Neutronenkristallografie Gegevensverzameling en -verwerking voor het modelleren van waterstofatomen in eiwitstructuren

Summary

Neutroneneiwitkristallografie is een structurele techniek die de lokalisatie van waterstofatomen mogelijk maakt, waardoor belangrijke mechanistische details van de eiwitfunctie worden verstrekt. We presenteren hier de workflow voor het monteren van een eiwitkristal, neutronendiffractiegegevensverzameling, structuurverfijning en analyse van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten.

Abstract

Neutronenkristallografie is een structurele techniek die het mogelijk maakt om waterstofatoomposities in biologische macromoleculen te bepalen, wat mechanistisch belangrijke informatie oplevert over protonatie- en hydratatietoestanden zonder stralingsschade te veroorzaken. Röntgendiffractie daarentegen geeft slechts beperkte informatie over de positie van lichtatomen en de röntgenstraal induceert snel stralingsschade van lichtgevoelige cofactoren en metaalcentra. Hier wordt de workflow gepresenteerd die wordt gebruikt voor de IMAGINE- en MaNDi-bundellijnen in het Oak Ridge National Laboratory (ORNL) om een neutronendiffractiestructuur te verkrijgen zodra een eiwitkristal van geschikte grootte (> 0,1 ^mm3) is gekweekt. We demonstreren de montage van gehydrogeneerde eiwitkristallen in kwartscapillairen voor het verzamelen van neutronendiffractiegegevens. Ook wordt het dampuitwisselingsproces van de gemonteerde kristallen met _{D2O-bevattende} buffer gepresenteerd om te zorgen voor vervanging van waterstofatomen op verwisselbare locaties door deuterium. De opname van deuterium vermindert de achtergrond die ontstaat door de onsamenhangende verstrooiing van waterstofatomen en voorkomt dichtheidsannulering veroorzaakt door hun negatieve coherente verstrooiingslengte. Strategieën voor het uitlijnen van monsters en het verzamelen van kamertemperatuurgegevens worden geïllustreerd met behulp van quasi-Laue-gegevensverzameling bij IMAGINE in de Hoge Flux Isotope Reactor (HFIR). Bovendien wordt kristalmontage en snelle bevriezing in vloeibare stikstof voor cryo-gegevensverzameling om labiele reactietussenproducten te vangen gedemonstreerd op het MaNDi time-of-flight-instrument bij de Spallation Neutron Source (SNS). De voorbereiding van de modelcoördinaat- en diffractiegegevensbestanden en visualisatie van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten (SLD) zullen ook aan bod komen. Structuurverfijning tegen neutronengegevens-only of tegen gezamenlijke röntgen- / neutronengegevens om een volledig atomaire structuur van het betreffende eiwit te verkrijgen, zal uiteindelijk worden besproken. Het proces van het bepalen van een neutronenstructuur zal worden gedemonstreerd met behulp van kristallen van de lytische polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, een koperhoudend metalloproteïne dat betrokken is bij de afbraak van recalcitrante polysacchariden via oxidatieve splitsing van de glycosidische binding.

Introduction

Neutronen macromoleculaire kristallografie is een techniek die een uniek venster biedt op de structuur en onderliggende chemie van eiwitten. Conceptueel vergelijkbaar met röntgendiffractie, biedt neutronendiffractie atomistische details van de macromoleculaire structuur, maar de interactie van neutronen met kernen maakt lokalisatie van lichtatomen mogelijk, vaak moeilijk te detecteren met röntgendiffractie1. Tijdens röntgendiffractie verstrooien röntgenstralen vanuit de elektronenwolk, waardoor lichtatomen zoals waterstof (H) slecht zichtbaar zijn in elektronendichtheidskaarten die geen resolutie in de buurt van sub-Ångström ^hebben2. De verstrooiingsintensiteit van neutronen hangt daarentegen af van complexe interacties met de kern, waarbij isotopen van hetzelfde element verschillende verstrooiingslengten vertonen. Daarom hebben lichte atomen en hun isotopen, zoals waterstof (^1H) en deuterium (^2H of D), een vergelijkbare zichtbaarheid als de ruggengraat koolstof-, stikstof- en zuurstofatomen in neutronenverstrooiingslengtedichtheid (SLD) kaarten. Bovendien, aangezien de grootte van neutronenverstrooiing onafhankelijk is van het aantal elektronen, wordt verstrooiing van lichte elementen niet verduisterd door zware elementen wanneer ze zich dicht bij elkaar bevinden, zoals wordt waargenomen bij röntgenverstrooiing. De verbeterde zichtbaarheid van H en zijn isotoop D bij het gebruik van neutronendiffractie levert waardevolle informatie op over de protonatietoestand van katalytisch belangrijke residuen, cofactoren en liganden en helpt de oriëntatie van watermoleculen, waardoor belangrijke informatie over katalytische mechanismen en eiwitchemie ^{wordt onthuld3}. Neutronendiffractie biedt ook het voordeel dat het een niet-destructieve techniek is, met name geschikt voor biologische monsters die gevoelig zijn voor ionisatie, zoals eiwitten met metaalcentra of lichtgevoelige redoxcofactoren2. De primaire focus van dit artikel is om een overzicht te geven van de workflow om een hoogwaardige neutroneneiwitkristalstructuur te verkrijgen. We verwijzen de geïnteresseerde lezer naar Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 en O'Dell et ^al.3 voor een uitstekend overzicht van neutroneneiwitdiffractie en Ashkar et ^al.7 voor verdere toepassingen van neutronenverstrooiing.

Neutronen worden voornamelijk gegenereerd tijdens kernreacties waarbij gebruik wordt gemaakt van een van de twee processen: kernsplijting bij reactorbronnen of spallation bij versnellerbronnen8. Reactorbronnen leveren een continue neutronenbundel door gebruik te maken van kernsplijting van de ^235U-isotoop, terwijl spallation neutronenbronnen een gepulseerde neutronenbundel produceren door een doelwit, bijvoorbeeld een vloeibaar metaal zoals kwik, te bombarderen met ^protonen9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) in Oak Ridge, Tennessee, herbergt zowel een steady-state neutronenbron in de High Flux Isotope Reactor (HFIR) als een 60 Hz gepulseerde bron bij de Spallation Neutron Source (SNS). De IMAGINE-bundellijn, gelegen aan de HFIR, is een neutronendiffractometer geoptimaliseerd voor biologische macromoleculen (aanvullende figuur 1)¹⁰. IMAGINE maakt gebruik van een neutronenbeeldplaatdetector om quasi-Laue-gegevens te meten met behulp van een smalle banddoorgang in het bereik van 2,8 - 4,5 Å van enkele kristallen met eenheidscelranden <150 Å. De Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), gelegen op het SNS, is een time-of-flight (TOF) Laue neutronendiffractometer uitgerust met een sferisch detector array frame (DAF) (Aanvullende figuur 2)¹¹. MaNDi meet gegevens van enkele kristallen met eenheidscelranden in het bereik van 10 - 300 Å door een instelbare 2 Å-golflengtebandbreedte tussen 2,0 - 6,0 ^{Å12 te} gebruiken.

Het proces van het genereren van neutronen is zeer energie-intensief, wat resulteert in relatief zwakke neutronenbundelfluxen in tegenstelling tot röntgenstraalfluxen bij synchrotronbronnen13. Om te zorgen voor voldoende signaal-ruisverhoudingen tijdens het verzamelen van gegevens, is het noodzakelijk om kristallen van geschikte grootte en kwaliteit te laten ^groeien14. Doorgaans zijn kristallen met volumes > 0,1 ^mm3 nodig om gegevens te verzamelen met adequate ^{statistieken15}. Naast lagere fluxen moet rekening worden gehouden met de inherente eigenschappen van de interactie tussen neutronen en de ^{monsterkernen16}. De verstrooiingslengte van neutronen verschilt voor isotopen van hetzelfde element, een eigenschap die voordelig kan worden gebruikt in small angle neutron scattering (SANS) om gebieden van een monster te maskeren of te markeren - een proces dat bekend staat als ^{contrastmatching17}. In diffractie-experimenten kan de negatieve coherente neutronenverstrooiingslengte van H (-3,741 fm voor ^1H) leiden tot annulering van neutronenverstrooiingsdichtheidskaartkenmerken, omdat de coherente neutronenverstrooiingslengten van andere biologisch relevante atomen, waaronder koolstof (6,6511 fm voor ^12C), stikstof (9,37 fm voor ^14N), zuurstof (5,803 fm voor ^16O), fosfor (5,13 fm voor ^31P) en zwavel (2,804 fm voor ^32S) zijn positief (tabel 1)^12,14. Bovendien verhoogt de grote onsamenhangende verstrooiingslengte van H (25.274 fm) de achtergrond tijdens het verzamelen van gegevens, waardoor de kwaliteit van de dataset wordt belemmerd en de gegevensresolutie in gevaar ^komt7. Om deze door H ingevoerde beperkingen te omzeilen, is het voor neutronendiffractie noodzakelijk om H in te ruilen voor zijn isotoopdeuterium, ^2H(D), dat een positieve coherente neutronenverstrooiingslengte heeft (6,671 fm) en een aanzienlijk lagere onsamenhangende verstrooiingslengte (4,04 fm)¹⁹. Dit kan worden bereikt door perdeuteratie, een proces waarbij het eiwit wordt uitgedrukt door organismen die zijn gekweekt in volledig gedeutereerde media die zorgen voor volledige opname van D op ^H-locaties20. Het is ook mogelijk om eiwit gedeeltelijk te deutereren door H uitsluitend op de verwisselbare plaatsen (titreerbare groepen) door H te vervangen door D, terwijl de niet-uitwisselbare koolstofgebonden locaties gehydrogeneerd ^blijven21. Dit kan worden bereikt door groei van gehydrogeneerde eiwitkristallen in gedeutereerde ^moederloog22. Meestal wordt de H/D-uitwisseling van gehydrogeneerde eiwitten echter uitgevoerd door dampuitwisseling na groei van voldoende grote kristallen in _{H2O-gebaseerde} ^buffer23. In dergelijke gevallen worden kristallen gemonteerd in een kwartscapillair en damp-gebalanceerd met een op _D20 gebaseerde moederloog.

