Methodenartikel

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

5.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61895

⸱

30 april 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Samenvatting

Complexe ziektemodellen vereisen geavanceerde hulpmiddelen die fysiologisch en pathologisch relevante, bruikbare inzichten kunnen leveren en anders onzichtbare processen kunnen onthullen. Geavanceerde celtests die nauw nabootsen in vivo landschappen vestigen zich als nieuwe manieren om het bidirectionele tumor-gastheer samenspel te visualiseren en te meten dat de progressie van kanker beïnvloedt. Hier beschrijven we twee veelzijdige protocollen om zeer controleerbare 2D- en 3D-coculturen in microdevices na te bootsen, waarbij de complexiteit van de tumormicro-omgeving (TME) wordt nagebootst, onder natuurlijke en door therapie geïnduceerde immunosurveillance. In sectie 1 wordt een experimentele setting geboden om kruisverwijzing tussen aanhangende tumorcellen en zwevende immuunpopulaties te monitoren, door middel van brightfield time-lapse microscopie. Als toepassingsscenario analyseren we de effecten van antikankerbehandelingen, zoals de zogenaamde immunogene kankerceldoodinductoren op de rekrutering en activering van immuuncellen. In sectie 2 worden 3D-tumor-immuunmicro-omgevingen geassembleerd in een concurrerende lay-out. Differentiële immuuninfiltratie wordt gemonitord door fluorescentiemomentopnamen tot 72 uur, om combinatietherapeutische strategieën te evalueren. In beide omgevingen worden beeldverwerkingsstappen geïllustreerd om een overvloed aan immuuncelparameters te extraheren (bijv. Immuuncelmigratie en interactie, reactie op therapeutische middelen). Deze eenvoudige en krachtige methoden kunnen verder worden afgestemd om de complexiteit van de TME te simuleren die de heterogeniteit en plasticiteit van kanker-, stromale en immuuncelsubtypen omvat, evenals hun wederzijdse interacties als aanjagers van kankerevolutie. De naleving van deze snel evoluerende technologieën met live-cell high-content imaging kan leiden tot het genereren van grote informatieve datasets, wat nieuwe uitdagingen met zich meebrengt. Inderdaad, de driehoek ''co-culturen/microscopie/geavanceerde data-analyse' zet de weg naar een precieze probleemparametrisatie die op maat gemaakte therapeutische protocollen kan helpen. We verwachten dat de toekomstige integratie van kanker-immuun on-a-chip met kunstmatige intelligentie voor high-throughput processing een grote stap voorwaarts zal betekenen in het benutten van de mogelijkheden als voorspellende en preklinische hulpmiddelen voor precisie en gepersonaliseerde oncologie.

Inleiding

De evolutie van verschillende takken van de geneeskunde als experimentele disciplines is afhankelijk geweest van het vermogen om celpopulatie en orgaanfuncties onder gecontroleerde omstandigheden te manipuleren1. Een dergelijk vermogen heeft zijn wortels in de beschikbaarheid van meetbare modellen die in staat zijn om processen in ons lichaam samen te vatten.

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering 2, moet de kankerbiologie profiteren van opkomende in vitro en computationele modellen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context 2,3.

De tumor micro-omgeving4 (TME) is een complex weefsel waar kankercellen continu interageren en dynamisch co-evolueren met de andere cellulaire (immuun-, stromale en endotheelcellen) en niet-cellulaire (de extracellulaire matrix, ECM) componenten. De dynamische aard van dit complexe landschap bepaalt of immuuncellen spelen als vrienden of vijanden van kwaadaardige cellen, waardoor zowel de ziekteprogressie als de respons op therapie sterk worden beïnvloed. Tegenwoordig komen grote inspanningen van onco-immunologen, bio-informatici en systeembiologische experts samen om de klinische betekenis van heterogeniteit van kanker 5,6 aan te pakken, hetzij in de ruimte (d.w.z. in verschillende tumorgebieden) en tijd (d.w.z. in verschillende tumorprogressiestadia)5,6, en om het fenotype en de functie van kanker en immuuncellen op eencellig niveau te karakteriseren. Als voorbeeld van deze synergie worden geavanceerde computervisietechnieken nu routinematig gebruikt voor het ruimtelijk in kaart brengen van immuuninfiltraat in histologische monsters 7,8.

Aan de voorkant van experimentele modellen, overbruggingsdierstudies en traditionele in vitro-methoden, geven ontwikkelingen in microfluïdica en co-kweektechnieken toegang tot verschillende klassen van micro-engineered cellulaire modellen zoals organoïden, microfysiologische systemen 9,10,11 (MPS) en organen-op-chip12,13,14 (OOC). Ze delen de gemeenschappelijke eigenschap om in te zoomen op het 'grote plaatje' van de cellulaire ecosystemen en het in vitro potentieel uit te breiden om micro-omgevingsfactoren te beheersen, terwijl ze gebruik maken van microscopie15 met een hoog gehalte en beeldverwerkingsbenaderingen.

Tegenwoordig zijn state-of-the-art MPS- en OOC-systemen begonnen immunologische aspecten op te nemen , waarbij verschillende subtypen immuuncellen in bestaande weefsels en co-culturen worden opgenomen, zodat een verscheidenheid aan processen zoals ontstekingsziekten, wondgenezing, mucosale immuniteit en reactie op toxines of dagelijkse voedingsproducten wordt onderzocht en gemeten16. TME-on-a-chip modellen 10,11,12,13,14,15,16,17, ook geïntegreerd met perfuseerbare microvessels 18,19,20,21, zijn ontwikkeld om celtype-afhankelijke interacties, fysische en chemische verstoringen en de cytotoxische activiteit van infiltrerende lymfocyten22, evenals klinisch relevante immunomodulerende middelen23.

Hier bieden we veelzijdige protocollen, variërend van het laden van cellen in chips tot beeldverwerkingstools, om geavanceerde tumor-immuun microfluïdische coculturen te benutten in 2D (sectie 1) en 3D (sectie 2) instellingen16, compatibel met dynamische, multiparametrische24 monitoring en visualisatie van cellulaire functies. Dit wordt bereikt met behoud van gebruiksgemak en flexibiliteit, zowel in monsterbeheer als gegevensanalyse, gebruikmakend van Fiji freeware-software en zijn toolboxen25,26.

Het microfluïdische apparaat, beschreven in sectie 1, is ontworpen om 2D-coculturen van aanhangende kanker en zwevende immuuncellen uit te voeren. Dit platform werd gevalideerd voor de in vitro meting van het gedrag van immuuncellen in aanwezigheid van genetische mutaties27 en/of immunodeficiënties28. Hier illustreren we stappen voor het volgen van immuuncellen in time-lapse bright-field-afbeeldingen, door gebruik te maken van een semi-automatische methode op basis van Trackmate (een plug-in geïmplementeerd in Fiji-software). Deze procedure maakt de extractie mogelijk van kinematische descriptoren van immuunmigratie 29 en respons (d.w.z. interactietijden) om kankercellen te targeten, al dan niet behandeld met immunogene celdoodinductoren27.

Belangrijk is dat deze parameters, geëxtraheerd uit tijdreeksafbeeldingen, kunnen worden verwerkt met geavanceerde wiskundige machines. Als voorbeeld van de potentie van deze benadering publiceerden onze groepen onlangs een analyse op basis van wiskundige methoden van stochastische processen en statistische mechanica om cellulaire netwerkeigenschappen te modelleren en een geparametriseerde beschrijving van immuuncelgedrag te geven (d.w.z. bevooroordeelde of niet-gecorreleerde willekeurige wandeling, sterk of niet gecoördineerde beweging30,31).

