutie te voltooien, gevolgd door gegevens en statistische analyse, in staat om een schat aan kennis te bieden van schimmeleiwitten die belangrijk zijn voor infectie in combinatie met uitgebreide profilering van de reactie van de gastheerverdediging.

Protocol

Een vereeuwigde lijn van macrofagen afgeleid van BALB/c muizen werden gebruikt voor het volgende protocol goedgekeurd door de Universiteit van Guelph Animal Usage Protocol 4193. Met name andere stammen van muizen of andere bronnen van vereeuwigde cellen kunnen worden toegepast op het geschetste protocol met voldoende testen om de gedetailleerde parameters te optimaliseren. Het volgende protocol navigeert door de stappen die beginnen met een bevroren injectieflacon van macrofaagcellen. Cellen worden opgeslagen in 10% FBS (foetaal runderserum), 1% L-glutamine en 5% Pen/Strep (Penicilline-Streptomycine) mengsel tot DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) en 20% DMSO (dimethylsulfoxide).

1. Cultivering van C. neoformans

1. Met behulp van een glycerol stam, streak wildtype C. neoformans stam (H99) op Gist-extract peptone dextrose (YPD) agar plaat om enkele kolonies te isoleren.
2. Incubeer 's nachts gedurende 16 uur bij 37 °C in een statische incubator.
3. Selecteer een enkele kolonie wildtype C. neoformans stam en kweek in 5 ml YPD bouillon in een losjes afgetopte 10 ml reageerbuis. Voer uit in quadruplicate.
4. Incubeer 's nachts gedurende 16 uur bij 37 °C in een schudincubator bij 200 tpm.
5. De volgende dag subcultuur elke nacht cultuur in een 1:100 verdunning in 3 mL YPD bouillon.
6. Meet optische dichtheid (OD_600nm)waarden van schimmelcultuur om de midden-log fase te bepalen. Afhankelijk van de spectrofotometer bereikt C. neoformans wildtype stam de mid-log fase meestal na 6 tot 8 uur incubatie in YPD met algemene OD_600nm waarden variërend van 1,0 tot 1,5.
7. Zodra de cellen halverwege de logfase zijn bereikt, neemt u een 10 μL aliquot schimmelcelsuspensie in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en verdunt u 1:100 in steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.

2. Cultivering van macrofaagcellen

OPMERKING: Zorg ervoor dat de werkomgeving wordt gesteriliseerd voorafgaand aan het celcultuurwerk.