De beperkte neutronenfluxen bij neutronenbronnen resulteren in langere dataverzamelingstijden, variërend van dagen tot enkele ^weken24. Bij ORNL gebruiken zowel IMAGINE als MaNDi een smalle golflengtebandpass in het bereik van 2-6 Å om de gegevensverzameling te ^{optimaliseren25}. Gegevens kunnen worden verzameld bij kamertemperatuur of bij cryo-temperatuur. Cryo-dataverzameling kan de datakwaliteit mogelijk verbeteren en opent de mogelijkheid voor freeze-trapping katalytische tussenproducten. Na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens wordt meestal een röntgendataset verzameld op hetzelfde kristal bij dezelfde temperatuur of op een kristal dat onder identieke omstandigheden is ^gekweekt26. Gegevensverzameling bij dezelfde temperatuur maakt het mogelijk om structuurverfijning uit te voeren tegen zowel röntgen- als neutronengegevens, waardoor mogelijke door de temperatuur geïnduceerde artefacten zoals veranderingen in de zichtbaarheid en positie van wateren of de bezetting van residuen met alternatieve conformaties ^{worden voorkomen27}. Gezamenlijke verfijning van röntgenneutronengegevens verhoogt de data-tot-parameterverhouding en biedt het voordeel dat de coördinaten van de eiwitruggegraat kunnen worden verfijnd ten opzichte van de röntgengegevens, terwijl de neutronendiffractiegegevens worden gebruikt om de positie van de H / D-atomen te ^verfijnen28. Dit is vooral handig bij het gebruik van gedeeltelijk gedeutereerde monsters, waarbij dichtheidssanering als gevolg van H-atomen op niet-uitwisselbare plaatsen op het eiwit aanwezig is. Hoewel het aantal röntgenstructuren veel groter is dan het aantal neutronenstructuren dat in de Protein Data Bank (PDB) is gedeponeerd, zijn softwarepakketten die oorspronkelijk waren ontworpen voor de verfijning van röntgengegevens uitgebreid met neutronengegevens3,29,30. Na gegevensverzameling kunnen modellen worden verfijnd met behulp van verfijningspakketten zoals phenix.refine, CNSsolve (nCNS) of SHELXL28,31,32,33. Tijdens het verfijningsproces kunnen neutronenverstrooiingsdichtheidskaarten worden gevisualiseerd voor handmatige aanpassing met behulp van ^COOT34. Na de structuuroplossing kunnen de coördinaten en de neutronen- en/of röntgendiffractiegegevensbestanden worden ingediend bij het VOB, dat het model zal valideren en deponeren, waardoor het beschikbaar wordt gesteld voor het publiek18,29,30.

Structurele analyse van eiwitten is een veelzijdige benadering waarbij tal van technieken worden gebruikt om hun functie en mechanisme te ^{onderzoeken35}. Neutroneneiwitkristallografie biedt waardevolle chemische inzichten om bevindingen uit aanvullende studies zoals röntgendiffractie, spectroscopie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) of microkristalelektronendiffractie (microED) uit te breiden en aan te ^vullen36. Neutroneneiwitdiffractie is uniek gepositioneerd om inzicht te geven in enzymatische mechanismen, omdat H-atomen centraal staan in hun chemie. De afwezigheid van stralingsschade veroorzaakt door neutronen maakt ze tot een sonde die uitzonderlijk geschikt is voor de studie van ^{metalloproteïnen37}. We presenteren hier een representatief voorbeeld van het proces van neutroneneiwitdiffractie van monstervoorbereiding tot gegevensverzameling, verfijning en analyse (figuur 1). Kristallen van voldoende grootte voor neutronendiffractie-experimenten zijn gekweekt van het metalloproteïne Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D is een koperhoudend metalloproteïne dat betrokken is bij de afbraak van recalcitrante cellulose door het inbrengen van zuurstofatomen in de glycosidische ^binding38,39. De ncLPMO9D actieve site bevat een mononucleair kopercentrum binnen een karakteristieke "histidine-brace" bestaande uit de N-terminale histidine en een tweede geconserveerde histidine (aanvullende figuur 3)⁴⁰. De N-terminal van schimmel-LPMOs is gemethyleerd, maar de post-overgangsmodificatie treedt niet op tijdens recombinante expressie in gist. In de NcLPMO9D-rusttoestand is het kopercentrum aanwezig in een ^Cu2+ oxidatietoestand en wordt geactiveerd door enkele elektronenreductie tot ^Cu1+, waardoor moleculaire zuurstof kan binden en geactiveerd kan worden door snel te worden gereduceerd tot een superoxidesoort41,42. De totale NcLPMO9D-reactie vereist verdere toevoeging van één elektron en twee protonen om het gehydroxyleerde polysaccharideproduct te ^vormen43. De identiteit van de geactiveerde zuurstofsoorten die verantwoordelijk zijn voor waterstofatoomabsorptie (HAA) uit het polysaccharidesubstraat is niet geïdentificeerd en intensieve structurele en computationele studies zijn momenteel aan de ^gang44,45. Gezien de redoxchemie op de actieve locatie van NcLPMO9D is beperking van stralingsschade bijzonder relevant. We illustreren hier de verzameling van kamertemperatuur- en cryotemperatuurgegevens over NcLPMO9D-kristallen om de NcLPMO9D-structuur te bepalen in respectievelijk de rusttoestand en in de geactiveerde gereduceerde ^vorm46. De nadruk zal worden gelegd op het monteren van eiwitkristallen, het opzetten van beamline-instrumenten voor gegevensverzameling, de voorbereiding van de gegevens- en coördinatenbestanden en de verfijningsstappen die nodig zijn om een neutronenstructuur met alle atomen te modelleren.

Protocol

1. Evaluatie van de kristalgrootte

1. Meet de grootte van de kristallen met behulp van een microscoop uitgerust met normaal en gepolariseerd licht. Selecteer kristallen met een minimumvolume van ~0,1 ^mm3 (aanvullende figuur 4).
2. Label putten met voldoende grote kristallen en noteer de kristallisatieomstandigheden die worden gebruikt om deze kristallen te genereren.

2. Bereiding van de gedeutereerde kristallisatiebuffer

1. Los kristallisatiebuffercomponenten op in _D2O om gedeutereerde kristallisatiebuffer te genereren.
2. Pas de pH van de buffer aan door de pD van de oplossing te berekenen met behulp van de volgende vergelijking:
   (1)
   waarbij _pHmeas de pH is die wordt gemeten met een standaard glaselektrode. De oorspronkelijke pH van de NcLPMO9D kristallisatiebuffer was 6,0, daarom zullen we een _pHmeas van 5,6 gebruiken voor de gedeutereerde kristallisatiebuffer bij pD 6,0.
3. Dompel de elektrode van de pH-meter vóór gebruik tien minuten onder in _D2O (aanvullende figuur 5).
4. Stel de _pHmeas in op 5,6 met behulp van de base NaOD of het zuur DCl.

3. Kristal oogsten

1. Plaats gesiliconiseerde 22 mm ronde glasplaten naast de kristallisatiebak waaruit kristallen worden geoogst. Gebruik een schone glasplaat per kristal (figuur 2A).
2. Open de afgesloten sandwichdoos met de eiwitkristallen in de 9-wells groot volume gesiliconiseerde glasplaat.
3. Verwijder 10-20 μL uit de kristallisatiereservoiroplossing met een micropipette en plaats de oplossing op de glasplaat (figuur 2B).
4. Oogst het kristal met behulp van een microloop van de juiste grootte en plaats het kristal in de reservoiroplossingsdruppel op de glasplaat om vuil te verwijderen dat vaak samen met het kristal wordt geoogst (figuur 2C en figuur 2D).
   OPMERKING: Het zal nodig zijn om snel te werken, omdat de druppeltjes met een klein volume kunnen verdampen. Geoogste kristallen lopen ook het risico uit te drogen wanneer ze worden blootgesteld aan de atmosfeer. Het kan nodig zijn om wat reservoiroplossing aan de eiwitdruppel toe te voegen om te voorkomen dat kristallen uitdrogen in kleine kristallisatiedruppelvolumes.

4. Kristal montage

OPMERKING: Capillaire montageprotocollen variëren met experimentele voorkeuren. Om schade aan kristallen te voorkomen, moeten haarvaten die moeten worden ingekort, worden gescoord met een snijsteen of schuurpapier om een soepele breuk te garanderen.

1. Vul het ene uiteinde van een kwartscapillair met een diameter van 2 mm met een lengte van 50 mm met reservoirbuffer door capillaire werking of door ~10 μL reservoirbuffer rechtstreeks in het capillair te pipetteren (figuur 3A).
   OPMERKING: Gebruikers worden aangemoedigd om gebruik te maken van kwarts capillaire buizen omdat, naast de mechanische sterkte, het essentieel is om de absorptie van neutronenbundels en lagere achtergrondbijdragen van het capillair te beperken. Glazen haarvaten introduceren een hoge achtergrond en absorberen neutronen, waardoor de gegevenskwaliteit in gevaar komt.
2. Plaats het kristal voorzichtig in de reservoirbuffer in het kwartscapillair met behulp van de montagelus (figuur 3B en figuur 3C).
3. Tik voorzichtig op de buis om de reservoirbuffer en het daarin ondergedompelde kristal door het capillair te bewegen (figuur 3D).
4. Plaats het kristal niet dichter dan 13,5 mm en niet verder 27,5 mm van het ene uiteinde van het capillair; dit is het montage-uiteinde (aanvullende figuur 6).
5. Zuig de bufferoplossing rond het kristal aan met een lange dunne pipetpunt, waardoor het kristal enigszins nat blijft. Raak het kristal niet aan (aanvullende figuur 7A).
6. Droog de capillaire wanden met een dunne papieren lont (aanvullende figuur 7B).
7. Pipetteer 20-50 μL gedeutereerde bufferoplossing in het uiteinde van het capillair tegenover het montage-uiteinde (figuur 4A).
8. Smelt bijenwas met een warmte "toverstaf" en steek voorzichtig het capillair in deze gesmolten bijenwas. Herhaal dit totdat er een luchtdichte afdichting ontstaat (figuur 4B en figuur 4C).
9. Pipetteer een zeer kleine hoeveelheid gedeutereerde buffer, ongeveer 5 μL in het montage-uiteinde van het capillair om te fungeren als een "koellichaam" voor de hete bijenwas. Dompel dit uiteinde in gesmolten bijenwas om een luchtdichte afdichting te genereren zoals eerder beschreven om een capillair te vormen dat aan beide uiteinden is verzegeld (figuur 4D).
10. Inspecteer het gemonteerde kristal met een microscoop na montage om de luchtdichtheid te garanderen (figuur 4E).
11. Bevestig de gemonteerde kristallen zorgvuldig met Kim-doekjes in een container zoals een Falcon-buis van 15 ml of petrischaaltje en bewaar horizontaal bij de temperatuur waarbij de kristallen zijn gekweekt (figuur 4F).