De 3D-instelling, die in de tweede sectie wordt verstrekt, is gebaseerd op een co-cultuurprotocol om complexere immunocompetente TME's ingebed in twee gelregio's met verschillende combinaties van celtypen en geneesmiddelen op een concurrerende manier te recreëren. Hier worden beeldverwerkingsstappen beschreven om, op verschillende tijdstippen, de infiltratie van gekleurde immuuncellen in menselijke A375M-melanoomcellen gekweekt in Matrigel te meten, om antitumormiddelcombinaties te evalueren32. A375M-lijn, een van A375P afgeleide cellijn gekenmerkt door een sterk gemetastaseerd fenotype, werd gekozen om hun metastatische vermogen te evalueren in de aanwezigheid van immuuncellen32.

De beschreven modellen kunnen volledig compatibel zijn met verschillende celbronnen (murine en menselijke vereeuwigde of primaire cellijnen, organoïden, xenografts, onder de anderen). In recente studies van ons lab, door high-content videomicroscopie te combineren met beeldanalyse, werd de competitieve 3D-lay-out toegepast om te onderzoeken: i) een anti-tumorale (antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit, ADCC) immuunrespons en ontleed de rol van fibroblasten in resistentie tegen trastuzumab-therapie in HER2 + borstkanker on-chip modellen33; ii) de werking van myeloïde cellen (d.w.z. kanker-geassocieerde macrofagen) in mechanismen van tumorontwijking en rekrutering van T-cellen34; iii) de werkzaamheid van immunotherapeutische regimes, specifiek gebaseerd op interferon-α-geconditioneerde dendritische cellen (IFN-DC's), gekweekt met met geneesmiddelen behandelde darmkankercellen in collageenmatrices, en om efficiënte beweging en de daaropvolgende fagocytosegebeurtenissen te evalueren35; iv) de chemotactische migratie van van beenmerg afgeleide eosinofielen naar met IL-33 behandelde of onbehandelde melanoomcellen36.

Deze geavanceerde modellen kunnen dienen als observatievensters voor het begrijpen van de rol van immuuncontexten bij kankermetastase en resistentiemechanismen, maar er zijn inspanningen nodig om bevindingen naar de klinieken te vertalen en de kloof met fundamenteel onderzoek te dichten37.

Als een opkomend scenario, het benutten van de kracht van geautomatiseerde high-content microscopie gekoppeld aan het gebruik van meer fysiologisch relevante microsystemen opent nieuwe potentiële uitdagingen voor de verwerking, verwerking en interpretatie van honderden, en zelfs duizenden, Gigabytes aan multiparametrische gegevens, die kunnen worden gegenereerd uit een enkele experimentele campagne. Dit impliceert een directe koppeling van OOC-experimenten met kunstmatige intelligentie 38,39,40,41,42 (AI)-gebaseerde algoritmen, zowel voor geavanceerde geautomatiseerde analyse als voor het genereren van functies die op hun beurt kunnen worden gevoed in silico-modellen van kanker-immuun samenspel 43, met spannende nieuwe toepassingen aan de horizon, zoals de ontwikkeling van voorspellende medicijnscreeningtests 44.

Een steeds groter wordende stroom van inspanningen is gericht op het ontwerp van ziektemodellen samen met de optimalisatie van strategieën om de grootschalige perturbatieschermen met eencellige multi-omics-uitlezingen te implementeren. Dit zal ongetwijfeld helpen bij de ontwikkeling en, hopelijk, de klinische implementatie, vergezeld van een passende mate van methodestandaardisatie, van een systematische onco-immunologie-op-een-chip-benadering om nieuwe inzichten te verkrijgen in immuunstoornissen en kankerverspreidingsmechanismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Chipontwerp voor hechtende en zwevende cellen 2D-coculturen

OPMERKING: De 2D-cocultuurlay-out (figuur 1A-C) wordt gekenmerkt door drie kamers (100 μm hoog) die onderling verbonden zijn door twee sets microkanaalarrays (500 x 12 x 10 μm3, L×B×H). De tussenliggende kamer vormt twee gesloten doodlopende compartimenten die zwevende immuuncellen blokkeren die tijdens de laadstap 2.5 overlopen naar de tumorplaats. Dit apparaattype is nuttig voor real-time bidimensionale metingen van eencellige (adhesieve of zwevende) motiliteit en van cel-cel interacties 16,27,28,30,31. Een typische celmigratiestudie (uitgevoerd van enkele uren tot meerdere dagen) combineert live-cell microscopie met beeldverwerkingsalgoritmen45, om de verkregen beeldsequenties te vertalen in numerieke kenmerken25. Op basis van de migratiepatronen kunnen verschillende biofysische indicatoren worden geschat, zoals de verplaatsing en snelheid van cellen, evenals de duur van immuuncel- en doelcelinteracties24.