1. Voorbereiding van celkweekmedium
   1. Antibioticum-aangevuld medium: Voeg 10% FBS (foetaal runderserum), 1% L-glutamine en 5% Pen/Strep (Penicilline-Streptomycine) mengsel toe aan DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filter medium door een 0,2 μm compleet filtersysteem en bewaar bij 4 °C.
   2. Antibioticavrij medium: Volg hetzelfde protocol, maar laat pen/strepmengsel achterwege.
2. Macrofaagcellen zaaien
   OPMERKING: Antibioticum-aangevuld medium (2.1.1.) moet worden opgewarmd tot 37°C voorafgaand aan celkweekwerkzaamheden.
   1. Ontdooi de flacon macrofaagcellen snel in het kraalbad van 37 °C.
   2. Was de cellen van de vriesoplossing door de cellen te resuspenderen in 1 ml antibioticum-aangevuld medium.
      OPMERKING: Extra voorzorgsmaatregelen zijn nodig om ervoor te zorgen dat de cellen niet lyseren als gevolg van hard pipetten.
   3. Breng geresuspendeerde cellen over in een steriele buis van 15 ml.
   4. Pelletcellen door centrifugeren op 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Verwijder supernatant voorzichtig met een serologische pipet of vacuüm aspirator.
   6. Resuspend pellet voorzichtig in 10 ml antibioticum aangevuld medium.
   7. Gently pipette resuspended cellen in een 60 x 15 mm cel cultuur behandelde schotel.
   8. Incubeer de schaal bij 37 °C met 5% CO₂ 's nachts.
3. Initiële passage van macrofaagcellen
   OPMERKING: Bevroren celvoorraden bevatten doorgaans tussen de 5 en 10 miljoen cellen per flacon (ca. 1 ml). Op de volgende dag zullen macrofaagcellen die het zaaiprotocol hebben overleefd zich aan de onderkant van de celkweekschotel hechten en klaar zijn voor passivering.
   1. Warm antibioticum-aangevuld medium (stap 2.1.1) tot 37 °C voorafgaand aan celkweekwerk. Zorg ervoor dat de werkomgeving wordt gesteriliseerd voorafgaand aan het celcultuurwerk. Visualiseer cellen met behulp van een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat cellen worden hecht en gezond zijn.
   2. Verwijder het celkweekmedium uit de schaal met een serologische pipet of een vacuüm aspirator.
   3. Voeg voorzichtig 5-7 ml steriele KAMERTEMPERATUUR PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) toe aan de schotel van 60 x 15 mm.
   4. Kantel de schaal voorzichtig om de cellen te wassen.
   5. Verwijder PBS met een serologische pipet of vacuüm aspirator.
   6. Voeg 1 ml koude PBS (opgeslagen bij 4 °C) toe aan de cellen, kantel de schotel om PBS over alle cellen te verdelen en laat 1 minuut op kamertemperatuur zitten.
   7. Laat cellen los door zachtjes op de schaal te tikken, koude PBS tegen de cellen te spuiten of door een celschraper te gebruiken.
   8. Voeg 9 ml antibioticum-aangevuld medium toe aan de schaal.
   9. Voeg in een nieuwe schaal van 60 x 15 mm 9 ml vers antibioticum-aangevuld medium en 1 ml geresuspendeerde cellen uit de originele schaal toe.
   10. Zodra het aantal gewenste passagingplaten is gevuld, kunnen geresuspendeerde cellen uit de originele schaal worden weggegooid.
   11. Incubeer de nieuwe schaal op de hierboven genoemde instellingen (stap 2.2.8).
   12. Voer daaropvolgende passivering uit wanneer cellen 70-80% samenvloeiing hebben bereikt (ongeveer om de 2 dagen, afhankelijk van de gebruikte cellijn en het gebruikte medium).
       OPMERKING: Macrofaagcellen moeten ten minste vijf keer worden gepasseerd voorafgaand aan infectie-experimenten. Afhankelijk van de cellijn moeten infectie-experimenten worden uitgevoerd door 25 tot 30 passages. Na 25 tot 30 passages moeten cellen worden ingevroren of weggegooid. Op basis van de experimentele plannen kan worden gekozen voor punt 2.4 of 2.5. Punt 2.4 wordt gebruikt voor de volgende secties.
4. Zaaiende macrofaagcellen voorafgaand aan infectie
   1. Voer passagingprotocolstappen 2.3.1 tot en met 2.3.7 uit.
   2. Met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller bepaalt u de celdichtheid (cellen/ml).
   3. Breng 0,3 x 10⁶ macrofaagcellen over in een enkele put van een 6-put celkweekplaat.
   4. Pas het totale volume van goed aan tot 1 ml met behulp van antibioticum-aangevuld medium (stap 2.1.1).
   5. Herhaal de stappen 2.4.3 en 2.4.4 tot 8 putten zijn gevuld (4 putten gevuld met twee afzonderlijke platen).
   6. Vul eventueel de resterende twee putten met 1 ml PBS op kamertemperatuur om het vochtgehalte tijdens de incubatie te behouden.
   7. Laat cellen groeien onder incubatieomstandigheden zoals vermeld in stap 2.2.8 gedurende 2 d voorafgaand aan infectie.
5. Zaaien van macrofaagcellen op de dag van infectie
   1. Voer passagingprotocolstappen 2.3.1 tot en met 2.3.7 uit.
   2. Met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller bepaalt u de celdichtheid (cellen/ml).
   3. Zaai 1,2 x 10⁶ macrofaagcellen in een enkele put van een 6-put celkweekplaat.
   4. Pas het totale volume van goed aan op 1 ml met behulp van antibioticum-aangevuld medium (2.1.1).
   5. Herhaal 2.4.3 en 2.4.4 tot 8 putten zijn gevuld (4 putten gevuld met twee afzonderlijke platen).
   6. Vul eventueel de resterende twee putten met 1 ml PBS op kamertemperatuur om het vochtgehalte tijdens de incubatie te behouden.
   7. Incubeer cellen onder de in stap 2.2.8 genoemde omstandigheden gedurende 3 uur om cellen in staat te stellen zich aan putten te hechten.