5. Dampuitwisseling

1. Vervang de gedeutereerde buffer twee dagen na kristalmontage door een nieuwe buffer.
2. Smelt de wasafdichting het verst van het kristal met een verwarmingslus en gebruik een pipet en papieren lonten om de buffer te verwijderen.
3. Vul het capillair bij met 20-50 μL gedeutereerde bufferoplossing en sluit af met was.
4. Herhaal de gedeutereerde buffervervanging nog twee keer met tussenpozen van vier dagen om ervoor te zorgen dat de gedeutereerde bufferdampuitwisseling volledig is en de dampuitwisseling gedurende ten minste twee weken mogelijk is.

6. Neutroneneiwitdiffractie

OPMERKING: Lezers die geïnteresseerd zijn in de IMAGINE-bundellijnspecificaties worden aangemoedigd om Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47 te raadplegen.

1. Kamertemperatuurgegevensverzameling bij de IMAGINE-bundellijn bij HFIR
   1. Monster montage
      1. Bevestig het capillair gemonteerde kristal op de goniometer met stopverf.
      2. Monteer de goniometer op de monsterstick en centreer het kristal in de straal met behulp van het offline uitlijnstation.
      3. Bevestig de samplestick op de sampletrap van het instrument (aanvullende figuur 1B).
      4. Zorg ervoor dat het experimentele hok wordt ontruimd en open de bundellijnsluiter voor het verzamelen van neutronengegevens.
   2. Dataverzameling
      1. Open het data-acquisitieprogramma op de beamline-besturingscomputer en klik op het tabblad Setup om de strategie voor gegevensverzameling in te stellen. Typ onder Experimentparameters de voorbeeldnaam naast Voorbeeldnaam en voer het voorstelnummer in naast Voorstel. Selecteer onder Afbeeldingsnaamgeving de mapsjabloon en stel de bestemming in voor de verkregen gegevens die moeten worden opgeslagen en selecteer Afbeeldingsvoorvoegsel en typ relevante framenaam (aanvullende afbeelding 8).
      2. Open de Optics GUI en klik op 2.78 voor _λmin en 4.78 voor _λmax om het quasi-Laue-bereik voor gegevensverzameling in te stellen (aanvullende figuur 9).
      3. Schakel naar het tabblad Verzamelen en voeg onder Volgende scanparameters de belichtingstijd in seconden in onder Belichting, het aantal frames onder N Frames en de hoeken voor gegevensverzameling onder Δ φ/Frame. Geef het frame dat moet worden verzameld een naam onder Het voorvoegsel Afbeelding en start de gegevensverzameling door op de knop Scan starten te klikken (aanvullende afbeelding 10).
      4. De gediffracteerde neutronen worden gedetecteerd door de Image Plate Detector. Aan het einde van elke belichting wordt de beeldplaat gelezen en het patroon weergegeven op de GUI voor gegevensverzameling (aanvullende figuur 11).
      5. Frames worden geïndexeerd, geïntegreerd, golflengte genormaliseerd en geschaald met behulp van Lauegen, ^Lscale50 en Scala door de verantwoordelijke beamline-wetenschapper, die de gebruiker na gegevensverzameling het samengevoegde reflectiebestand zal verstrekken (aanvullende figuur 12).
         OPMERKING: Gegevensverzameling bij zowel IMAGINE als MaNDi zal worden uitgevoerd in quasi-Laue-modus, met behulp van methodologie en software die is ontwikkeld voor Laue-diffractiegegevensverzameling zoals ontwikkeld door Helliwell et ^al.48 en Nieh et ^al.49.
      6. Verzamel een overeenkomstige röntgendataset op hetzelfde kristal bij dezelfde temperatuur na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens (aanvullende figuur 13).
         OPMERKING: Een kristal dat uit dezelfde druppel of onder dezelfde kristallisatieomstandigheden is gegroeid, kan ook worden gebruikt voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens voor gezamenlijke neutronen/ röntgenverfijning.
2. Cryo dataverzameling bij de MaNDi beamline bij het SNS
   OPMERKING: Lezers die geïnteresseerd zijn in de specifieke kenmerken van de bundellijn worden aangemoedigd om Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11 te raadplegen.
   1. Monster montage
      1. Bereid de gedeutereerde ascorbaatweekoplossing voor de reductie van de kristallen en de gedeutereerde cryoprotectant. Plaats 20 μL druppels van elk van deze oplossingen in zittende druppelputten in een kristallisatieplaat.
         OPMERKING: De cryoprotectieve oplossing is meestal de cryoprotectant die effectief is gebleken voor cryo-temperatuur X-ray diffractie gegevensverzameling voorbereid in _D2O. Deze cryoprotectant kan indien nodig verder worden geoptimaliseerd (bijv. concentratie) voor het verzamelen van neutronengegevens.
      2. Selecteer lussen voor monstermontage en bevestig ze aan een magnetische cryobasis volgens de MaNDi-richtlijnen (aanvullende figuur 14).
      3. Vul een schuim cryo-Dewar met vloeibare stikstof. Plaats een metalen cryobeschermingshuls in de vloeibare stikstof om af te koelen (aanvullende figuur 15A).
      4. Verwijder de waspluggen van beide uiteinden van het capillair en tik op het capillair om de bufferplug te verplaatsen, zodat het gemonteerde kristal in de buffer wordt ondergedompeld. Was het kristal uit in de druppel van 20 μL reservoiroplossing in de zittende druppelput (aanvullende figuur 15B en aanvullende figuur 15C).
         OPMERKING: Deze stap is niet vereist als H/D-uitwisseling werd uitgevoerd door equilibratie van de kristallisatiedruppels tegen de gedeutereerde buffer of door direct weken van het kristal in gedeutereerde buffer.
      5. Dompel het kristal gedurende twee uur onder in de ascorbaatweekoplossing. Monteer het kristal in een microloop bevestigd aan een magnetische cryo-basis. Dompel het gemonteerde kristal gedurende 10 seconden onder in de cryoprotectant en dompel het kristal en de cryovat in de vloeibare stikstof om te bevriezen (aanvullende figuur 15D).
      6. Zodra het kristal is bevroren, gebruikt u de voorgekoelde cryopintang en monteert u het kristal op de MaNDi-monstertrap die is uitgerust met een cryo-stroom. Open de cryopintang voorzichtig en zorg ervoor dat het kristal in de cryostroom blijft (aanvullende figuur 2C).
   2. Dataverzameling
      1. Open de software voor gegevensverzameling waarin de experimentgegevens automatisch worden ingevuld.
      2. Klik op het midden van het kristal om het te centreren met de computergestuurde goniometer (aanvullende figuur 16).
      3. Stel onder Tabel de strategie voor gegevensverzameling in door de hoeken voor gegevensverzameling in te voeren onder "phi" en de totale blootstelling aan neutronenbundels per frame onder Waarde (aanvullende figuur 17).
      4. Klik op Verzenden om de gegevensverzameling te starten.
      5. Naarmate de gegevens worden verzameld, zullen diffracted neutronen zichtbaar zijn (aanvullende figuur 17). Diffractievlekken zullen duidelijker worden naarmate de belichtingstijd toeneemt, waardoor de signaal-ruisverhouding verbetert (figuur 5).
      6. Frames worden geïndexeerd, geïntegreerd, golflengte genormaliseerd en geschaald met behulp van Mantid en Lauenorm door de verantwoordelijke beamline-wetenschapper, die de gebruiker het samengevoegde intensiteitsbestand zal verstrekken na ^{gegevensverzameling51}.