  1. Bereiding van kanker- en PBMC-cellen
    1. Kankercelkweek
      OPMERKING: MDA-MB-231 triple-negatieve [oestrogeenreceptor (ER)-, progesteronreceptor (PR)-, en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-] menselijke adenocarcinoomcellen van de borst worden routinematig gekweekt in een Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IE ml−1 penicilline G natriumzout en 100 μg ml−1 streptomycinesulfaat (groeimedium), onder standaard kweekomstandigheden (37 °C en 5% CO2).
      1. Om de celkweekgroei te optimaliseren, plaat MDA-MB-231 cellen in 75 cm2 kolven met een dichtheid van 1 × 106 cellen ml-1 in 12 tot 15 ml groeimedium.
      2. Wanneer cellen de 75-80% van de samenvloeiing bereiken, gooit u het groeimedium weg, wast u cellen met voorverwarmde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om FBS volledig te verwijderen en maakt u ze vervolgens los met voorverwarmd trypsine (1 tot 2 minuten bij 37 °C).
      3. Voeg groeimedium toe om de enzymatische activiteit van trypsine te inactiveren en losgemaakte cellen te verzamelen. Was de cellen tweemaal gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij kamertemperatuur (RT).
      4. Tel cellen in een celtelplaat door middel van trypan blue kleurstofuitsluitingstest en zaai ze vervolgens opnieuw in voor onderhoudscultuur (voor niet meer dan 6 passages van ontdooien) of voor experimentele procedures.
      5. Voor microfluïdische experimenten, zaad 1 × 10 6 cellen in6-well platen in 3 ml groeimedium en ofwel behandelen met 25 μM doxorubicine (DOXO) of een gelijk volume DOXO oplosmiddel (PBS) als controle.
      6. Was vier tot 6 uur daarna doxo-behandelde cellen tweemaal met voorverwarmde PBS gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij RT.
      7. Tel doxo-behandelde en met PBS behandelde controlecellen zoals hierboven (zie stap 1.1.1.5) en stel de co-cultuur in met perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) in microfluïdische apparaten.
    2. PBMC-isolatie
      1. Verzamel veneus volbloed (ongeveer 10 ml) van gezonde vrijwilligers in gehepariniseerde injectieflacons en meng voorzichtig door de buis 2 tot 4 keer47 om te keren.
      2. Verdun bloed 1:1 met PBS en laag over 10 ml dichtheidsgradiënt medium Lymphoprep in een buis van 50 ml.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u de gelaagdheid heel voorzichtig en langzaam doet om bloed en lymfopam twee verschillende lagen te laten vormen.
      3. Centrifugebuizen gedurende 30 minuten bij 400 x g bij 4 °C in een uitklapbare bak zonder remmen. Vier verschillende lagen zullen zich vormen: (i) plasma aan de bovenkant, (ii) een witte en troebele laag met PBMC's, (iii) lymforep en (iv) een pellet van erytrocyten en granulocyten.
      4. Zuig voorzichtig PBMC's op met een pipet van 2 ml en resuspensie onmiddellijk in warm groeimedium (hetzelfde gebruikt in stap 1.1.1) en was tweemaal gedurende 5 minuten op 1.100 x g bij RT.
      5. Tel pmc's in pellets zoals hierboven (zie stap 1.1.1.5) en gebruik ze voor experimentele procedures of vries ze in voor langdurige opslag.
  2. De cellen plateren in 2D-chips
    OPMERKING: PBMC's zijn niet gekleurd in dit protocol. Om specifieke fenotypes op de chip te karakteriseren, kunnen immuuncelsubpopulaties worden geïsoleerd door immunomagnetische kralenselectie, gekleurd met fluorescerende celtrackers, opnieuw gemengd met de niet-gelabelde resterende fractie en dus geconfronteerd met doelkankercellen, zoals gerapporteerd in de on-chip experimenten, beschreven in Vacchelli et al.27, en in Racioppi et al.34.
    1. Voordat u begint met co-cultuurexperimenten en om de toevoeging van reagentia te vergemakkelijken, activeert u opgeslagen chips gedurende enkele seconden door een zuurstofplasmabehandeling. Vul reservoirs onmiddellijk met gedeïoniseerd water of PBS om PDMS-oppervlakken (polydimethylsiloxaan) hydrofiel te houden tot platingstappen.
      OPMERKING: PDMS is intrinsiek hydrofoob, wat kan leiden tot problemen bij het werken en bij het insluiten van luchtbellen in microkanalen. Zie stap 7 in het aanvullende dossier met details over de activering van zuurstofplasma.
    2. Steriliseer onder een UV-kast gedurende 20 minuten, was 2-3 keer met verse PBS en incubeer vervolgens gedurende 1 uur met kweekmedia. Bewaar chips in de incubator totdat u platingstappen uitvoert.
    3. Trek overtollige media uit alle zes reservoirs. Zorg ervoor dat u geen media uit de belangrijkste cultuurkamers opzuigt.
    4. Breng langzaam 1 × 105 kankercellen geresuspendeerd aan in 10-20 μL groeimedium in het reservoir linksboven en vervolgens in het onderste putje (figuur 1A, reservoirs 1 en 2). Wacht 5 minuten om cellen in de tumorkamer te laten hechten. Sommige cellen zullen zich nestelen en hechten in de reservoirs.
      OPMERKING: Plaats cellulaire ophanging naast de kanaalopeningen. Deze procedure wordt toegepast op MDA-MB-231 kankercellen, andere lijnen vereisen celdichtheidsoptimalisatie. Om de hechting van kankercellen te verbeteren, kan een coatingfunctionalisatie van oppervlakken (bijv. Poly-L-lysine, fibronectine) worden uitgevoerd. Raadpleeg eerder gepubliceerde protocollen voor coatingstappen16, 48,49,50.
    5. Aan de rechterkant pipetteer voorzichtig 1 × 106 PBMC's geresuspendeerd in 50 μL groeimedium in putjes 3 en 4 (zie figuur 1A, reservoirs 3 en 4).
      OPMERKING: Na het stromen zal PBMC zich in de tussenliggende kamer verspreiden en een "front" creëren, dat het startpunt van het experiment vertegenwoordigt.
    6. Vul alle zes reservoirs met maximaal 100-150 μL groeimedium. Controleer onder een microscoop of de cellen correct verdeeld zijn in de kweekcompartimenten zoals afgebeeld in figuur 1D-E. De uiteindelijke volumes kunnen variëren met de grootte van de reservoirs. Pas de volumes aan zodat deze in alle putten gelijk zijn.
    7. Plaats de chips ongeveer 1 uur terug in de incubator om het systeem te stabiliseren voordat de time-lapse-opname plaatsvindt. Voeg om de 3 dagen vers medium toe, omdat het kan worden blootgesteld aan verdampingsverliezen.
      OPMERKING: Het systeem is compatibel met zowel live/dead-cell analyse als dynamische multiplex cytokine secretieprofilering van geconditioneerde media. Voor chemokine-analyses kunnen tot 200-250 μL aliquots van supernatanten toegankelijk zijn door media te verzamelen uit de twee reservoirs van elk compartiment. Klassieke ELISA- en Luminex-cytokineprofileringstests vereisen ongeveer 50 μL supernatanten. Zie 51,52 voorbeelden van studies van andere laboratoria die cytokineprofilering uitvoeren op OOC-modellen.
  3. Time-lapse acquisitie van ongelabelde kanker en immuuncellen
    OPMERKING: Meestal zijn 3 chips gerangschikt op een enkele microscoopglaasje (zie Figuur 1A voor 2D-chip en Figuur 4B voor 3D-chip). Met behulp van podiumhouders die 4 dia's toewijzen, kunnen co-culturen geschikt zijn om te worden bewaakt door geautomatiseerde microscopie met een hoog gehalte om grote batches experimentele omstandigheden te analyseren. Chips kunnen eenvoudig worden gemonteerd op dia's met een dikte gelijk aan 1 mm of 170 micron (plastic of glazen coverslips, 6-well optische bodem multi-wells) voor confocale beeldvorming met hoge resolutie.
    1. Neem heldere veldbeeldreeksen van niet-gelabelde cellen op door middel van een videomicroscopie-opstelling uitgerust met een incubatiesysteem.
      OPMERKING: Hier werden tijdreeksgegevenssets (tijdvenster: 48 uur, framesnelheid: 2 min) verkregen met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een 4x-objectief en CMOS 1,3M-pixels, geoptimaliseerd om in een standaard celkweekincubator te passen.
    2. Warm de microscoop minstens 2 uur op om te balanceren tot 37 °C en 5% CO2 voordat u begint met de acquisitie.