3. Infectie van macrofaagcellen met C. neoformans

OPMERKING: Bij het bereiken van 70-80% samenvloeiing, zullen er ongeveer 1,2 x 10⁶ macrofaagcellen per put zijn. Om de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) van 100:1 te bereiken, zijn 1,2 x 10⁸ schimmelcellen nodig voor elke reactie. Culturen moeten dienovereenkomstig in biologische quadruplicate worden geplaatst.

DISCLAIMER: Een MOI van 100:1 heeft wenselijke resultaten behaald in onze onderzoeksgroep en is bedoeld als suggestie voor lezers. Een lagere MOI kan nodig zijn voor meer infectieuze C. neoformans stammen of voor minder veerkrachtige macrofaagcellijnen. Verificatie van infectie (rubriek 3.5) kan worden gebruikt om de ideale MOI voor bepaalde C. neoformans – macrofaagcombinaties te bepalen.

1. Voorbereiding van schimmelcellen
   1. Volg stap 1 voor de groei van C. neoformans naar mid-log fase.
   2. Verzamel en centrifugeer cellen gedurende 10 minuten op 1.500 x g, was pellet voorzichtig met steriele PBS op kamertemperatuur en herhaal dit gedurende in totaal drie wasbeurten.
   3. Resuspend cellen in antibioticavrij celkweekmedium (stap 2.1.2) om een concentratie van 1,2 x 10⁸ cellen/ml te bereiken.
2. Voorbereiding van macrofaagcellen
   1. Visualiseer elke put in de 6-putplaat om ervoor te zorgen dat cellen 70-80% samenvloeiing hebben bereikt. Als alternatief kunnen cellen worden gemeten om ongeveer 1,2 x 10⁶ macrofaagcellen per put te bereiken.
   2. Volg stap 2.3.1 tot en met 2.3.4.
3. Co-cultuur van C. neoformans en macrofaagcellen
   1. Voeg 1 ml van de geresuspendeerde C. neoformanscellen (stap 3.1.3) toe aan 4 putten met macrofaagcellen bereid in rubriek 3.2.
      OPMERKING: Het aantal benodigde platen moet vóór het begin van het experiment worden berekend. Voeg 1 ml antibioticavrij medium (stap 2.1.2) toe aan lege putten.
   2. Laat cellen gedurende 3 uur incuberen onder de vermelde omstandigheden (stap 2.2.8).
   3. Verwijder het celkweekmedium van de plaat met een serologische pipet of een vacuüm aspirator.
   4. Voeg voorzichtig 1 ml steriele PBS op kamertemperatuur toe.
   5. Kantel de plaat voorzichtig om niet-bevestigde of niet-gefagocytoseerde extracellulaire C. neoformanscellen te wassen.
   6. Verwijder PBS met behulp van een serologische pipet of vacuüm aspirator, herhaal voor een totaal van drie wasbeurten. Herhaal nog twee keer 3.3.4 tot 3.3.5.
4. Niet-geïnfecteerde macrofagen
   1. Gebruik ook 4 putten van een plaat met 6 putten om te dienen als macrofaagmonsters. Voeg 1 ml antibioticavrij medium (stap 2.1.2) toe aan deze putten.
   2. Herhaal stap 3.3.2 tot en met 3.3.6.
5. Verificatie van infectie
   OPMERKING: Met behulp van een cytotoxiciteitstest kan infectievaardigheid worden gemeten. Het volgende protocol zal de toepassing van een cytotoxiciteitsproduct benadrukken om de afgifte van LDH (lactaatdehydrogenase) te meten. Andere cytotoxiciteitsproducten kunnen ook worden gebruikt.
   1. Voorbereiding van C. neoformans infectie van macrofaagcellen
      1. Herhaalt stap 1, 2 en 3 (tot 3,5). De LDH-test kan, indien gewenst, in drievoud worden uitgevoerd.
      2. Voeg na stap 3.3.6 1 ml antibioticavrij medium (2.1.2) toe aan elke put in de 6-putplaat.
      3. Herhaal de stappen 2.4.3 en 2.4.4 tot 3 putten plus 3n putten zijn gevuld (waarbij n het aantal gemeten tijdspunten is).
      4. Incubeer cellen onder de in stap 2.2.8 genoemde omstandigheden.
      5. Verzamel op geselecteerde tijdstipen (bijv. 1, 3, 6, 12 en 24 uur) supernatant voor het meten van LDH-release volgens de instructies van de fabrikant
      6. Tegelijkertijd worden niet-geïnfecteerde macrofaagcellen lysed tot een bepaalde waarde voor maximale cytotoxiciteit.
      7. Bereken de cytotoxiciteit als volgt:
         