7. Verfijning van de structuur

1. Gezamenlijke verfijning van röntgen- en neutronengegevens
   1. Structuurvoorbereiding
      1. Verfijn de röntgengegevens om een eiwitstructuur te verkrijgen met behulp van het phenix.refine-softwarepakket en Coot voor handmatig bouwen om een voltooide structuur te verkrijgen.
      2. Open CCP4 en selecteer het MTZ-programma Converteren naar/wijzigen/uitbreiden om de R-vrije gegevensvlaggen van de neutronengegevens af te stemmen op die van de röntgengegevens. Selecteer deze optie om het reflectiebestand in MTZ-indeling te importeren. Onder Upload het verkregen neutronen MTZ-bestand en upload het röntgen mtz-bestand onder Import FreeR MTZ (aanvullende figuur 18). Geef een naam op voor het nieuwe MTZ-bestand onder Uit en klik op Uitvoeren.
      3. Open het Phenix-softwarepakket en klik op ReadySet onder Refinement Tools. Naast PDB-bestand uploaden het PDB-coördinaatbestand verfijnd tegen de röntgengegevens. Selecteer waterstof toevoegen aan model bij afwezigheid en selecteer H/D op verwisselbare locaties, H elders in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Deuteriums toevoegen aan oplosmiddelmoleculen en laat de resterende opties op hun standaardwaarden staan (aanvullende figuur 19A).
         OPMERKING: Als een geperfectioneerd eiwit wordt gebruikt, selecteert u de optie Waterstof toevoegen aan model als afwezig en selecteert u H/D op verwisselbare locaties, D elders.
   2. Verfijning van de structuur
      1. Open het programma phenix.refine onder het tabblad Verfijning om de verfijning in te stellen met behulp van zowel röntgen- als neutronengegevens. Voer op het tabblad Configureren in Invoerbestanden het PDB-bestand in van de röntgenstructuur die is verwerkt met ReadySet en het benodigde CIF-beperkingsbestand voor relevante liganden. Upload het MTZ-bestand van de neutronengegevens met de Rfree-vlaggen toegewezen met CCP4 en wijs dit toe als "Neutron data" en "Neutron R-free" onder de rubriek Data type. Upload het MTZ-bestand vanuit de röntgengegevens en wijs dit toe als "Röntgengegevens" en "Röntgen R-vrij" onder de kop Gegevenstype. De spatiegroep en de gegevenslabels worden automatisch ingevuld zodra de gegevens zijn geüpload (aanvullende figuur 19B).
         OPMERKING: Gebruik bij het uitvoeren van de verfijning en het invoeren van de kristalinformatie de eenheidscel die is bepaald op basis van de röntgengegevens.
      2. Houd onder het tabblad Configureren in de verfijningsinstellingen de standaard verfijningsstrategie aan. Verhoog het aantal cycli tot vijf (aanvullende figuur 20)
      3. Selecteer Alle parameters, klik op Geavanceerd en selecteer Hydrogens.... Wijzig het waterstofverfijningsmodel in individueel en schakel de Force riding adp uit (aanvullende figuur 20).
      4. Selecteer Alle parameters en open de optie Parameters zoeken . Zoek naar het woord nucleair en selecteer De nucleaire afstanden gebruiken voor X-H/D (aanvullende figuur 20).
      5. Selecteer Uitvoeren om de verfijning te starten.
   3. Modelbouw
      1. Na de verfijning in Phenix, klikt u op Openen in Coot in het tabblad Resultaten om de röntgenelektronendichtheid en neutronen-SLD-kaarten te visualiseren. Klik op het tabblad Display Manager en klik onder Kaarten op Kaart verwijderen naast de _neutron kaarten om de neutronenkaarten te verwijderen (aanvullende figuur 21). Klik op Bestand > Open MTZ, mmCIF fcf of phs.... Selecteer de huidige verfijningsbestanden en open het .mtz-bestand. Voor zowel de optie Amplitudes als Fasen selecteert u de 2FOFC WT_no_fill_neutron gegevens in het vervolgkeuzemenu. Herhaal dit en open de _FOFC WT_neutron gegevens. Open Display Manager en schakel naar Scroll voor zowel de neutronen- als röntgen 2FOFCWT-kaarten en scrol vervolgens om de rmsd van de 2FOFCWT-kaarten te verlagen naar 1,00 (aanvullende figuur 21). Schakel naar Scroll voor zowel de neutronen- als röntgen FOFCWT-kaarten en scrol om de rmsd van de FOFCWT-kaarten te verlagen tot 3,00.
      2. Voer visuele inspectie van de residuen uit om te bepalen of het model past bij de gegevens. Bepaal de juiste oriëntatie en H/D-bezetting van alle verwisselbare locaties door de pieken van de verschildichtheidskaart te analyseren. Dit omvat de hydroxylgroepen van serines, threonines en tyrosines; de stikstof van histidine, glutamine, asparagine en lysine; het sulfhydryl van cysteïne; de carboxylgroepen van aspartaat en glutamaat; ruggengraatamidegroepen; liganden; cofactoren en eventuele gefunctionaliseerde residuen (figuur 6).
      3. Heroriënteer watermoleculen volgens neutronendichtheid en waterstofbruginteracties door ze te roteren met behulp van de Functie Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (aanvullende figuur 22A en aanvullende figuur 22B). Pas posities van uitwisselbare locaties voor eiwitresidu H/D aan met het gereedschap Chi-hoeken bewerken en de functie Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (aanvullende figuur 22C en aanvullende figuur 22D).
2. Structuurverfijning – neutronendata-only verfijning
   1. Structuurvoorbereiding
      1. Open Phenix en selecteer "Molecular Replacement" en selecteer "Phaser-MR (full featured)" om de fase af te leiden van de geschaalde intensiteiten die door de instrumentwetenschapper worden geleverd door moleculaire vervanging om een startcoördinaatbestand in pdb-formaat te genereren. Voer de start-pdbstructuur in het tabblad "Invoer en algemene opties " in en voltooi de opties Ensembles, ASU-inhoud en Zoekprocedure .
      2. Open Modelgereedschappen en selecteer VOB-hulpprogramma's. Voeg het pdb-bestand in als het invoerbestand. Navigeer naar het tabblad Opties en selecteer onder Atoomselectie verwijderen de namen van het oplosmiddel, liganden, cofactoren en metalen. Dit verwijdert alle watermoleculen, cofactoren, liganden en metaalionen om een minimaal model te genereren. Selecteer bovendien de optie Alternatieve conformers uit het model verwijderen (aanvullende figuur 23).
      3. Selecteer Verfijning in Phenix en open ReadySet. Voer het bewerkte pdb-coördinaatbestand in naast het PDB-bestand. Selecteer waterstof toevoegen aan model bij afwezigheid en selecteer H/D op verwisselbare locaties, H elders in het vervolgkeuzemenu van neutronenverfijningsopties (aanvullende figuur 23).
   2. Verfijning van de structuur
      1. Open het programma phenix.refine onder het tabblad Verfijning in Phenix. Voer op het tabblad Configureren het PDB-bestand in dat is verwerkt met ReadySet onder het vak Invoerbestanden . Upload in het vak Invoerbestanden het MTZ-bestand van de neutronengegevens en wijs dit toe als röntgengegevens en röntgen-R-vrij onder de kolom Gegevenstype , ook al zijn het neutronengegevens. De verfijningsconfiguratie die in de volgende stap is ingesteld, zal worden gebruikt om het reflectiebestand als neutronengegevens te behandelen. De spatiegroep en de gegevenslabels worden automatisch ingevuld zodra de gegevens zijn geüpload (aanvullende figuur 24A).
      2. Houd onder het tabblad Configureren in de verfijningsinstellingen de standaard verfijningsstrategie aan. Verhoog het aantal cycli tot vijf. Selecteer onder Andere opties neutron in het vervolgkeuzemenu Verstrooiingstabel . Schakel de optie Water bijwerken uit (aanvullende figuur 24B).
      3. Selecteer Alle parameters>Geavanceerde>Waterstoffen. Selecteer in het nieuwe venster Individual in het vervolgkeuzemenu Waterstofverfijningsmodel en schakel de Force riding adp uit (aanvullende figuur 20).
      4. Selecteer Alle parameters > Zoekparameters... optie. Zoek naar het woord nucleair en selecteer De nucleaire afstanden gebruiken voor X-H/D (aanvullende figuur 20).
      5. Selecteer Uitvoeren om de verfijning te starten.
         OPMERKING: Na de eerste verfijning zal het nodig zijn om de neutronen SLD-kaarten visueel te inspecteren en handmatige modelbouw in Coot uit te voeren. Het kan nodig zijn liganden/cofactoren in het model in te brengen. Latere verfijningen vereisen het benodigde CIF-beveiligingsbestand voor alle relevante liganden en deze moeten worden geüpload naar het tabblad Configureren van phenix.refine.
   3. Modelbouw
      1. Na de verfijning in Phenix, klikt u op Openen in Coot in het tabblad Resultaten om de neutronen SLD-kaarten en -structuur te visualiseren. Klik op het tabblad Display Manager en klik onder Kaarten op Kaart verwijderen om zowel de 2FOFCWT- als de FOFCWT-kaart te verwijderen (aanvullende afbeelding 25). Klik op Bestand > Open MTZ, mmCIF fcf of phs.... Selecteer de huidige verfijningsmap en selecteer het .mtz-bestand. Voor zowel de optie Amplitudes als Fasen selecteert u de 2FOFC WT_no_fill gegevens in het vervolgkeuzemenu. Herhaal dit door op Bestand > Open MTZ, mmCIF fcf of phs... en selecteer de FOFCWT-gegevens in het vervolgkeuzemenu voor zowel de optie Amplitudes als Fasen. Open Display Manager en schakel naar Scroll voor de _2FOFC WT_no_fill kaart en scrol vervolgens om de rmsd van de _2FOFC WT_no_fill gegevens te verlagen tot 1,00 (aanvullende afbeelding 25). Schakel naar Scroll voor de FOFCWT-kaart en scrol om de rmsd van de FOFCWT-gegevens te verlagen tot 3,00.
      2. Voer visuele inspectie van de eiwitstructuur uit om te bepalen of het model past bij de neutronen-SLD-kaart.
      3. Bepaal, zoals beschreven in punt 7.1.3.2, de juiste oriëntatie en H/D-bezetting van residuen en groepen met H/D-verwisselbare locaties. Pas de residuposities aan met het gereedschap Vertalen roteren en Chi-hoeken bewerken (afbeelding 6). Indien nodig kan Real Space Refine Zone worden gebruikt. Fix D-atomen die uit het residu exploderen handmatig door de teksteditor te gebruiken om de juiste atoomcoördinaten in te voegen
         OPMERKING: Real Space Refine Zone is niet geoptimaliseerd voor neutronen SLD-kaarten in Coot en kan resulteren in onregelmatige bindingslengten voor atomen gebonden aan D, exploderende residuen genoemd (aanvullende figuur 26). Het verdient de voorkeur om de benodigde atoomcoördinaten handmatig te bewerken en het gebruik van Real Space Refine Zone te vermijden.
      4. Plaats en heroriënteer watermoleculen volgens neutronendichtheid. Als u water in Coot wilt toevoegen, selecteert u het pictogram Atoom op de aanwijzer plaatsen en selecteert u of u een watermolecuul wilt invoegen (aanvullende figuur 27A). Coot zal standaard een O-atoom op deze positie invoegen.
      5. Om D-atomen toe te voegen aan de O-atomen van water die in Coot zijn ingebracht, gebruikt u Phenix. Open het menu Verfijning en klik op ReadySet. Selecteer naast Neutron Refinement Options alleen de optie om deuteriums toe te voegen aan oplosmiddelmoleculen. Hef de selectie van Waterstof toevoegen aan model bij afwezigheid op (aanvullende figuur 27B en aanvullende figuur 27C).
         OPMERKING: Modelbouw met alleen neutronengegevens verschilt van modelbouw van een gezamenlijke röntgen/ neutronenstructuur omdat er geen röntgengegevens zijn die bijdragen aan de verfijning van de coördinaten van de ruggengraat en zwaardere atomen. In een gezamenlijke verfijning wordt de elektronendichtheidskaart in eerste instantie gebruikt om de eiwitbackbone en sidechaincoördinaten te bepalen. Dit model wordt vervolgens gebruikt in een gezamenlijke röntgen/neutronen data verfijning waarbij de oriëntatie en bezetting van H/D atomen wordt afgeleid van de neutronen SLD kaart. In een neutronen-only verfijning wordt de hele structuur afgeleid van analyse van de neutronen SLD-kaarten, waarbij naast de H/D-atomen ook de watermoleculen, ruggengraat, zijketens en liganden moeten worden gebouwd (figuur 6). De data-to-parameter ratio is laag in verfijningen ten opzichte van neutronengegevens alleen en voorzichtigheid is geboden om de gegevens niet te veel in te passen.

Results

Neutronendiffractiegegevens over kristallen van een lytisch polysaccharidemonooxygenase uit Neurospora crassa (NcLPMO9D) werden verzameld op IMAGINE bij de HFIR bij kamertemperatuur en op MaNDi bij de SNS onder cryo-omstandigheden volgens het hierboven beschreven protocol. Er werden kristallen gebruikt van het gehydrogeneerde eiwit dat werd gekweekt in een buffer op basis van _H2O met een volume groter dan 0,1 ^mm3 (illustratieve voorbeelden van grote kristallen zijn weergegeven in aanvullende figuur 4 en figuren daarna). Kristallen werden gemonteerd in kwartscapillairen en dampuitwisseling met de op _D2O gebaseerde buffer werd uitgevoerd gedurende drie weken voorafgaand aan het verzamelen van gegevens (figuur 4).

