Methodenartikel

Evaluatie van de impact van hydraulische breuk op stromen met behulp van microbiële moleculaire handtekeningen

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61904

⸱

4 april 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Juniata College, 2Wright Labs, LLC, 3Department of Biological Sciences, Michigan Technological University, 4Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 5Department of Civil and Environmental Engineering, University of Tennessee

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de effecten van hydraulische breuken op nabijgelegen beken te onderzoeken door hun water- en sedimentmicrobiële gemeenschappen te analyseren.

Samenvatting

Hydraulische fracking (HF), gewoonlijk "fracking" genoemd, maakt gebruik van een mengsel van hogedrukwater, zand en chemicaliën om rotsen te breken, waarbij olie en gas vrijkomen. Dit proces heeft een revolutie teweeggebracht in de Amerikaanse energiesector, omdat het toegang geeft tot hulpbronnen die voorheen onbereikbaar waren en nu tweederde van het totale aardgas in de Verenigde Staten produceren. Hoewel fracking een positieve impact heeft gehad op de Amerikaanse economie, hebben verschillende studies de schadelijke milieueffecten ervan benadrukt. Van bijzonder belang is het effect van fracking op bovenloopstromen, die vooral belangrijk zijn vanwege hun onevenredig grote impact op de gezondheid van het hele stroomgebied. De bacteriën in die stromen kunnen worden gebruikt als indicatoren voor de gezondheid van de stroom, omdat de aanwezige bacteriën en hun overvloed in een verstoorde stroom naar verwachting verschillen van die in een verder vergelijkbare maar ongestoorde stroom. Daarom is dit protocol bedoeld om de bacteriële gemeenschap te gebruiken om te bepalen of stromen zijn beïnvloed door fracking. Hiertoe moeten sediment- en watermonsters worden verzameld van beken in de buurt van fracking (mogelijk beïnvloed) en stroomopwaarts of in een ander stroomgebied van fracking-activiteit (niet-beïnvloed). Die monsters worden vervolgens onderworpen aan nucleïnezuurextractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing om de samenstelling van microbiële gemeenschap te onderzoeken. Correlationele analyse en machine learning-modellen kunnen vervolgens worden gebruikt om te identificeren welke kenmerken verklarend zijn voor variatie in de gemeenschap, evenals identificatie van voorspellende biomarkers voor de impact van fracking. Deze methoden kunnen een verscheidenheid aan verschillen in de microbiële gemeenschappen tussen bovenloopstromen onthullen, gebaseerd op de nabijheid van fracking, en dienen als basis voor toekomstig onderzoek naar de milieueffecten van fracking-activiteiten.

Inleiding

Hydraulic fracturing (HF), of "fracking", is een methode van aardgaswinning, die steeds vaker voorkomt naarmate de vraag naar fossiele brandstoffen blijft stijgen. Deze techniek bestaat uit het gebruik van krachtige boorapparatuur om een mengsel van water, zand en chemicaliën in methaanrijke schalieafzettingen te injecteren, meestal om ingesloten gassen vrij te maken1.

Omdat deze onconventionele oogsttechnieken relatief nieuw zijn, is het belangrijk om de effecten van dergelijke praktijken op nabijgelegen waterwegen te onderzoeken. Fracking-activiteiten verplichten het opruimen van grote stukken land voor het transport van apparatuur en de constructie van putpads. Ongeveer 1,2-1,7 hectare land moet worden vrijgemaakt voor elke putpad2,wat mogelijk van invloed is op de afvoer en waterkwaliteit van het systeem3. Er is een gebrek aan transparantie rond de exacte chemische samenstelling van frackingvloeistof, inclusief welke biociden worden gebruikt. Bovendien heeft fracking afvalwater de neiging om zeer zout te zijn2. Bovendien kan het afvalwater metalen en van nature voorkomende radioactieve stoffen bevatten2. Daarom is de mogelijkheid van lekken en morsen van frackingvloeistof als gevolg van menselijke fouten of storingen in de apparatuur zorgwekkend.