    3. Selecteer het observatievenster door de microkanaalarray tussen de tumor en het centrale compartiment te centreren. Dit maakt het mogelijk om de dynamiek van immuuninfiltratie en de interacties binnen het gebied waarin kankercellen zijn gezaaid te visualiseren.
    4. Pas de verlichtingsintensiteit en focus van kanker- en immuuncellen aan.
    5. Voor het starten van time-lapse-acquisitie optimaliseert u de framesnelheid en tijdsduur op basis van het experiment en het celtype dat wordt bestudeerd.
      OPMERKING: De beeldcondities moeten worden geoptimaliseerd om overmatige fotobelichting te voorkomen met behoud van een goede signaal-ruisverhouding (SNR). Omdat immuuncellen zeer beweeglijk zijn, moet de acquisitieframesnelheid voldoende hoog zijn om het dynamische proces van interesse te volgen en eenvoudige tracking mogelijk te maken53. Er moet een compromis worden bereikt tussen het trackingalgoritme, de compatibiliteit met de grootte van de resulterende dataset en de levensvatbaarheid, dichtheid en beweeglijkheid van waargenomen cellen.
    6. Gebruik aan het einde van de time-lapse de functie Import Image Sequence en Save as van de ImageJ-software om de framegegevensset te converteren naar een ongecomprimeerd videobestand van 25 fps.
      OPMERKING: Het gegenereerde videobestand is nu klaar voor analyse van het bijhouden van cellen. Hier werden RGB (1280x1024 pixels) beelden verzameld met een ruimtelijke resolutie van 1,33 μm/pixel. Een film van 24 uur (stack van 3,5 GB) van één gezichtsveld (FOV) bestaat uit 720 frames voor elke voorwaarde.
  4. Data-analyse: Semi-automatische extractie van ongelabelde immuunsporen door Trackmate
    OPMERKING: Hier wordt immuunmotiliteitsanalyse in 2D-ongelabelde time-lapse-afbeeldingen uitgevoerd met TrackMate54, een open-source toolbox die beschikbaar is in de Fiji/ImageJ-softwarebundel (https://imagej.nih.gov/ij/). Er zijn verschillende algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde single-particle tracking uit te voeren55(SPT) van vlekachtige structuren. Ze zijn efficiënt toegepast op fluorescerende beelden, waarbij objecten helder zijn over een donkere achtergrond met een hoge SNR (d.w.z. fluorescerende vlekken met subresolutie, gelabelde verkeersblaasjes, kernen)1,25,56,57,58. SPT is voornamelijk gebaseerd op twee opeenvolgende stappen. Ten eerste worden objecten gelokaliseerd met geïdentificeerde posities in meerdere frames (segmentatie), zoals geschematiseerd inFiguur 2. In de tweede fase (deeltjeskoppeling) worden gedetecteerde vlekken over opeenvolgende frames gekoppeld om beweging te schatten en hun trajecten te reconstrueren, in de vorm van een spoor (Figuur 3). Numerieke kenmerken kunnen worden berekend uit elke geëxtraheerde X-, Y- en Z-coördinatenarray in de loop van de tijd. Uitgebreide documentatie wordt gerapporteerd in54evenals online (http://imagej.net/TrackMate), volgens de zelfstudie Aan de slag met TrackMate. De nauwkeurigheid van het proces kan onmiddellijk worden geïnspecteerd, met een intuïtieve grafische gebruikersinterface (wizard-achtige GUI) waarmee gebruikers bij elke stap instellingen kunnen aanpassen. In het volgende deel wordt kort beschreven hoe u Trackmate kunt gebruiken voor beeldverwerking en kwantificeringsstappen, toegepast op afbeeldingen met zichtbaar licht:
    1. Sleep de full-time video / afbeelding stapel op de Fiji werkbalk.
    2. Kalibratiestack instellen (Figuur 2A).
      1. Controleer de dimensionaliteit en wijs de afbeeldingseigenschappen toe door Afbeelding> Eigenschappen te selecteren. Vuleenheid van lengte, pixelafmetingen en frame-intervalvakken.
        OPMERKING: Gebruik voor het uitvoeren van de kalibratie de bekende lengte van de microkanalen (500 μm, figuur 1C) en deel door de overeenkomstige gemeten lengte in pixels. Voor 2D-tijdreeksen moet u het Z/T-veld verwisselen door 1 in te voeren als z-slice en het juiste aantal filmframes. Als dit niet wordt bereikt, worden trackmate kwantitatieve outputs en parameters gerapporteerd in pixeleenheden en tijdsbestekken.
    3. Voorbewerking van beelden.
      1. Om de juiste discriminatie van immuuncellen van een lawaaierige achtergrond te verbeteren, verwerkt u heldere veldbeelden vooraf om artefacten te compenseren. Zorg ervoor dat gegevenssets bestaan uit 8-bits TIFF-afbeeldingen (helderheidsbereik: 0-255).
        OPMERKING: Ongelijke verlichting, lage SNR en verontreiniging door kleine vuildeeltjes in beelden van zichtbaar licht kunnen het succes van een celvolgproces in gevaar brengen. Hier worden tijdreeksgegevenssets voorbewerkt door achtergrondaftrekking, helderheid / contrast aanpassingsfunctie en door lokale beeldaftrek van een Gaussiaanse onscherpte van originele afbeeldingen. Er zijn andere verschillende analysetoolkits beschikbaar in ImageJ voor het verwerken en segmenteren van fasecontrast- of helderveldafbeeldingen, waaronder Empirical Gradient Threshold (EGT)59.
    4. Eerste kalibratiepaneel (figuur 2A)
      1. Terwijl image stack is geselecteerd, start u Trackmate (Plugins>Tracking).  Herzie/bevestig de dimensionaliteit en het temporele venster van gegevens (d.w.z. pixelbreedte en frame-interval).
        OPMERKING: TrackMate leest automatisch in het vak met afbeeldingseigenschappen om de uiteindelijke trackingresultaten te geven in gekalibreerde fysieke eenheden (d.w.z. μm en minuten).
      2. Definieer een interessant gebied om de extractie van immuunsporen te berekenen door handmatig waarden in te voegen of door een gesloten gebied over de actieve afbeelding te tekenen en vervolgens op de knop Bron vernieuwen te drukken. Om globale immuunmigratiepaden te extraheren, selecteert u rechthoekige gebieden aan respectievelijk de rechterkant van microkanalen (centrale kamer, figuur 1E) en aan de linkerkant (tumorkamer, figuur 1D). Als u interacties tussen kanker en immuunhotspots wilt analyseren, tekent u cirkelvormige subregio's met behulp van ROI-tools (ga naar Bewerken → selectie → opgeven).
        OPMERKING: Wanneer u deze toolbox voor de eerste keer op een nieuwe biologische toepassing uitvoert, besteedt u de nodige tijd aan het optimaliseren van de instellingen voor het reconstrueren van de sporen.
        OPMERKING: Voer handmatige tracking van de celtrajecten (ongeveer 50-100 cellen) uit om empirisch de juiste configuratie te vinden en naast het valideren als benchmark de betrouwbaarheid van automatische extractie van bewegingen. Werk bovendien in eerste instantie op een kleiner gebied om de nauwkeurigheid van de gekozen parameters eenvoudig te controleren.
    5. Detectiestap immuunvlekken (figuur 2B)
      1. Selecteer de standaard Laplacian of Gaussian (LoG) detector. De LoG-detector werkt om heldere, blobachtige, ronde objecten te vinden en een Laplacian of Gaussian-filter toe te passen op het beeld dat is afgestemd op tussenliggende spotgroottes (5 tot 20 pixels in diameter).
      2. Voer bij Geschatte klodderdiameter (hier 10-13 μm) een waarde in die iets groter is dan de verwachte spotgrootte. Verhoog de drempelwaarde (hier 1-3 μm) totdat extra valse achtergrondvlekken worden verminderd, mogelijk zonder de objectkenmerken te verwijderen. Detecties onder de drempelwaarde (op basis van kwaliteitsstatistieken) worden verwijderd uit latere analyses. Vink het vakje aan voor het mediaanfilter en de subpixellokalisatie om de kwaliteit van de spotdetectie te verbeteren.
      3. Gebruik de knop Voorvertoning om geïdentificeerde immuuncellen te bekijken en snel te inspecteren die door magentakleurige cirkels over de afbeeldingen zijn gelegd.
        OPMERKING: Fouten tijdens de detectie hebben een aanzienlijke invloed op het koppelingsproces. Andere ongewenste detecties kunnen in de volgende menu's worden gecorrigeerd door door de gebruiker gedefinieerde filters (d.w.z. op spotintensiteit, grootte of positie).
    6. Zodra u tevreden bent met selecties, drukt u op Volgende.