Gegevens over kamertemperatuur werden verzameld op de IMAGINE-bundellijn (figuur 1). Een vier uur durende white-beam test leidde tot hoge resolutie diffractie wat suggereert dat het kristal van geschikte grootte en kwaliteit was voor een volledige dataset die moest worden verzameld. Naast het verstrekken van voorlopige informatie over de diffractiekwaliteit van het kristal, kan de initiële breedbandpassblootstelling worden gebruikt om het diffractiepatroon te indexeren en de kristaloriëntatiematrix te bepalen. Gezien de _{P21-ruimtegroep} van het kristal werd een dataverzamelingsstrategie van 18 frames met een verzameltijd van 20 uur per frame geïmplementeerd. Net als bij het verzamelen van röntgendiffractiegegevens, hebben hogere symmetrieruimtegroepen minder frames (d.w.z. minder hoekdekking) nodig om een volledige dataset te verzamelen. De gegevens werden verzameld in quasi-Laue-modus met een golflengtebereik van 2,8 – 4,0 Å. Na gegevensverzameling werden de gegevens geïndexeerd, geïntegreerd geschaald en samengevoegd tot een neutronen-SLD-bestand in MTZ-formaat met een resolutie van 2,14 Å. De gegevens werden beoordeeld als van voldoende kwaliteit volgens soortgelijke richtlijnen voor röntgengegevensanalyse, hoewel een volledigheid van 80 % en een _CC1/2 van ten minste 0,3 aanvaardbaar werden geacht omdat neutroneneiwitdiffractie een fluxbeperkte techniek is.

Na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens bij kamertemperatuur werd hetzelfde kristal gebruikt om een röntgendiffractiegegevensset bij kamertemperatuur te verzamelen met een resolutie van 1,90 Å (aanvullende figuur 13). De röntgengegevens werden gebruikt om de posities van de "zwaardere" atomen te bepalen, waaronder C, N, O en S. De structuur die alleen tegen de röntgengegevens werd verfijnd, werd vervolgens gebruikt als startmodel om een gezamenlijke verfijning uit te voeren tegen de röntgen- en neutronengegevens. Phenix ReadySet werd gebruikt om H-atomen op niet-uitwisselbare plaatsen, H- en D-atomen op verwisselbare plaatsen en D-atomen toe te voegen aan watermoleculen van het beginnende röntgenmodel. Na deze modelvoorbereiding werden iteratieve verfijningen uitgevoerd op beide datasets (aanvullende figuur 19 en aanvullende figuur 20). Interactieve modelbouw werd uitgevoerd in Coot door de dichtheidskaarten visueel te inspecteren om zijketens en watermoleculen dienovereenkomstig te oriënteren (aanvullende figuur 22). De neutronengegevens werden voornamelijk gebruikt om protonatietoestanden en watermolecuuloriëntaties te bepalen. Vergelijking van de elektronendichtheidskaart van residuen zoals serine en tryptofaan en de bijbehorende neutronen-SLD-kaart illustreren de informatie die kan worden verkregen over protonatietoestanden op H/D-verwisselbare locaties uit neutroneneiwitdiffractie (figuur 7). Een kaartoverlay van elektronen- en neutronen-SLD-kaarten voor watermoleculen geeft ook aan dat hoewel waterstofbruginteracties kunnen worden afgeleid uit röntgengegevens, neutronen duidelijke informatie geven over de oriëntatie van deze waterstofbruggen (figuur 8). Neutronen SLD _FO-FC weglatingskaarten werden gegenereerd om protonatietoestanden en H / D-oriëntatie van zijketens te bepalen. Afgebeeld zijn de neutronen-SLD-kaarten verkregen voor tyrosine- en threonineresiduen, waarbij de neutronen Fo-FC-kaarten duidelijk positieve pieken aangeven die de aanwezigheid van H/D aangeven (figuur 9). De verzamelde neutronendiffractiegegevens leverden ook waardevolle informatie op over meerdere protoneringstoestanden, zoals de -_ND3⁺ groep van Lys (figuur 10). Verfijningsstatistieken (_Rwork en _Rfree) werden nauwlettend gevolgd tijdens modeloptimalisatie om overfitting te voorkomen. De uiteindelijke statistieken gaven een röntgen _Rwork van 12,77% en een _Rfree van 18,21%, en een neutronen _Rwork van 14,48% en een _Rfree van 21,41% met 389 aanwezige watermoleculen (aanvullende figuur 28).

Cryotemperatuurgegevens werden verzameld op NcLPMO9D na een ascorbaatweek om de koperactieve site van ^CuII naar ^CuI op de MaNDi-bundellijn te verminderen (aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 15)⁴⁵. Gegevens werden verzameld met behulp van de TOF Laue-modus na een neutronendiffractietest met een blootstelling van 4 uur om de kwaliteit van diffractie te verifiëren. Gezien de ruimtegroep van het kristal werd een dataverzamelingsstrategie van 18 frames met een verzameldosis van 80 Coulombs per frame bedacht. De gegevens werden verzameld in TOF-Laue-modus bij een golflengtebereik van 2,0 – 4,0 Å. Na gegevensverzameling werden de gegevens geïndexeerd, geïntegreerd, geschaald en samengevoegd om een reflectiebestand in MTZ-formaat te geven met een resolutie van 2,40 ^Å51,52.

Na gegevensverzameling werd de 2,40 Å cryo-temperatuur NcLPMO9D neutronendiffractie dataset gebruikt voor neutronen-only data verfijning. De neutronengegevens werden gefaseerd door moleculaire vervanging met PDB 5TKH als startmodel. Phenix ReadySet werd gebruikt om H-atomen toe te voegen op niet-uitwisselbare locaties en H/D-atomen met gedeeltelijke bezettingen op verwisselbare locaties. Watermoleculen werden uit het startmodel verwijderd met PDB Tools (aanvullende figuur 23). Modelvoorbereiding werd gevolgd door verfijning met fenix.refine met behulp van de neutronenverstrooiingstabel (aanvullende figuur 24). Interactieve modelbouw werd uitgevoerd in Coot, waarbij watermoleculen werden toegevoegd met behulp van de positieve pieken van de FO-Fc-kaart en gepositioneerd volgens potentiële waterstofbruginteracties (figuur 11A en figuur 11B). Bij het analyseren van neutronen-SLD-kaarten zijn watermoleculen duidelijk zichtbaar als ze zeer geordend zijn, maar hun dichtheid kan bolvormig of ellipsoïdaal zijn als ze niet goed geordend zijn (figuur 11C-E). Neutronen-SLD-kaarten werden gebruikt om waardevolle informatie te verschaffen over de oriëntatie van residuen zoals asparagine, waarbij het onderscheid tussen de carbonyl- en aminogroepen een uitdaging kan zijn bij het gebruik van röntgendiffractiegegevens alleen (figuur 12A en figuur 12B). Pieken in _FO-FC neutronen SLD weglatingskaarten waren ook zeer informatief bij het bepalen van de protonatietoestanden van histidineresiduen op de N _δ- of N _ε-positie (figuur 12C en figuur 12D). De protonatietoestand van residuen met meerdere H/D-uitwisselbare locaties kan ook worden bepaald met behulp van neutronen-SLD-kaarten. Dit werd duidelijk geïllustreerd met een _FO-FC neutronen SLD weglating kaart van arginine, waarvan bekend is dat het een positieve lading heeft (Figuur 12E en Figuur 12F). Net als voorheen werd overbeslag voorkomen door _Rwork en _Rfree te monitoren. De definitieve statistieken gaven een _Rwork van 22,58% en een _Rfree van 30,84% (aanvullende figuur 29). Aangezien neutroneneiwitdiffractie een fluxbeperkte techniek is waarbij rekening moet worden gehouden met de negatieve verstrooiingslengte en de grote onsamenhangende verstrooiingsfactor van H, kan worden verwacht dat een verfijning van alleen neutronengegevens slechtere statistieken zou hebben dan een gezamenlijke verfijning van röntgen- / neutronengegevens met minder zichtbare watermoleculen (aanvullende figuur 28 en aanvullende figuur 29).

Bij het analyseren van neutronen-SLD-kaarten zal blijken dat dichtheidssanering als gevolg van de negatieve neutronenverstrooiingslengte van H zal optreden voor gehydrogeneerde eiwitten die werden onderworpen aan dampuitwisseling met D2O-bevattende kristallisatiebuffer. Om deze reden lijken neutronen-SLD-kaarten waarin niet-uitwisselbare H-atomen aan koolstof zijn bevestigd, onvolledig in vergelijking met hun tegenhanger van de elektronendichtheidskaart (figuur 13A). Het effect van annulering is vaak duidelijker bij slechtere resoluties, waardoor het noodzakelijk is om eiwitkristallen van een hoge kwaliteit te verkrijgen. Het verdient daarom de voorkeur om een gezamenlijke verfijning van een monster uit te voeren met zowel röntgen- als neutronengegevens waarin de röntgengegevens kunnen worden gebruikt om de positie van de eiwitruggegraat te bepalen (figuur 13B). Bovendien kunnen zwavelatomen in cysteïne en methionine slecht zichtbaar zijn, waardoor röntgengegevens nodig zijn voor exacte atoomplaatsing (figuur 13C en figuur 13D). Metalen met zwakke neutronenverstrooiingslengtes kunnen ook een uitdaging zijn om te modelleren in neutronen-SLD-kaarten, zoals blijkt uit onze LPMO9D-kaarten. Het verzamelen van een lage dosis (vrij van stralingsschade) röntgendataset op hetzelfde kristal is daarom nuttig, omdat het metaalatoompositionering mogelijk maakt met behulp van elektronendichtheidskaarten (figuur 13E en figuur 13F).