Van beekecosystemen is bekend dat ze zeer gevoelig zijn voor veranderingen in omliggende landschappen4 en belangrijk zijn voor het behoud van biodiversiteit5 en een goede nutriëntenkringloop6 binnen het hele stroomgebied. Microben zijn de meest voorkomende organismen in zoetwaterstromen en zijn dus essentieel voor de kringloop van voedingsstoffen, biologische afbraak en primaire productie. Microbiële gemeenschapssamenstelling en -functie dienen als geweldige hulpmiddelen om informatie over het ecosysteem te verkrijgen vanwege hun gevoeligheid voor verstoring, en recent onderzoek heeft duidelijke verschuivingen aangetoond in waargenomen bacteriële assemblages op basis van de nabijheid van fracking-activiteit7,8. Beijerinckia, Burkholderiaen Methanobacterium werden bijvoorbeeld geïdentificeerd als verrijkt in stromen in de buurt van fracking, terwijl Pseudonocardia, Nitrospiraen Rhodobacter werden verrijkt in de stromen die niet in de buurt van fracking7 kwamen.

Next generation sequencing van het 16S ribosomale RNA (rRNA) gen is een betaalbare methode om de samenstelling van de bacteriële gemeenschap te bepalen die sneller en goedkoper is dan whole genome sequencing benaderingen9. Een gangbare praktijk op het gebied van moleculaire ecologie is om het zeer variabele V4-gebied van het 16S rRNA-gen te gebruiken voor sequencingresolutie, vaak tot op geslachtsniveau met een breed identificatiebereik9, omdat het ideaal is voor onvoorspelbare omgevingsmonsters. Deze techniek is op grote schaal geïmplementeerd in gepubliceerde studies en is met succes gebruikt om de impact van fracking-operaties op aquatische omgevingen te identificeren7,8. Het is echter vermeldenswaard dat bacteriën verschillende kopieaantallen van het 16S rRNA-gen hebben, wat hun gedetecteerde abundanties beïnvloedt10. Er zijn een paar hulpmiddelen om dit te verklaren, maar hun werkzaamheid is twijfelachtig10. Een andere praktijk die snel in prevalentie groeit en deze zwakte mist, is metatranscriptomische sequencing, waarbij al het RNA wordt gesequenced, waardoor onderzoekers zowel actieve bacteriën als hun genexpressie kunnen identificeren.

Daarom omvat dit protocol, in tegenstelling tot methoden in eerder gepubliceerde studies7,8,11,12,ook monsterverzameling, conservering, verwerking en analyse voor het onderzoeken van de microbiële gemeenschapsfunctie (metatranscriptomics). De stappen die hierin worden beschreven, stellen onderzoekers in staat om te zien welke impact, indien aanwezig, fracking heeft gehad op de genen en routes die door microben in hun stromen tot expressie worden gebracht, inclusief antimicrobiële resistentiegenen. Bovendien is het detailniveau dat wordt gepresenteerd voor monsterverzameling verbeterd. Hoewel verschillende van de stappen en notities voor de hand liggend lijken voor ervaren onderzoekers, kunnen ze van onschatbare waarde zijn voor degenen die net met onderzoek beginnen.

Hierin beschrijven we methoden voor het verzamelen en verwerken van monsters om bacteriële genetische gegevens te genereren als een middel om de impact van fracking op nabijgelegen stromen te onderzoeken op basis van de jarenlange ervaring van onze laboratoria. Deze gegevens kunnen worden gebruikt in downstream-toepassingen om verschillen te identificeren die overeenkomen met de frackingstatus.