      OPMERKING: Deze instellingen kunnen variëren afhankelijk van de experimentele opstelling en acquisitiebeeldvormingsmodaliteiten (bijv. FOV, objectieve vergroting, helderveld- of fluorescerende beelden), celtype (adherente of zwevende cellen), van langzame of snelle beweeglijkheid, soort cellulair gedrag (interactie of niet) en lage / gemiddelde / hoge dichtheid in het observatiegebied.
    7. Ga verder en sla het menu Initiële drempelwaarde over. Selecteer het venster Hyperstack Displayer.
    8. Stel filters in op het deelvenster Vlekken (afbeelding 2C).
      1. Selecteer: Uniforme kleur. Filters, zoals weergegeven in figuur 2C, kunnen worden toegevoegd om gelabelde vlekken met objectwaarden te behouden, weergegeven in een histogram, boven of onder een omkeerbare drempel.
    9. Tracker-selectiefase (figuur 3A). Kies de Simple LAP-tracker, als deeltjeskoppelingsalgoritme dat vraagt om drie velden in te vullen (in dit geval "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Deze detector beheert gap-closing events, waarbij de kostenkoppeling uitsluitend gebaseerd is op hun respectievelijke afstand.
      OPMERKING: De maximaal toegestane koppelingsafstand beperkt het ruimtelijke zoekbereik voor kandidaat-matchingplaatsen, wat overeenkomt met de maximaal toegestane verplaatsing tussen twee opeenvolgende frames (figuur 3D).
      1. Geef grotere waarden van maximale verplaatsing wanneer de fragmentatie van sporen van zeer beweeglijke deeltjes wordt opgemerkt.
        OPMERKING: Twee koppelingen worden niet verbonden als de frame-to-frame-beweging groter is dan de opgegeven maximale afstandswaarde. Als segmenten twee verschillende cellen slecht overbruggen, verlaagt u de waarde van maximale verplaatsing.
      2. Probeer ontbrekende plekken opnieuw te verbinden, waarbij de waarden van "de maximale afstand voor het sluiten van de opening" en "de maximale framekloof" worden gevarieerd.
        OPMERKING: Deze parameters hebben betrekking op gebeurtenissen die gapen sluiten in niet-aangrenzende frames. Vlekverdwijning kan optreden voor sommige frames (d.w.z. onscherpe deeltjes, cellen die weglaten en in de FOV, segmentatiefouten in een luidruchtig beeld).
        OPMERKING: Om splitsings- of samenvoegingsgebeurtenissen af te handelen, kiest u voor LAP-linker als detector die boetes voor het koppelen van kostenmatrix introduceert.
    10. Klik op Volgende om de trackingberekening uit te voeren. Druk op Volgende.
    11. Deelvenster Filtersporen (afbeelding 3B). Wijzig de kleur van immuunpaden en selecteer in het vervolgkeuzemenu "Track ID" of andere trackfuncties. Kies op dit punt optioneel om interactieve filters functioneel in te stellen, om de kwaliteit van het resultaat te verbeteren en de procedure opnieuw te bekijken.
      OPMERKING: Valse vlekken ontstaan door ruis in het beeld en verlies van functiekwaliteit. Dit genereert korte segmenten, terwijl interessante cellen over veel frames kunnen worden gevolgd.
      1. Als u korte paden wilt verwijderen, probeert u deze te filteren op basis van het aantal plekken dat ze bevatten. Sorteer bovendien tracks met behulp van een combinatie van opties zoals Track displacement, Track duration of Minimal/Mean/Maximum Velocity om valse of ongewenste tracks (met minder frames ten opzichte van de totale duur van time-lapse of met vuile of niet-bewegende deeltjes) uit te sluiten van verdere nabewerking.
        OPMERKING: De keuze van filters kan variëren afhankelijk van de specifieke toepassing en het biologische systeem.
    12. Bekijk alle tracks in de interface Weergaveopties, blader door de tijd en controleer hoe nauwkeurig tracks overeenkomen met celmigratiepaden. Het vervolgkeuzemenu biedt kleurcodes voor vlekken en paden voor eenvoudige visualisatie en filtering op verschillende modaliteiten (bijv. Kinetische parameters, intensiteit, tijdelijke of ruimtelijke positie).
      OPMERKING: Voor het volgen van culturen met een hoge dichtheid of cellen met een hoge beweeglijkheid, verhoogt u de acquisitieframesnelheid die de celverplaatsing in opeenvolgende tijdsintervallen minimaliseert.
    13. Handmatige correctie van segmentatie- en koppelingsfouten (figuur 3E).
      1. Om de kwaliteit van de resultaten verder te verbeteren, bewerkt u handmatig vlekken (puindeeltjes, stationaire cellen) en verwijdert u foutieve sporen die voortvloeien uit gedetecteerde tumorgrenzen bij het analyseren van tumor-immuuninteractie-ROIs.
      2. Selecteer eerst het gereedschap TrackMate op de werkbalk ImageJ. Om een bestaande plek in de hele stapel te elimineren, drukt u op shift en maakt u met de muiscursor een ROI-masker over de doelplek (bewerkt in een groene cirkel) en drukt u vervolgens op de DEL-toets.
      3. Voor het toevoegen van een nieuwe plek (in het geval van ontbrekende sporen als gevolg van het verdwijnen van vlekken) drukt u op de A-toets en legt u de muis op de puntige locatie. Herhaal het berekeningsproces voor het koppelen van tracks na deze stap.
    14. Als u tevreden bent, selecteert u Analyse in het deelvenster Weergaveopties om drie tekstbestanden te genereren (afbeelding 3C en 3F). De tabel in "Spots in tracks statistics" geeft de spatiotemporale coördinaten van immuunvlekken (X-Y-Z posities van de cellen gelabeld met het bijbehorende frame en track nummer). "Links in track statistics" en "Track statistics" bevatten informatie met betrekking tot de tracks: track duur, aantal gedetecteerde hiaten of spots, track initial en stop-frame, etc. Opslaan en exporteren voor elke gegevensset.
      OPMERKING: Wanneer u op een rij in de resultaatvensters klikt, wordt de betreffende plek, link of track geactiveerd in de time-lapse-video voor visuele inspectie. Herhaal de filterstappen om tracks te selecteren/verwijderen. Alle toekomstige geëxporteerde gegevens worden bijgewerkt. TIP: Track initiële en stop-frame en track duurwaarden kunnen worden gebruikt om de tijden van contact tussen kanker en immuuncellen te berekenen bij het verwerken van ROIs van interactie.
    15. Druk op de knop Opslaan om een XML-bestand te genereren dat alle parameterwaarden, het pad naar afbeeldingen en steunposities in de tijd bevat. De opdracht ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) herstelt de hele processessie voor elk filmbestand afzonderlijk.
    16. Ga naar het laatste deelvenster van de GUI met de naam Selecteer een actie. Gebruik in de lijst de functie Overlay vastleggen> Uitvoeren om een video te maken met tracks over elkaar heen. TIP: De optie "Plot N-spots vs time" kan worden gebruikt om de ruimtelijke dichtheid van immuuncellen in een ROI te berekenen (figuur 6B, rechterpaneel).
    17. Nabewerkingsanalyse en migratiestatistieken
      1. Analyseer de ruwe positionele gegevens rechtstreeks in Trackmate of exporteer gegevens om uitgebreide kinetische parameters29 te berekenen (d.w.z. totale trajectlengte, Euclidische afstand, opsluitingsverhouding, gemiddelde-kwadraatverplaatsing56, gemiddelde of momentane spoorsnelheid, arrestatiecoëfficiënt, verdeling van migratiehoeken, voorwaartse migratie-index, gemiddelde rechtlijnige snelheid) om immuuncelmigratiegedrag te classificeren (bijv. Gerichte of diffusieve beweging30, 31) en respons op doelkankercellen (bijv. behandeld versus controle).
        OPMERKING: Aanvullende nuttige plug-ins zoals The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) bieden verschillende grafieken (bijv. Rose of sectorplots, zoals afgebeeld in figuur 6) en statistische tests voor geavanceerde analyse en visualisatie van experimentele migratie- en chemotaxisgegevens. Het combineren van celtracerings- en celsegmentatie-algoritmen24,25,45 kan metingen van morfologische metrieken op het niveau van één cel mogelijk maken (d.w.z. celoppervlak, de lengte van de grote en kleine as en de hoogte-breedteverhouding van de cel).