Figuur 1: Stroomschema van neutroneneiwitkristallografie workflow. Eiwitproductie. Om een neutronenstructuur te verkrijgen, wordt eerst eiwit tot expressie gebracht. Bacteriële expressie in _H2O- of _{D2O-gebaseerde} media wordt meestal gebruikt om respectievelijk een hoge opbrengst van gehydrogeneerd of geperdeutereerd recombinant eiwit te produceren. Het eiwit wordt gezuiverd in een op _H2O gebaseerde buffer en vervolgens gekristalliseerd in een op _H2O of _D2O gebaseerde kristallisatiebuffer om kristallen te laten groeien tot een minimale grootte van 0,1 ^mm3. Monstervoorbereiding: Voorafgaand aan het verzamelen van neutronendiffractiegegevens ondergaan _{H2O-gekweekte} kristallen H / D-uitwisseling om de eiwit titreerbare H-atomen uit te wisselen met D. H / D-uitwisseling kan worden gedaan door de kristallen direct te weken in de gedeutereerde kristallisatiebuffer, equilibratie van de kristallisatiedruppel met een op _D2O gebaseerd reservoir, of door de kristallen in kwartscapillairen te monteren voor dampuitwisseling met gedeutereerde kristallisatiebuffer. Neutronen gegevensverzameling: Na H/D-uitwisseling worden potentiële kristallen gescreend om de diffractiekwaliteit te bepalen. Kristallen met een minimale resolutie van 2,5 Å worden geschikt geacht om een volledige dataset te verzamelen. Kristallen worden gemonteerd in kwartscapillairen voor gegevensverzameling bij kamertemperatuur of flash bevroren in een cryo-lus voor gegevensverzameling bij cryogene temperatuur. Een röntgendataset wordt verzameld op hetzelfde (of een identiek) kristal bij dezelfde temperatuur. Modelbouw: Verfijning wordt uitgevoerd met behulp van fenix.refine tegen zowel neutronen- als röntgengegevens of alleen tegen de neutronengegevens. Handmatige modelbouw van de eiwitstructuur wordt uitgevoerd in Coot met behulp van de neutronen SLD-kaarten. Volledige structuur: Na voltooiing van de eiwitstructuur wordt het coördinatenmodel gevalideerd en gedeponeerd in de Eiwitdatabank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Oogsten van eiwitkristallen. (A) Kristallen worden behandeld onder een microscoop. (B) De verzegelde sandwichdoos met de gesiliconiseerde glasplaat wordt geopend. Reservoirbuffer wordt gepipetteerd op gesiliconiseerde glasplaten. (C) Een kristal wordt geoogst met een microloop. (D) Het kristal wordt in een druppel moederlikeur geplaatst om al het puin af te wassen dat vaak samen met het kristal wordt geoogst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overdracht van kristal naar kwartscapillair. (A) Het uiteinde van een kwartscapillair is gevuld met reservoirbuffer. (B) Het kristal wordt overgebracht in het kwartscapillair en (C) ondergedompeld in reservoirbuffer. (D) Het kristal wordt capillair naar beneden gedragen met behulp van reservoirbuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Afdichting van het kwartscapillair. (A) Aan het einde van het capillair wordt een gedeutereerde buffer toegevoegd om een "plug" te vormen. (B) Was wordt gesmolten met een "toverstokje". (C) Het capillair wordt in de gesmolten was geplaatst om af te sluiten. (D) Aan beide uiteinden worden waspluggen gevormd om het capillair af te sluiten. (E) Het kristal na montage. (F) Het verzegelde capillair wordt in een petrischaaltje geplaatst en met stopverf op zijn plaats gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Verhoogde signaal-ruis van het neutronendiffractiepatroon. Naarmate de gegevensverzameling vordert, worden diffracted spots intenser. (OPMERKING: de hier gepresenteerde live diffractiebeelden zijn ter illustratie en zijn afkomstig van verschillende kristallen.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Interactieve modelbouw met neutronendata in Coot. (A) Een positieve _FO-FC neutronen SLD-dichtheidspiek (groen) die serine aangeeft, moet worden geheroriënteerd door chi-hoeken te bewerken. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (B) Correct geplaatste serine. (C) Positieve en negatieve _FO-FC neutronen SLD dichtheid pieken (respectievelijk groen en rood), wat aangeeft dat tryptofaan moet worden gedraaid / vertaald om overeen te komen met de verschildichtheidspiek. (D) Correct georiënteerd tryptofaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Aanvullende informatie van neutronen SLD-kaarten. (A) 2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) toont de posities van de "zwaardere" atomen in serine. (B) 2FO-FC neutronen SLD-kaart (paars) geeft duidelijk de positie van het "lichtere" D-atoom in serine weer. (C) 2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) geeft de posities van de "zwaardere" atomen in tryptofaan weer. (D) 2FO-FC neutronen SLD-kaart (paars) geeft duidelijk de positie van het "lichtere" D-atoom in tryptofaan weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Positionering van watermoleculen. (A) De bolvorm van een _2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) kenmerk voor water. (B) De 2FO-FC neutronen SLD-kaart (paars) geeft informatie over de wateroriëntatie en waterstofbruginteractie. (C) Kaart overlay van elektronen en neutronen SLD kaarten van water. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Neutronen SLD _FO-FComit kaarten. (A) De _FO-FC neutronen SLD kaart (groen) geeft duidelijke informatie over de H/D oriëntatie van tyrosine residuen. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (B) Tyrosineresidu met de juiste H/D-oriëntatie. (C) _FO-FC neutronen SLD-kaart (groen) geeft duidelijke informatie over de H/D-oriëntatie van threonineresiduen. D) Threonineresidu met de juiste H/D-oriëntatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Meerdere protonatietoestanden weergegeven met neutronen SLD-kaarten. (A) De 2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) geeft alleen de positie van het N-atoom van lysine ε-ammoniumgroep. (B-E) De _FO-FC neutronen SLD weglaatkaart (groen) toont duidelijk de positief geladen -_NH3-groep. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (F) Overlay van elektronendichtheid en neutronen SLD kaarten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Verschijning van watermoleculen in neutronen SLD-kaarten. (A) Watermoleculen worden gepositioneerd volgens _FO-FC neutronen SLD-kaarten (groen) en potentiële waterstofbruggen. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars. (B) Correct geplaatst watermolecuul. (C-E) De verschillende vormen van neutronen SLD kaarten voor watermoleculen afhankelijk van B-factoren en waterstofbrug interacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Informatie over aminozuuroriëntatie en protonatie door neutronen-SLD-kaarten. (A) De neutronen SLD FO-FC-kaartpieken (groen) geven een onjuiste oriëntatie van een asparagineresidu aan. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (B) 2FO-FC neutronen SLD kaart (paars) van de juiste asparagine oriëntatie. (C) De neutronen SLD _FO-FC kaartpiek (groen) duidt op een enkele protonatie van het histidine bij N _ε. (D) 2FO-FC neutronen SLD kaart (paars) van histidine N _ε -protonatie. (E) Neutron SLD _FO-FC weglating map peaks (groen) bevestigen de positieve lading van arginine. (F) 2FO-FC neutronen SLD kaart (paars) van positief geladen arginine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Discontinue neutronen SLD-kaarten. (A) 2FO-FC neutronen SLD-kaart (paars) van een gehydrogeneerd, damp H/D uitgewisseld eiwit. Glutaminezuur geeft neutronen SLD-kaartannulering weer als gevolg van de negatieve verstrooiingslengte van niet-uitwisselbare H-atomen. (B) Een overlayed 2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) geeft duidelijk de dichtheid van het glutaminezuur weer. (C) Het zwavelatoom in methionine is slecht zichtbaar in _2FO-FC neutronen SLD kaarten (paars). (D) Een overlayed elektronendichtheidskaart geeft duidelijk de dichtheid van de methionine weer. (E) Metaalatomen, hier koper, zijn slecht zichtbaar in neutronen _2FO-FC SLD-kaarten (paars). (F) Een overlayed 2FO-FC elektronendichtheidskaart (blauw) geeft duidelijk de dichtheid van het gecoördineerde koperatoom weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Isotoop	Coherente verstrooiingslengte (fm)	Onsamenhangende verstrooiingslengte (fm)
1 uur	-3.741	25.274
2 uur	6.671	4.04
12c	6.6511	0
14n	9.37	2
16o	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24 mg	5.66	0
31p	5.13	0.2
32s	2.804	0
35cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56fe	9.94	0
63cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tabel 1: Neutronenverstrooiingslengtes en onsamenhangende verstrooiingswaarden. Aangepast van Sears, ¹⁹⁹²¹⁶.