4. Monsterverzameling

1. Co-cultuur en niet-geïnfecteerde macrofaagcollectie
   1. Voeg 1 ml koude PBS toe aan de cellen (van 3.3.6 en 3.4.2) en laat 1 minuut op kamertemperatuur zitten.
   2. Laat cellen los van de plaat door zachtjes op de plaat te tikken of koude PBS zachtjes tegen de cellen te spuiten.
      OPMERKING: Celschraper moet worden vermeden, omdat dit lyse van cellen kan veroorzaken.
   3. Pipet resuspended cellen in een 15 ml buis.
   4. Centrifugeer cellen op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
   5. Verwerk cellen (zoals beschreven in stap 5) onmiddellijk of flash bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C voor latere verwerking.

5. Cellulair proteoom

OPMERKING: Er moet voldoende lyse worden geoptimaliseerd voor het geanalyseerde celtype (d.w.z. de hoeveelheid cycli en amplitudes is afhankelijk van de grootte van de celpellet en het vermogenspercentage van het sondesonicatormodel).

1. Geïnfecteerde macrofaagcellyse
   1. Resuspend pelletcellen (stap 4.1.5) in 300 μL van 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestaande uit een vers opgeloste proteaseremmer cocktailtablet.
      OPMERKING: Voorafgaand aan het begin van het experiment wordt één proteaseremmercocktailtablet toegevoegd aan 10 ml ijskoud 100 mM Tris-HCl (pH 8,5).
   2. Sonde sonicaatcellen in een ijsbad gedurende 15 cycli van 30 s aan en 30 s uit, om de cellen te lyseren.
   3. Centrifugeer cellen kort gedurende 30 s bij 400 x g, pas op dat u geen pellet vormt, alleen om vloeistof aan de zijkanten van buizen te verwijderen, gevolgd door overdracht van monster naar een 2 ml Lo-bind microcentrifugebuis.
   4. Voeg 1:10 volume van 20% SDS toe aan een eindconcentratie van 2%.
   5. Voeg 1:100 volume van 1 M dithiothreitol (DTT) toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 mM en meng het monster grondig door pipetting, gevolgd door incubatie op een thermisch verwarmingsblok bij 95 °C gedurende 10 minuten bij 800 tpm agitatie. Koel vervolgens af tot kamertemperatuur (koeling kan op ijs worden gedaan).
   6. Voeg 1:10 volume van 0,55 M iodoacetamide (IAA) toe om een uiteindelijke concentratie van 55 mM te verkrijgen en meng het monster grondig door pipetten. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten.
   7. Voeg 100% aceton toe om een uiteindelijke concentratie van 80% aceton te verkrijgen en bewaar het monster 's nachts bij -20°C om eiwitten neer te slaan.
2. Eiwitvertering
   1. Verzamel de volgende dag de neerslagkorrel door middel van centrifugatie gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en 4 °C. Gooi supernatant weg en was pellet met 500 μL van 80% aceton. Herhaal dit voor in totaal twee wasbeurten. Luchtdroge pellet bij kamertemperatuur na wasbeurten.
   2. Resolubiliseer eiwitkorrel in 100 μL van 8 M ureum/40 mM HEPES, om volledige oplosbaarheid, vortex of sonicaat in een ijswaterbad te garanderen gedurende 15 cycli van 30 s aan en 30 s uit.