2. 3D immuno-competent kanker on-chip model in een competitieve assay

OPMERKING: Het ontwerp van de 3D-chip, afgebeeld infiguur 4, bestaat uit 5 grote compartimenten: een centrale voor de inname van zwevende immuuncellen, twee zijgebieden voor het inbedden van tumorcellen in  hydrogelmatrices (150-250 μm hoog) en mediaperfusiekamers. Immuun- en tumorkamers zijn verbonden door twee sets smalle arrays van microkanalen (200×12×10 μm3, L×W×H, Figuur 4E). Regelmatig werken 100 μm verdeelde trapeziumvormige gelijkbenige micropillars (ongeveer 25-30 interfaces voor elk zijgelgebied, figuur 4C) als barrières om de geloplossing tijdens injectie op te sluiten, waarbij de balans tussen oppervlaktespanning en capillaire krachten60,61 wordt benut en tumorgebieden worden verbonden met de twee laterale extra mediakamers om een gel-vloeistofinterface in te stellen (figuur 5). De gedetailleerde kenmerken van de 3D-competitieve test zijn weergegeven in figuur 4. Preferentiële migratie van immuuncellen naar de twee hydrogelcompartimenten met tumorcellen die verschillende behandelingen hebben ondergaan, kan worden gevolgd en gekwantificeerd. De specifieke competitieve lay-out kan worden toegepast om een overvloed aan verschillende fenotypen van kankerbiologie te onderzoeken (bijv. Medicijnresistent versus agressief, primair of gemetastaseerd, responders versus non-responders). Bovendien kunnen de in gel ingebedde regio's gemakkelijk worden geïntegreerd met verschillende celpopulaties om meer heterogene TME's te recreëren, waaronder stromale componenten (fibroblasten, endotheelcellen)23 of om specifiek immunosuppressief milieu34 (bijv. Macrofagen) te simuleren voor het ontleden van mechanismen van geneesmiddelresistentie en tumorontwijking.
OPMERKING: Nucleaire en actieve caspasekleuring, door gebruik te maken van commerciële kits voor levende/dode assays (bijv. Thermo Fisher Scientific, Incucytenreagentia), kan worden geïmplementeerd om mitotische of apoptotische doodsgebeurtenissen te beoordelen, zoals gerapporteerd in Nguyen et al.33.