Aanvullende figuur 1: Het IMAGINE-instrument in de hoge flux isotoopreactor. (A) Het IMAGINE-instrument in de koude neutronengeleidingshal. (B) Monster in gemonteerd in een kwartscapillair bevestigd met stopverf aan de goniometer. De monster- en detectortafel sluit om het kristal en de cilindrische beeldplaat in de neutronenbundel te plaatsen. Gewijzigd met toestemming van de International Union of ^{Crystallography53}. Afbeeldingen verstrekt met toestemming van Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Het MaNDi-instrument bij de Spallation Neutron Source. (A) De MaNDi Anger camera detector array. Gereproduceerd met toestemming van de International Union of ^{Crystallography11}. B) MaNDi verplaatsbare monsterfase. (C) Monster gemonteerd in kwartscapillair gemonteerd op de goniometer bij MaNDi voor het verzamelen van gegevens bij kamertemperatuur. Afbeeldingen verstrekt met toestemming van Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Structuur van de lytische polysaccharide monooxygenase NcLPMO9D. De NcLPMO9D koper-actieve site bevindt zich op een vlak polysaccharide bindingsoppervlak. Het koper wordt gecoördineerd door twee histidineresiduen in een klassieke "histidine brace" en een axiale tyrosineresidu. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Kristal met voldoende volume in zittende druppelkristallisatiebak. (A) Grote kristallen worden gekweekt in zittende druppels die zijn opgezet in 9-well gesiliconiseerde glasplaten. (B en C) Kristallen worden gemeten om die met een volume > 0,1 ^mm3 te identificeren. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 5: pH-meter ingesteld voor gedeutereerde bufferstanden. De pH-elektrode wordt voor gebruik in _D2O gedrenkt. NaOD en DCl worden gebruikt om de pH van gedeutereerde buffers aan te passen. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Richtlijnen voor het monteren van MaNDi-monsters. Maximale afmetingen van het kwartscapillair en de monsterpositie voor het verzamelen van gegevens bij kamertemperatuur.
Overgenomen van: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Opheffing van overtollige buffer. (A) Overtollige buffer wordt aangezogen uit het kwartscapillair met microcapillaire uiteinden. (B) De resterende buffer wordt verwijderd met een dunne papieren lont om het capillair volledig te drogen. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 8: De GUI voor gegevensverzameling. Invoervenster van de "Experimentparameters" voor gegevensverzameling. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 9: De Optics GUI. Selectie van het quasi-Laue-bereik voor gegevensverzameling en monitoring van de neutronentelling. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 10: Gegevensverzameling in de GUI voor gegevensverzameling. De belichtingstijd, het aantal frames en de hoeken voor het verzamelen van gegevens worden opgegeven op het tabblad "Verzamelen". De gegevensverzameling wordt vervolgens gestart met behulp van "Start Scan". Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 11: Gedetecteerde en weergegeven diffracted neutronen. Aan het einde van de belichtingstijd wordt de neutronengevoelige beeldplaatdetector uitgelezen en wordt het diffractiepatroon weergegeven in de GUI voor gegevensverzameling. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 12: Gegevensverwerking na neutronendiffractie. Frames worden geïndexeerd, geïntegreerd, golflengte genormaliseerd en geschaald met behulp van Lauegen, Lscale en Scala om een samengevoegd reflectiebestand te genereren na gegevensverzameling. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 13: Verzameling van röntgengegevens. Home source X-ray generator opgezet met kwarts capillair gemonteerd kristal voor kamertemperatuur gegevensverzameling. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 14: Montagerichtlijnen voor het verzamelen van Cryogegevens van MaNDi. Afmetingen van CrystalCaps en pinhoogte voor cryo-dataverzameling bij MaNDi.
Overgenomen van: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 15: Flash freezing voor cryo neutron diffraction data collection. (A) Opstelling voor het weken van kristallen, oogsten met een microloop en invriezen in vloeibare stikstof met behulp van een cryo-compatibele container zoals een schuim Dewar. Het gemonteerde kristal wordt rechtstreeks op de beamline cryo goniometer overgebracht met behulp van voorgekoelde cryo pin tangen. (B) De wasafdichting wordt gesmolten voor kristalverwijdering. (C) Het kristal wordt gespoeld naar het uiteinde van het kwartscapillair voor het oogsten. (D) Het kristal wordt achtereenvolgens geweekt in ascorbaatweekbuffer en vervolgens cryoprotectant gevolgd door flashbevriezing in vloeibare stikstof. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 16: Interface voor uitlijning van monsters. Kristaluitlijning in de neutronenbundel, vertegenwoordigd door het blauwe kruis, gebeurt door punt- en klikcentrering. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 17: De CSS GUI voor gegevensverzameling. De strategie voor het verzamelen van gegevens, inclusief belichtingsdoses en hoeken, wordt geüpload in de CSS GUI. Naarmate de gegevensverzameling vordert, worden de diffracted neutronen die op de real-time detector worden gedetecteerd, weergegeven in het bovenste paneel. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 18: Overeenkomende R-vrije vlaggen in CCP4. De R-vrije vlaggen van de neutronengegevens worden gematcht met de R-vrije vlaggen van röntgengegevens die op hetzelfde of een identiek kristal zijn verzameld voor gezamenlijke verfijning. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 19: Voorbereiding en verfijning van de structuur. (A) De Phenix ReadySet-tool wordt gebruikt om dubbele H / D-bezetting toe te voegen op verwisselbare locaties. (B) Zowel de neutronengegevens als de röntgengegevens worden gebruikt voor een gezamenlijke verfijning, terwijl het initiële invoermodel werd verfijnd ten opzichte van de röntgengegevensset die op hetzelfde kristal of een identiek kristal werd verzameld. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 20: Configuratie van verfijningsinstellingen. Het verfijningsmodel en de nucleaire afstanden zijn geconfigureerd voor gezamenlijke verfijning van röntgen- / neutronengegevens. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 21: Gegevensselectie voor meerkoetmodelbouw. De phenix MTZ-bestandsuitvoer met röntgen- en niet-gevulde neutronengegevens wordt geopend in Coot om elektronen- en neutronen-SLD-kaarten te genereren voor interactieve modelbouw. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 22: Interactieve modelbouw in Coot tijdens een gezamenlijke verfijning. (A) Een positieve en negatieve _FO-FC neutronen SLD-dichtheidspiek (respectievelijk groen en rood) die aangeeft dat het water moet worden geheroriënteerd door rotatie/translatie. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (B) Correct geplaatst water. (C) Een positieve _FO-FC neutronen SLD-kaartpiek (groen) geeft aan dat threonine moet worden gedraaid om overeen te komen met de verschildichtheidspiek door chi-hoeken te bewerken. (D) Correct georiënteerde threonine. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 23: Structuurvoorbereiding voor verfijning van gegevens met alleen neutronen. Het startcoördinaatbestand wordt voorbereid voor verfijning door wateratoomverwijdering in PDBTools en door toevoeging van dubbele H/D-bezetting op verwisselbare locaties. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 24: Verfijning van neutronengegevens. (A) Neutronengegevens worden geüpload, evenals het voorbereide startmodel. (B) De instellingen voor de verfijning van neutronengegevens maken gebruik van de neutronenverstrooiingstabel. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 25: Gegevensselectie voor meerkoetmodelbouw. De ongevulde neutronengegevens worden in Coot geopend voor interactieve modelbouw. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 26: Verfijning van de reële ruimte in meerkoet voor gedeutereerde residuen. (A) Positieve en negatieve _FO-FC neutronen SLD dichtheid pieken (respectievelijk groen en rood), wat aangeeft dat een arginine residu moet worden verplaatst om te passen bij de _FO-FC dichtheidspiek. De 2FO-FC neutronen SLD kaart wordt weergegeven in paars en 2FO-FC elektronendichtheid kaart wordt weergegeven in blauw. (B) Het gebruik van Real Space Refine resulteert in "exploderende" D-atomen als gevolg van ontbrekende Coot geometrie beperking bibliotheken. (C) De D-atomen bewegen niet mee met de rest van de residuatomen. (D) De D-atoomposities kunnen handmatig worden vastgesteld met behulp van een teksteditor. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 27: Toevoeging van watermoleculen. (A) Watermoleculen kunnen handmatig worden toegevoegd aan de positieve _FO-FC neutronen SLD map dichtheidspieken (groen). De ingebrachte watermoleculen zullen in eerste instantie worden weergegeven door een O-atoom in Coot. (B) Phenix ReadySet wordt gebruikt om D-atomen toe te voegen aan de O-atomen voor watermoleculen. (C) Het gedeutereerde watermolecuul wordt met succes toegevoegd. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 28: Verfijningsstatistieken. Definitieve gegevensverfijningsstatistieken na gezamenlijke verfijning van röntgenstralen en neutronen. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 29: Verfijningsstatistieken. Definitieve gegevensverfijningsstatistieken na verfijning van neutronengegevens. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Discussion

Neutroneneiwitkristallografie is een zeer gevoelige techniek om protonatietoestanden en watermolecuuloriëntatie in eiwitten te onderzoeken. Deze informatie werpt licht op eiwitkatalytische mechanismen, omdat veranderingen in protonatie- en waterstofbindingsinteracties vaak centraal staan in de ^{enzymchemie10}. Neutroneneiwitkristallografie, hoewel een informatieve techniek, heeft een aantal factoren waarmee rekening moet worden gehouden voordat u van plan bent een neutronendiffractie-experiment uit te voeren, namelijk:

1. De behoefte aan grote eiwitkristallen voor het verzamelen van gegevens.
2. De verstrooiingseigenschappen van waterstof en andere elementen, zoals metaalionen.
3. Beperkingen in de structuurverfijning en modelbouwsoftware bij het werken met gedeutereerde monsters.

Neutroneneiwitkristallografie is een fluxbeperkte techniek. In tegenstelling tot röntgendiffractie datasets worden hogere R-factoren en lagere volledigheid, redundantie en signaal-ruisverhoudingen verwacht voor neutronen datasets vanwege de inherente beperkingen van de techniek (flux limited, quasi-Laue, langere golflengten). Het verzamelen van gegevens van een enkel frame duurt meestal 12 - 18 uur. Het succes van een experiment is sterk afhankelijk van de monstergrootte en -kwaliteit, waarbij kristallen van 0,1 ^mm3 vaak de minimumvereiste ^zijn3. Neutronendiffractie vereist de productie van grote hoeveelheden eiwit om kristallisatiedruppels op te zetten, variërend van 10 tot 800 μL. Het minimale volume voor het kweken van voldoende grote kristallen kan worden geschat met behulp van een volumecalculator op basis van de kristal- en monsterparameters (https://neutrons.ornl.gov/imagine). De groei van grote kristallen is het meest tot stand gekomen door dampdiffusie3. Hangende druppelkristallisatie maakt de groei van kristallen in grote druppels variërend van 10-25 μL mogelijk, terwijl grotere druppels tot ~ 50 μL kunnen worden ingesteld met behulp van in de handel verkrijgbare zitdruppelapparatuur14,54. Gesiliconiseerde glasplaten met negen putten kunnen worden gebruikt om zeer grote druppels op te zetten, met volumes tot 800 μL. Deze glazen platen worden geplaatst in "sandwichboxen" die in de handel verkrijgbaar zijn bij Hampton Research. Verdere kristallisatietechnieken omvatten batchkristallisatie, waarbij de limiet van de druppelgrootte wordt bepaald door het vat. Het opzetten van batchkristallisatie-experimenten kan variëren van microliter tot ^milliliter55. Kristallisatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van de dialysetechniek waarbij het eiwit in evenwicht wordt gebracht met het neerslag via een dialysemembraan of door tegendiffusie langs een precipitantconcentratiegradiënt of door een poreuze plug zoals agarose56,57. Zaaien biedt een ander alternatief om kristallen van het gewenste volume te verkrijgen. Micro- en macroseeding zijn met succes gebruikt voor grote kristalgroei, waaronder groot kristal van NcLPMO9D45. Enige kennis van het eiwitfasediagram, inclusief de invloed van temperatuur op de oplosbaarheid, helpt bij grote kristalgroei.