      OPMERKING: De aanpassing van het volume ureum/HEPES wordt bepaald op basis van de grootte van neergeslagen celpellets, als er veranderingen optreden, moeten alle downstreamvolumes op de juiste manier worden aangepast.
   3. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittest (bijv. BCA-eiwittest) volgens de instructies van de fabrikant en pas aan voor achtergrondmeting door blanco normalisatie met 8 M ureum/40 mM HEPES.
   4. Voeg 300 μL ammoniumbicarbonaat van 50 mM toe om een uiteindelijke concentratie van 2 M ureum te verkrijgen.
      OPMERKING: Mogelijkheid om de eiwitconcentratie te normaliseren voor downstreammetingen, voorgesteld om 100 μg eiwit te verteren en het resterende onverteerde monster op te slaan door in vloeibare stikstof te flashen en vervolgens op korte termijn of bij -80 °C op langere termijn op te slaan bij -20 °C.
   5. Voeg 2:50 (v/w) enzym-eiwitverhouding van trypsine/Lys-C proteasemengsel toe op ijs en tik voorzichtig op de buis om te mengen, incubeer 's nachts bij kamertemperatuur.
   6. Stop na incubatie de spijsvertering door 1:10 volumestopoplossing (20% acetonitril, 6% trifluoracetzuur) en centrifugemonsters op 10.000 x g toe te voegen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Verzamel supernatant(bestaat uit verteerd peptiden)en gooi eventueel gekorreld vuil of neerslag weg.
3. Peptide ontalting
   1. Activeer een C18 Stop And Go Extraction (STAGE) tip (bestaande uit 3 lagen C18 hars in een pipettip van 200 μL) door 100 μL van 100% acetonitril en centrifuge op 1.000 x g gedurende 2 minuten toe te voegen.
   2. Evenwicht van de C18 STAGE-tip door 50 μL buffer B (80% (v/v) acetonitril, 0,5% (v/v) azijnzuur) en centrifuge op 1.000 x g gedurende 2 minuten toe te voegen.
   3. Evenwicht van de C18 STAGE-tip door toevoeging van 200 μL buffer A (2% (v/v) acetonitril, 0,1% (v/v) trifluoracetinezuur, 0,5% (v/v) azijnzuur) en centrifuge bij 1.000 x g gedurende 3-5 min.
   4. Voeg ~ 50 μg verteerd monster toe aan de C18 STAGE-tip en centrifugeer gedurende 3-5 minuten bij 1.000 x g, of totdat het monster door de spinkolom is gegaan. Vries het resterende verteerd monster in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -20°C, tot het nodig is.
   5. Was de C18 STAGE tip met 200 μL Buffer A en centrifugeer gedurende 3-5 min op 1.000 x g.
   6. Voeg 50 μL Buffer B toe aan de C18 STAGE tip en centrifugeer gedurende 2 minuten op 500 x g. Verzamel geëuteerde peptiden in 0,2 ml PCR-buizen.
   7. Droog de geëuteerde peptiden in een vacuümcentrifuge gedurende 30-40 minuten op maximale snelheid. Volledig gedroogde monsters kunnen bij kamertemperatuur of bij -20 °C worden bewaard totdat ze zijn verwerkt.
      OPMERKING: Gedroogde en ontzoute peptiden zijn geschikte monsterinzendingen bij massaspectrometriefaciliteiten voor verwerking en kunnen bij omgevingstemperatuur worden verzonden.