  1. Bereiding van matrixoplossing met cellen en laden in het apparaat
    OPMERKING: In de volgende experimentele setting bevatten de twee gelregio's mengsels van menselijke A375M melanoomcellijnen, gekweekt in matrixoplossing (bijv. Matrigel), blootgesteld aan therapeutische middelen die worden gebruikt als monotherapie of in combinatie. Deze instelling stelde ons in staat om de werkzaamheid van een combinatie van twee geneesmiddelen ten opzichte van afzonderlijke geneesmiddelen op een concurrerende manier te evalueren en hun vermogen om PBMC's aan te trekken te kwantificeren.
    1. Ontdooi een voorraad matrixoplossing (bijv. Matrigel) door een dag voor het experiment op ijs in een koelkast van 4 °C te plaatsen.
      OPMERKING: Stel het product niet bloot aan meerdere vries-dooicycli omdat het "klonterig" wordt. Andere synthetische of natuurlijke hydrogelprotocollen kunnen geschikt zijn om in deze setting te worden gebruikt. Zie 33,34,35 voor de bereiding van kankercellen in collageenmatrices.
    2. Resuspendie A375 menselijke melanoomcellen, gekleurd met live-compatibele PKH67 Green Fluorescent Cell Linker in matrixoplossing (2 mg ml-1). Voeg indien geïndiceerd, 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2,5 μM), aangeduid als DAC, en / of IFN-α2b (IFN) toe in de juiste doses32.
      OPMERKING: Match de Lot # op het matrixflesspecificatieblad. Bereken op basis van de concentratie het volume medium dat nodig is om tot 2 mg ml-1 te maken Pas de optimale eiwitconcentratie en de concentratie van kankercellen aan uw toepassing van belang aan.
    3. Pipetteer voorzichtig op en neer om het ontstaan van bubbels te voorkomen. Houd de microcentrifugebuis op ijs tijdens het mengen om ongewenste polymerisatie te voorkomen.
    4. Plaats de apparaten na sterilisatie op ijs (met behulp van een ijsemmer en deksel) om stolling van de matrixoplossing tijdens de hele procedure van celbelasting te voorkomen.
    5. Injecteer de twee IFN- en DAC/IFN Matrigel/tumorcelmengsels (2-4 μL) langzaam in de linker- en rechtergelpoort, respectievelijk met 10-μL micropipette met behulp van koude tips (figuur 5A). Oefen zachte druk uit om de matrixoplossing van de ene kant te duwen totdat de andere kant wordt bereikt.
      OPMERKING: Het volume van de matrixoplossing is gekozen om overloop in aangrenzende kanalen te voorkomen. Oefen geen overmatige pipetteerdruk uit om te voorkomen dat de oplossing in de media en centrale kanalen lekt. Als tijdens het laden het gelpad langs het kanaal wordt geblokkeerd, probeer dan de oplossing van de andere inlaat in te brengen totdat de gelfronten elkaar ontmoeten. Houd bij het verwijderen van de micropipet uit de inlaten de zuiger vast, anders zal de onderdruk de matrixoplossing opzuigen.
    6. Plaats het apparaat gedurende 30 minuten rechtop in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de matrixoplossing te laten branden (figuur 5B). Hanteer met zorg chips met ingebouwde ongepolymeriseerde gel om lekken uit het gelkanaal te voorkomen.
    7. Resuspendeer in de tussentijd PKH67-gelabelde PBMC's (1x106 cellen) in 10 μL complete DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium).
    8. Vul na matrixgelatie mediakanalen met (50-100 μL) hetzelfde aliquot kweekmedium in alle zes reservoirs om uitdroging van gel in de chips te voorkomen. Bewaren in de couveuse totdat de immuuncel suspensie zaait.
      OPMERKING: Controleer onder een microscoop de juiste en homogene verdeling van tumorcellen in de gel en de integriteit van de gepolymeriseerde gelbarrières. Gedeeltelijk of niet-uniforme gelvormige gebieden of bellen in het mengsel leiden tot het voortijdig stromen van PBMC's in gelmediakanalen aan het begin van het experiment als gevolg van drukinitiële fluctuaties.
    9. Zuig media uit de zes putten en plaats de punt in de buurt van de inlaat van een mediakanaal om voorzichtig te injecteren met pmc-celsuspensie onder matige druk. De temporele laadvolgorde is weergegeven in figuur 5C:
      1. PBMC's in 10 μL medium in de bovenste centrale put.
      2. 50-100 μL medium in elk van de vier putjes van laterale kanalen.
      3. 40-90 μL medium in de bovenste centrale put.
      4. 50-100 μL medium in de onderste centrale put.
    10. Zorg er onder een microscoop voor dat de verdeling van de PBMC's na de laadstap beperkt blijft tot de centrale kamer. (Figuur 7A).
      OPMERKING: Als het niet optimaal is, pas dan indien nodig de concentratie aan en herhaal de zaaistappen met behulp van ongerepte chips. Bij het berekenen van volumes voor de geplande experimentele omstandigheden, verwijzen naar een overmaat aantal chips (15-20%) om rekening te houden met mogelijke fouten en aanpassingen. Volumes en concentraties moeten worden geoptimaliseerd volgens de specifieke toepassing.
    11. Plaats geassembleerde apparaten op een vlak oppervlak in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor daaropvolgende fluorescentiebeeldvorming. Behandel met zorg chips na het laden van immuuncellen die drijven.
      OPMERKING: Compenseer verdampingsverliezen van volumes in reservoirs door media om de 2-3 dagen te vervangen. Voor chemokineprofilering kan tot 100 μL uit elk van de twee putjes van kweekcompartimenten worden aangezogen, zie stap 2.7 in stap 1.
  2. Geautomatiseerd tellen van gerekruteerde PBMC's in eenkanaals fluorescerende beelden in ImageJ
    OPMERKING: Klassieke methoden van immunofluorescentie voor confocale beeldvorming met hoge resolutie kunnen worden toegepast op on-chip operaties als eindpuntmetingen. De basiskleuringsprocedure omvat cel-on-chipfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding, kleuring van kernen met wasstappen ertussen. Niet-gelabelde immuuncellen geïnfiltreerd in 3D-gelregio's met ingebedde kankermicro-omgevingen kunnen op de gewenste tijdstippen worden gefixeerd en gekleurd voor expressiemarkers van activering / uitputting / rijping (bijv. Voor CD8-cellen, monitoring van CD69, CD95, PD1, TIM3-markers). In Parlato et al.35, fagocytose van SW620 apoptotische cellen werd geëvalueerd door confocale microscopie, met behulp van apparaten gemonteerd op 170 μm-dikke coverslips. IFN-DC's werden gekleurd en voegden on-chip anti-menselijke HLA-DR-FITC Ab aliquots toe.
    Om de omvang van geïnfiltreerde fluorescerend gekleurde levende immuuncellen te berekenen die worden uitgedaagd met concurrerende signalen, wordt een gemeenschappelijke beeldanalyseworkflow als volgt ingesteld (Figuur 7D-G):
    1. Verkrijg, op specifieke tijdstippen, fasecontrast en rood/groene kanalen fluorescentiemicrofoto's van de linker- en rechtergelregio's die tumorcellen bevatten die respectievelijk zijn blootgesteld aan enkele of combinaties van farmacologische regimes.
      OPMERKING: Hier werden beelden vastgelegd met een EVOS-FL fluorescentiemicroscoop na celbelasting (0 uur), na 48 uur en na 72 uur incubatie (figuur 7A-B). Een vergroting van 4x-10x werd gebruikt om de centrale kamer, de microkanaalarrays en de twee naast elkaar geplaatste zijkanalen met A375 plus IFN en A375 plus DAC / IFN te verkrijgen.
      1. Houd bij het uitvoeren van acquisitiebewerkingen rekening met de parameters die moeten worden gemeten en vermijd verzadiging van functies die moeten worden geteld. Optimale segmentatieresultaten zijn afhankelijk van de aard van de verkregen beelden, vanwege de variabiliteit in de biologische monsters zelf, de kwaliteit van de kleuring en de microscopietechnieken die worden gebruikt voor gebruikersgerichte toepassingen.
    2. Laad fluorescentie single-channel data (in dit geval rood = PBMC's), in Fiji door deze naar het hoofdvenster te slepen (Figuur 7D). Dupliceer de afbeelding om te voorkomen dat de onbewerkte gegevens worden overschreven tijdens de selectie van voorbewerkingsfilters tot de uiteindelijke segmentatie.
      1. Als de afbeelding een kleurenafbeelding (RGB) is, drukt u op Afbeelding > Type 8 of 16-bits om te converteren naar grijswaarden. Controleer of Opties voor bewerken > > Conversiesis ingesteld op schalen tijdens het converteren.
    3. Het voorbewerken van ruwe data via het opschonen van ruis en artefacten.
      1. Ga naar het menu Achtergrond verwerken > aftrekken door het rollende balalgoritme toe te passen om ongelijke ruisachtergrond met grote ruimtelijke variaties van intensiteiten te corrigeren. Stel de straal in op ten minste de grootte van het grootste voorgronddeeltje. Kies het vak Voorbeeld voor de procedure voor vallen en opstaan om optimale resultaten te verkrijgen. Te kleine waarden kunnen ten onrechte structuren van belang verwijderen.
      2. Sleep in de opdracht Helderheid en contrast de schuifregelaars Minimum/Maximum om het intensiteitsbereik in het histogram te wijzigen. Verschuif de schuifregelaar Maximum naar links om de helderheid te verhogen, zonder uitwasfuncties. Verplaats de dia Minimum naar rechts om het contrast van de afbeelding te verhogen en te voorkomen dat minder zichtbare kenmerken op de achtergrond verdwijnen. Klik op Toepassen om de wijzigingen op te lossen.
    4. Beeldverbetering.
      1. Ga naar Procesfilters > en experimenteer met de mediaan- en Gaussische filters op afbeeldingen (figuur 7E).
        OPMERKING: De voorfilterstraal moet worden aangepast aan de beeldruispixels. Het niet-lineaire mediaanfilter vervangt de pixelwaarde door de mediaanwaarde van buren, om zout-en-peperruis te verminderen. "Gaussian Blur" wordt gebruikt om een digitale foto vloeiender te maken, door pixels te vervangen door een gewogen gemiddelde van omringende pixels. De gewichten komen van de Gaussische kansverdeling, dus de dichtstbijzijnde pixels zijn invloedrijker.
      2. Ga optioneel naar Proces > wiskunde > gamma met aangevinkt vakje Voorvertoning om het contrast te verhogen.
        OPMERKING: Intensiteiten die in het B&C-paneel zijn ingesteld, worden geschaald tussen de twee min- en max-limieten. Waarden < 1.0 accentueren verschillen tussen lage intensiteiten, terwijl waarden > 1.0 verschillen tussen hoge intensiteiten accentueren. Gammacorrectie is functioneel om een weergavebereik te vinden, waarbij de zwakste objecten worden weergegeven zonder de helderste te verzadigen.
    5. Creatie van een binair afbeeldingsmasker.
      1. Ga naar afbeelding > pas > drempel aan. De meest eenvoudig gebruikte methode om drempels te bepalen is gebaseerd op histogramanalyse van intensiteitsniveaus, zoals weergegeven in figuur 7F. Speel in het vervolgkeuzemenu met verschillende algemene drempelmethoden (in ons geval wordt Otsu toegepast).
      2. Blader of typ handmatig een bekend bereik van pixelintensiteiten in de histogrampanelen, observeer de verandering van het rode patroon dat de afbeelding bedekt die meestal lijkt op het werkelijke celgebied. Met de knop Opnieuw instellen verwijdert u de overlay. Als u tevreden bent, klikt u op Toepassen om een binaire versie van de afbeelding te genereren. Schakel Opties voor binaire > verwerken > in om te bepalen hoe afbeeldingen met drempelwaarden worden weergegeven en hoe objecten worden geïdentificeerd door de deeltjesanalysator.
    6. Gebruik de menuopdracht Process/Binary/Watershed Particles om gedeeltelijk overlappende of samengevoegde deeltjes te delen tijdens de drempelwaarde. Watershed kan ze vaak nauwkeurig uit elkaar snijden door een 1-pixel dikke lijn toe te voegen. Voer morfologische bewerkingen uit zoals verwijden of eroderen om pixels te laten groeien of te verwijderen uit onder- of oververzadigde pixels.
      OPMERKING: Zie voor meer informatie de sectie Menuopdrachten of raadpleeg MorphoLibJ, een geïntegreerde bibliotheek op basis van wiskundige morfologie om binaire gegevens te verwerken.
    7. Beschrijving van kwantitatieve afbeeldingsfuncties.
      1. Zodra u een bevredigende objectherkenning hebt verkregen, opent u de deeltjesanalysator van Analyze > Analyze Particles. Deeltjes kunnen worden uitgesloten door hun grootte en circulariteit, uitgedrukt in pixels of in een gekalibreerde meeteenheid (controleer de juiste schaal ten opzichte van de microscoopinstellingen onder Afbeelding > Eigenschappen). Als u alles wilt opnemen, houdt u de standaardwaarde van 0-oneindigheid en het standaardbereik circulariteit op 0,00 - 1,00 (0 = rechte lijn, 1 = perfecte cirkel).
      2. Als u kleine ruispixels of functies die niet interessant zijn wilt filteren, stelt u het minimale en maximale bereik in. Schakel de opties Gaten, Weergeven, Overzicht en Resultaten weergeven in het vensterveld in. Met Uitsluiten op Randen worden deeltjes verwijderd die aan de randen van de afbeelding zijn gedetecteerd. Add to Manager voegt de verkregen selectie toe aan de ROI-manager voor verdere analyse met behoud van de positie-informatie van het deeltje.
        OPMERKING: In de "ROI Manager" is het mogelijk om de automatische segmentatie opgenomen uitvoer te corrigeren (gesplitste cellen samenvoegen, samengevoegde cellen splitsen). Selecteer, met behulp van selectietools in de Fiji-werkbalk, ROI's in beide gelregio's waar kankercellen zijn ingebed om immuuninfiltratie te schatten.
    8. Exporteer de verkregen waarden naar een spreadsheet om statistische analyses uit te voeren zoals weergegeven in figuur 7G. "Resultaten" geeft een gegevenstabel weer met betrekking tot genummerde geschetste deeltjeseigenschappen die zijn geïdentificeerd. "Samenvatten" opent een venster met de naam van de afbeelding, het totale aantal en andere informatie voor de hele afbeelding.
      1. Ga naar Metingen analyseren > instellen om een breed scala aan parameters op te nemen.
    9. Neem optioneel een macro op (door Plug-ins > Macro's > Record te selecteren) om de verwerkingsworkflow te automatiseren en tijd te besparen bij het analyseren van grote gegevenssets.
      1. Gebruik dezelfde verwerkingsroutine om het groene fluorescentiekanaal in dezelfde regio's te analyseren voor het analyseren van morfologische veranderingen van tumorcellen in 3D-regio's16