Bij het plannen van een neutronendiffractie-experiment is optimalisatie van het eiwitpreparaat om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren tijdens het verzamelen van diffractiegegevens ^essentieel7. Om dichtheidsannulering en hoge onsamenhangende verstrooiing veroorzaakt door H-atomen te omzeilen, kunnen neutronen-SLD-kaarten worden verbeterd door H-atomen uit te wisselen voor zijn isotoop D, die een positieve coherente verstrooiingslengte en lage onsamenhangende verstrooiingslengte bezit. Om dit te bereiken, wordt dampuitwisseling van het gehydrogeneerde eiwitkristal tegen gedeutereerde kristallisatiebuffer uitgevoerd. Dit zorgt voor H/D-uitwisseling van oplosmiddelmoleculen en het labiele, titreerbare eiwit ^H-atomen23. Dampuitwisseling wordt uitgevoerd door het gehydrogeneerde kristal in een kwartscapillair te monteren met op _D2O gebaseerde, gedeutereerde kristallisatiebuffer "pluggen" en het vertegenwoordigt een effectieve, zachte techniek die meestal wordt toegepast14,23,35. De uitwisseling kan enkele weken duren en vereist bij voorkeur dat de gedeutereerde buffer regelmatig wordt gewijzigd om een maximale H / D-uitwisseling te garanderen. H/D-uitwisseling kan ook worden uitgevoerd door het kristal direct in de gedeutereerde buffer te weken. Om te voorkomen dat het kristal onder druk komt te staan als gevolg van _{D2O-blootstelling}, moet het inweekproces geleidelijk worden uitgevoerd door de _D2O: _{H2O-verhouding} ^{geleidelijk te verhogen58}. Daarnaast kan kristallisatie van gehydrogeneerd eiwit ook worden uitgevoerd in gedeutereerde buffer voor H/D-uitwisseling op labiele ^{H-locaties22,59}. Er moet echter worden opgemerkt dat op _D2O gebaseerde buffer een effect heeft op de oplosbaarheid van eiwitten, waardoor verdere aanpassing van de bekende op _H2O gebaseerde omstandigheden ^vereist3,59. D2O-gebaseerde buffers zijn ook waargenomen om in sommige gevallen tot kleinere kristallen te ^leiden59. Volledige uitwisseling van titreerbare en koolstofgebonden H-atomen naar D kan worden bereikt door eiwitten in gedeutereerde media tot expressie te brengen om een geperfectioneerd monster te ^genereren20. De resulterende neutronen-SLD-kaarten van het geperfectioneerde monster zullen aanzienlijk worden verbeterd, waardoor niet langer de dichtheidsanschakeling van de gehydrogeneerde monstertegenhanger wordt weergegeven. Dit is gunstig bij het karakteriseren van H / D gebonden op niet-uitwisselbare plaatsen in een eiwit of cofactor. De expressie van geperfectioneerd eiwit is echter zowel duur als laag in ^opbrengst60. Het Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) biedt een deuteratiefaciliteit voor gebruikers die een geperfectioneerd monster (https://www.ornl.gov/facility/csmb) willen genereren. Geperfectioneerde expressie wordt meestal uitgevoerd in een bioreactor op de schaal van 1 L die ~ 50 mg gezuiverd ^eiwit61 oplevert.

Na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens wordt verfijning en interactieve modelbouw uitgevoerd. Refinement kan worden uitgevoerd met behulp van meerdere softwaresuites, waaronder phenix.refine, nCNS of SHELXL28,31,32,33. De Phenix-suite is de meest gebruikte software voor verfijning van neutronendiffractiegegevens in combinatie met Coot, die wordt gebruikt om het model handmatig te bouwen op basis van de neutronen-SLD-kaarten34. Hoewel zowel Phenix als Coot de verwerking van neutronendiffractiegegevens mogelijk maken, kunnen ze bepaalde functies missen die nodig zijn om de eigenaardigheden te verwerken die verband houden met neutronengegevens en gedeutereerde monsters. Coot bevat bijvoorbeeld geen geometrie-optimalisatie voor gedeutereerde residuen, wat kan leiden tot complicaties tijdens het bouwen van het model, omdat de functie "Real Space Refine" resulteert in "exploderende" residuen (aanvullende figuur 26)⁶². Dit kan worden opgelost door beveiligingsbestanden te genereren voor alle gedeutereerde residuen. Dit is echter een intensief proces en dergelijke bibliotheken zijn momenteel niet openbaar beschikbaar. Bij het uitvoeren van verfijningen in Phenix worden in eerste instantie verwisselbare H / D-sites ingesteld op 0,50 bezetting voor H en D. Naarmate verfijningen worden uitgevoerd, zal de bezetting van H en D worden verfijnd volgens de neutronen-SLD-kaarten. Tijdens interactieve modelbouw zijn Fo-Fc-kaarten met verschildichtheid zeer informatief bij het beoordelen van H / D-bezettingen. Kaarten kunnen worden gebruikt om te bepalen welke sites een hoge D-bezetting hebben, wat met name informatief is op de actieve site waar protonatietoestanden katalytisch relevant ^zijn63. Dubbelzinnige situaties doen zich echter voor wanneer de H:D bezetting is dicht bij 0.70:0.30 wat resulteert in volledige signaalannulering in neutronen SLD ^kaarten64. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat quasi-Laue neutronengegevenssets vaak een volledigheid hebben van ongeveer 80%, wat lager is dan de routinematig waargenomen ≥ 98% voor röntgendiffractiegegevens. Bij het verfijnen van neutronendiffractiegegevens in Phenix worden daarom de ontbrekende waargenomen amplitudes (_Fo) berekend uit het model om de reflectielijst te voltooien, waardoor modelbias wordt geïntroduceerd. Om rekening te houden met deze mogelijke vertekening moeten "no_fill" -kaarten worden onderzocht tijdens interactieve modelbouw in tegenstelling tot "gevulde" kaarten.

Gebruikers kunnen ervoor kiezen om een gezamenlijke röntgen- / neutronengegevensverfijning van hun structuur uit te voeren, of een verfijning van alleen neutronengegevens. Het visualiseren van neutronen SLD-kaarten, met name bij een lagere resolutie, kan in eerste instantie verontrustend zijn, vooral voor een gehydrogeneerd eiwit waarin H nog steeds aanwezig is op niet-uitwisselbare locaties ondanks H / D-dampuitwisseling. Dit resulteert in annuleringen van neutronendichtheidskaarten, waardoor de indruk wordt gewekt van discontinue ^kaarten65,66. Het verzamelen van een overeenkomstige röntgendataset vult deze annuleringen op een voordelige manier aan in een gezamenlijke verfijning (figuur 13A en figuur 13B). Een gezamenlijke verfijningsstrategie omvat meestal het verfijnen van de eiwitbackbonecoördinaten ten opzichte van de röntgengegevens, terwijl de neutronendiffractiegegevens worden gebruikt om de positie en bezetting van de H / D-atomen op uitwisselbare locaties te ^verfijnen28. Aangezien de introductie van gezamenlijke H/D-bezetting op uitwisselbare locaties het aantal parameters verhoogt dat wordt verfijnd, verhoogt een gezamenlijke verfijning met röntgengegevens ook de data-tot-parameterverhouding. Een gezamenlijke verfijning vereist dat een overeenkomstige röntgendataset bij dezelfde temperatuur wordt verzameld op hetzelfde kristal of een kristal dat onder dezelfde omstandigheden is gekweekt. Voor neutronendiffractiegegevens die bij kamertemperatuur (300K) worden verzameld, moet de overeenkomstige röntgengegevensset bij kamertemperatuur worden verzameld met behulp van een strategie voor het verzamelen van gegevens met een lage dosis om stralingsschade te beperken. Geperuteerde monsters daarentegen bieden verbeterde en continue neutronen SLD-kaarten, omdat ze niet dezelfde grootte van H / D-signaalannulering bezitten. De neutronenverstrooiingslengte van bepaalde elementen, waaronder metalen en zwavel, maakt ze echter slecht zichtbaar in neutronen-SLD-kaarten, zelfs als het eiwit is geperfectioneerd (figuur 13C-F)¹⁸. Als een metaal moet worden gekarakteriseerd, is het het beste om röntgendiffractie te gebruiken in een gezamenlijke verfijning of spectroscopische technieken toe te passen om diffractie-experimenten aan te vullen. Neutronen-only data verfijningen worden vaak uitgevoerd wanneer de neutronen dataset een hoge resolutie heeft of als een geperfectioneerd eiwit werd gebruikt. Bovendien is de verfijning van gegevens over alleen neutronen bijzonder nuttig als een eiwit dat zeer gevoelig is voor stralingsschade wordt bestudeerd, omdat een van röntgenstraling afgeleide structuur stralingsgeïnduceerde artefacten kan bezitten. Om een verfijning van alleen neutronengegevens uit te voeren, moet worden nagegaan of de overeenkomstige neutronendataset voldoende volledigheid en resolutie heeft.

ORNL biedt twee faciliteiten voor het verzamelen van neutronendiffractiegegevens: de IMAGINE-bundellijn bij de HFIR en de MaNDi-bundellijn bij de ^SNS36,67. Hoewel beide instrumenten effectieve middelen bieden voor het verzamelen van een neutronendiffractiedataset met vergelijkbare principes, heeft elk instrument unieke specificaties waarmee rekening moet worden gehouden bij het aanvragen van bundeltijd. IMAGINE verzamelt quasi-Laue-gegevens en is geoptimaliseerd voor het verzamelen van kamertemperatuurgegevens over kristallen met eenheidscellen tot ~ 100 Å. MaNDi kan worden gebruikt voor het verzamelen van kamertemperatuur- en cryotemperatuurgegevens met behulp van TOF-Laue-verzameling op kristallen met eenheidscellen tot ~ 300 Å. Voorafgaand aan het verzamelen van een volledige dataset, wordt een test uitgevoerd op het kristal om de kwaliteit van het verkregen diffractiepatroon te evalueren waarin het kristal wordt blootgesteld aan de neutronenbundel voor een enkel frame. Als het kristal van voldoende kwaliteit is, zal een volledige neutronendiffractie-dataset worden verzameld, geïndexeerd, geïntegreerd, geschaald en samengevoegd in een proces dat analoog is aan röntgengegevensverwerking. IMAGINE maakt gebruik van Lauegen en Lscale en MaNDi maakt gebruik van het Mantid-pakket en maakt gebruik van driedimensionale profielfitting48,50,51,68,69,70. Wetenschappers die gebruikers worden in een van deze faciliteiten zullen worden voorzien van een dataset in MTZ- of HKL-formaat voor verdere analyse.

Neutronendiffractie is een niet-destructieve, zeer gevoelige techniek voor het onderzoeken van de protonatietoestand en waterstofbruginteracties van biologische macromoleculen. Het is vooral nuttig voor fotogevoelige eiwitten en metalloproteïnen. Verschillende overwegingen met betrekking tot de techniek en de verwerking van de gegevens moeten in aanmerking worden genomen voordat een experiment wordt uitgevoerd, maar de uitkomst levert resultaten op die waardevol inzicht kunnen geven in het katalytische mechanisme van het eiwit van belang. Neutroneneiwitkristallografie vormt een aanvulling op computationele, structurele, biochemische en spectroscopische studies, waardoor het een waardevol hulpmiddel is in de toolbox van de bioloog met technieken die worden gebruikt om biologische macromoleculen te karakteriseren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342