6. Massaspectrometrie

1. Reconstitueer peptiden in 10 μL Buffer A en meet de concentratie die nodig is om ~1,5 tot 3 μg peptiden op de MS-kolom te injecteren. De hoeveelheid monster is afhankelijk van de instrumentatie.
2. Gebruik een vooraf bepaalde gradiënt van acetonitril (ca. 5-60%) in 0,5% azijnzuur gedurende een gewenste tijd (bijv. 2 uur) om peptiden te scheiden door hoogwaardige vloeistofchromatografie, gevolgd door elektrosprayionisatie in de massaspectrometer.
3. Verkrijg MS-scans met behulp van een massaspectrometer met hoge resolutie in de gegevensafhankelijke acquisitiemodus(m/z 300 tot 1650).
   OPMERKING: Het verlooppercentage en de lengte worden bepaald door het experiment en de gebruiker. Nauwkeurige massaspectrometerinstellingen zijn afhankelijk van instrumentatie, experiment en gebruikersvoorkeur.

7. Data-analyse

OPMERKING: MS-gegevens kunnen worden verwerkt met tal van bioinformaticapijplijnen. In dit protocol beschrijven we verwerking met behulp van de openbaar beschikbare MaxQuant- en Perseus-platforms, maar raden we individuele gebruikers aan om bioinformatische tools te evalueren die geschikt zijn voor de analyse, voorkeur en gebruik.

1. Laad onbewerkte gegevensbestanden (rechtstreeks vanaf het MS-instrument) met behulp van MaxQuant-software. Identificeer eiwitten onder de gewijzigde MaxQuant-zoekparameters; minimaal twee unieke peptiden die nodig zijn voor eiwitidentificatie met behulp van een doeldecoy-benadering voor een valse ontdekkingssnelheid van 1%, implementeren labelvrije kwantificering met matching tussen runs, bevatten het organisme FASTA-bestand verkregen uit de UniProt-database (d.w.z. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) om huidige peptiden te identificeren en te kwantificeren met de Andromeda-zoekmachine. Raadpleeg openbare MaxQuant online tools voor gedetailleerde tutorials (zie Tabel met materialen).
2. Upload het MaxQuant-uitvoerbestand ('eiwitgroepen.txt') naar Perseus.
3. Filter rijen met potentiële valse positieven en verontreinigingen, evenals alleen gewijzigd door site peptiden met de 'Filter rijen op basis van categorische kolom'.
4. Gegevenswaarden op log_2-schaal transformeren.
5. Maak gegevenssetgroepen door categorische annotatie aan de rijen te geven.
6. Filter gegevensset op geldige waarden om een cut-off voor eiwitdetectie te definiëren.
   OPMERKING: Voor een strenge en robuuste analyse wordt een identificatiepercentage van >50% voorgesteld. Als er bijvoorbeeld vier replica's zijn verwerkt, wordt een minimumaantal van drie geldige waarden geselecteerd.
7. Wijs desgevraagd gegevens toe door ontbrekende waarden uit de normale distributie te vervangen.
   OPMERKING: Toegerekende waarden worden geoptimaliseerd op basis van normale verdeling en bieden een willekeurige LFQ-intensiteit om tijdelijke aanduidingen voor 'NaN' te vervangen om typische overvloedsmetingen te simuleren. Deze toerekening biedt een platform voor downstream statistische analyse waarvoor kwantificeerbare gegevens nodig zijn.
8. Voeg annotaties toe aan de eiwitrijen (bijv. eiwitnamen, Gene Ontology-termen).
   OPMERKING: Deze gegenereerde Perseus-workflow is nu een robuust kader voor verdere bioinformatische verwerking, statistische analyse en gegevensvisualisatie, raadpleeg openbare Perseus online tools voor gedetailleerde zelfstudies (zie Tabel met materialen).

Results

Het hierboven beschreven protocol maakt identificatie en kwantificering mogelijk van eiwitten afkomstig van zowel de schimmelpathogene, C. neoformans, als de gastheer, macrofaagcellen, in één experiment. Na co-cultuur worden cellen samen verzameld en verwerkt en bio-informatisch gescheiden op basis van peptideprofielen die specifiek zijn voor elke soort. Dit is een krachtige aanpak voor het definiëren van het samenspel van de gastheer-pathogene relatie tijdens infectie. Het aantal eiwitten dat uit het experiment...