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tumorimmuuninfiltratie is een parameter van de antitumorrespons van de gastheer. Tumoren zijn heterogeen in de samenstelling, dichtheid, locatie en functionele staat van infiltrerende leukocyten die interacties met kankercellen kunnen ondersteunen klinisch relevante informatie om het ziekteverloop en de respons op de therapie te voorspellen. In die zin kunnen microfluïdische technologieën worden gebruikt als complementaire en bevoorrechte in vitro hulpmiddelen om de immuuncontext van tumoren te onderzoeken, evenals om de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methoden proberen een algemene benadering te ontwerpen om, met moduleerbare mate van complexiteit, twee belangrijke aspecten op het gebied van onco-immunologie samen te vatten, die kunnen profiteren van de toepassing van meer relevante in vitro modellen. De eerste heeft betrekking op de tumorcelpopulatiezijde, waar het aanpakken van enkelcellige kenmerken kan leiden tot een betere beschrijving van heterogeniteit en gecorreleerde biologische en klinische betekenis, waaronder resistentie tegen therapie, prope...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen. AS wordt ondersteund door de Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) en Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS en FM worden ondersteund door de Italiaanse vereniging voor kankeronderzoek (AIRC) nr. 21366 tot G.S.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celkweekmateriaal 
50 mL buizenCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828centrifugebuizen
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-hypomethyleringsmiddel
6-well platenCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506kweekschalen
75 cm2 celkweek behandelde flaconCorning, New York, NY430641Ukweekflacons
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		menselijke melanoomcellijn
Doxorubicine hydrochlorideMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515anthracycline antibioticum 
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milaan, ItaliëECM0728LKweekmedium voor SK-MEL-28  cellen
Dulbecco's Fosfaat Bufferoplossing zonder Calcium zonder MagnesiumEuroClone Spa, Milaan, ItaliëECB4004Lzoutoplossing
Fetaal RundserumEuroClone Spa, Milaan, ItaliëECS0180Laanvullend voor celkweek
FicollGE-Heathcare17-1440-02scheiding van mononucleaire cellen uit menselijk bloed. 
hemocytometerNeubauerCelteller
Heparine flesjesThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFlesjes voor veneuze bloedafname
interferon alfa-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595recombinant humaan cytokine
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milaan, ItaliëECB3000Daanvullend voor celkweek
Vloeibare stikstof
Lympholyte celscheidingsmediumCedarlane Labs, Burlington, Canadascheiding van lymfocyten door dichtheidsgradiëntcentrifugatie
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Noorwegen
MatrigelCorning, New York, NY354230groeifactor verminderde basement membraanmatrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA HTB-26menselijke borstkankercellijn
Penicilline/ Streptomycine 100X  EuroClone Spa, Milaan, ItaliëECB3001Daanvullend voor celkweek
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Vloeistofveiligheid
PKH26 Rood Fluorescerend cel linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLrood fluorescerende celkleurstof
PKH67 Groen fluorescerende cel linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgroen fluorescerende celkleurstof
RPMI-1640EuroClone Spa, Milaan, ItaliëECM2001LKweekmedium voor MDA-MB-231 cellen
serologische pipetten (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490Vloeistofveiligheid
steriele tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milaan, ItaliëECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005tips voor micropipet
Timer
Trypan Blauw oplossingThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061celkleurstof om cellevensvatbaarheid te beoordelen
TrypsineEuroClone Spa, Milaan, ItaliëECM0920Ddissociatiereagens voor adherente cellen
Celkweekapparatuur
EVOS-FL fluorescentiemicroscoopThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluorescentiemicroscoop voor levende cellen
Bevochtigde celkweekincubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230Incubatie van celculturen bij 37 °C, 5% CO2
Juli MicroscoopNanoentek
Laboratoriumkoelkast (4 °C)FDM
Laboratoriumveiligheidskast (Klasse II)Steril VBH 72 MPLaminare stromingskast
Optische microscoopZeiss
KoolstofcentrifugeBeckman Coulter
Thermostaatbad
Microfabricagematerialen 
3-Aminopropyl)triethoxysilaan (Aptes)Sigma AldrichA3648silaniseringsmiddel voor het verbinden van PDMS met plastic dekglas
Chroom kwartsmaskers / 4"x4", HRC / Geen AZ MB W&A,  Duitslandoptische maskers voor fotolithografie
Glasdekglas, D 263 M Schott glas,  (170 ± 5 µm)Ibidi, Duitsland10812
Waterstofperoxide oplossing 30%Carlo Erba Reagents412081reagentia voor piranha oplossing
Methyl isobutyl ketonCarlo Erba Reagents461945PMMA e-beam resist developer
Microscoop Glasplaten (Verpakking van 50 platen) 76,2 mm x 25,4 mm Sail Brand7101substraten voor het verbinden van chips
Miltex Biopsie Punch met Plunger, ID 1,0 mmTedpelladermale biopsie punches voor chip reservoirs
PMMA  950 kDaAllresist,DuitslandAR-P. 679

Referenties

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282(2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235(2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639(2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737(2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450(2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093(2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664(2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217(2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985(2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789(2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014(2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16(2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tumorimmuuncrosstalkrekrutering van immuuncellenlichtveldmicroscopiefluorescentiemicroscopiebeeldverwerkingsanalyseantikankerbehandelingen3D tumormodellive cell imagingimmuuncelmigratie

Gerelateerde artikelen