Discussion

Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer de voorbereiding van macrofaagcellen en het verzamelen van co-cultuurmonsters voor eiwitverwerking met minimale verstoring van de cellen. Het is belangrijk om stappen uit te voeren om hechtende macrofaagcellen voorzichtig en zorgvuldig te wassen, te inenten en te verwijderen om onnodige lyse van cellen voorafgaand aan de verzameling te voorkomen. Het vaststellen van de juiste MOI voor het experiment is ook van cruciaal belang, omdat het inenten met een te hoge MOI snelle m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	Bewaar bij 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6-well cell culture plate	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrile, MS grade	Pierce	TS-51101
Acetic Acid	Sigma Aldrich	1099510001
Acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Bereid een stockoplossing van 50 mM ABC, stabiel op kamertemperatuur gedurende maximaal een maand.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System	Fisher Scientific	13-717-300	Niet essentieel, serologische pipetten kunnen worden gebruikt om media te verwijderen.
C18 resin	3M Empore	3M2215
Cell Scrapers	VWR	10062-906	Niet essentieel, andere methoden om macrofaagcellen te bevrijden kunnen worden gebruikt.
Centrifugal vaccuum concentrator	Eppendorf	07-748-15
Complete Filtration Unit	VWR	10040-436
Conical falcon tubes (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Niet essentieel, hemocytometer kan als alternatief worden gebruikt.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Bereid een bulkoplossing van 1 M DTT, direct invriezen en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Gooi weg na elk gebruik (herhaaldelijk invriezen en ontdooien is niet toegestaan).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	10566016
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inactiveren door 30 minuten te incuberen bij 60°C. Bereid 50 ml aliquots en bevriest direct. Ontdooi voorafgaand aan mediavoorbereiding
Haemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Bereid 40 mM HEPES/8 M Urea in bulkoplossing, direct invriezen, bewaar bij -20°C tot gebruik. Gooi weg na elk gebruik (herhaaldelijk invriezen en ontdooien is niet toegestaan).
High-performance liquid chromatography system	ThermoFisher Scientific	LC140	De lengte van de gradiënt is gebaseerd op de complexiteit van het monster, aanbevolen 120 min gradiënt voor infectoom monsters.
High-resolution mass spectrometer	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Bereid een bulkoplossing van 0,55 M, direct invriezen, bewaar bij -20°C tot gebruik. Gooi weg na elk gebruik (herhaaldelijk invriezen en ontdooien is niet toegestaan).
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Kan worden verdeeld in aliquots en ingevroren voor opslag. Ontdooi voorafgaand aan mediavoorbereiding.
LoBind Microcentrifuge tubes	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant is een openbaar platform dat tutorials biedt, zoals de MaxQuant Summer School, waarin de computationele analyse stappen van grote MS data sets worden beschreven
Microcentrifuge	Eppendorf	13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k	VWR	CA12001-692	Kan worden verdeeld in aliquots en ingevroren voor opslag. Ontdooi voorafgaand aan mediavoorbereiding.
Peptide separation columns	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline	VWR	CA12001-676	Aankoop niet vereist. PBS kan ook worden bereid, maar steriele filtratie moet worden uitgevoerd voor gebruik.
Pierce BCA Protein Assay	ThermoFisher Scientific	23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
Probe sonciator	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet	Roche	4693159001
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE tipping centrifuge	Sonation	STC-V2
Thermal Shaker	VWR	NO89232-908
Trifluoroacetic acid	ThermoFisher Scientific	85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade	Pierce	A40007	Bewaar bij -20 °C.
Ultrasonic bath	Bransonic	A89375-450	Bewaard in koude ruimte (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Bereid 40 mM HEPES/8 M Urea in bulkoplossing, direct invriezen, bewaar bij -20 °C tot gebruik. Gooi weg na elk gebruik (herhaaldelijk invriezen en ontdooien is niet toegestaan).
Yeast-extract peptone dextrose broth	BD Difco	BM20