Protocol

1. Verzameling van sedimentmonsters voor nucleïnezuurextractie

  1. Dompel een steriele conische buis van 50 ml onder in het beekwater. Draag handschoenen tijdens het verzamelen van monsters om ongewenste menselijke besmetting te voorkomen. Voer deze stap uit vanaf de kust of stroomopwaarts gericht als u in het water bent.
  2. Terwijl de conische buis ondergedompeld is, verwijdert u de dop en gebruikt u deze om ongeveer 3 ml sediment van een diepte van 1 tot 3 cm in de conische buis te scheppen.
  3. Verwijder de conische buis uit het water en dump al het water, behalve een dunne laag die het sedimentmonster bedekt (ongeveer 1 ml).
  4. Voeg met behulp van een pipet van 1000 μL en geschikte pipetpunten 3 ml DNA/RNA-conserveermiddel (zie tabel met materialen voor de specificaties voor conserveermiddelen) toe aan het verzamelde monster. Bewaar de pipetpunten in een steriele pipetpuntdoos en bevestig ze alleen vlak voor gebruik en na gebruik weggegooid. Keer de afgedekte conische buis 10 keer om om ervoor te zorgen dat het conserveermiddel en het monster grondig worden gemengd.
    OPMERKING Stap 1.4 is niet nodig, maar het wordt sterk aanbevolen als RNA later uit de sedimenten moet worden geëxtraheerd.
  5. Plaats de monsters op ijs voor de rest van de monsterverzameling. Bewaar bij terugkomst van de verzameling in een vriezer bij -20 °C als de monsters moeten worden gebruikt voor 16S-analyse (DNA), of -70 °C, als ze moeten worden gebruikt voor metatranscriptomics-analyse (RNA).

2. Filtercollectie voor nucleïnezuurextractie

  1. Verwijder de dop van een steriele fles van 1 L. Terwijl u stroomopwaarts of vanaf de kust kijkt, vult u de fles met beekwater naar boven en gooit u deze vervolgens weg. Herhaal dit proces nog twee keer om de fles te conditioneren. Vul de hele fles een vierde keer en dop hem.
    OPMERKING: Als een fles van 1 L wordt hergebruikt, kan deze worden gesteriliseerd door gedurende 2 minuten te spoelen met 10% bleekmiddel, gevolgd door drie keer spoelen met gedeïoniseerd water en vervolgens eenmaal met 70% ethanol, en ten slotte autoclaveren met instellingen: 30 minuten blootstellingstijd bij 121,1 ° C en 15 minuten droogtijd. Tijdens het autoclaveren moet de dop op de fles erg los zitten om te voorkomen dat de fles tijdens het proces wordt samengedrukt.
  2. Eenmaal op een stabiel oppervlak, gebruik een steriele Luer lock spuit en trek een volledig volume op. Sluit vervolgens de spuit aan op een steriel en DNA/RNA-vrij polyethersulfonfilter met een diameter van 1,7 cm met een poriegrootte van 0,22 μm en duw het volledige volume door het filter door de zuiger helemaal naar beneden te drukken. Herhaal dit proces totdat het totale volume dat in de fles is verzameld (1 L) door het filter is geduwd.
    OPMERKING: Het volume van de spuit kan variabel zijn als de totale hoeveelheid water die door het filter wordt geduwd, wordt bijgehouden. Over het algemeen heeft 60 ml echter de voorkeur. Hoewel 1 L ideaal is, zou anekdotisch gezien een volume van ten minste 200 ml waarschijnlijk nog steeds voldoende biomassa verzamelen (uitgaande van ~ 20.000 cellen per ml) voor de extractie van DNA en RNA.
  3. Verwijder overtollig water uit het filter door ongeveer 20 ml lucht in de spuit te zuigen en door het filter te duwen.
    OPMERKING: Dit helpt verlies van het conserveermiddel te voorkomen als stap 2.4 wordt uitgevoerd.
  4. Voeg met behulp van een P1000 micropipette 2 ml DNA/RNA-conserveermiddel toe door het door de grotere opening van het filter (waar het aan de spuit was bevestigd) af te voeren terwijl u het filter horizontaal houdt. De punt van de pipet moet zich in de loop van het filter bevindt wanneer de pipet wordt ingedrukt om ervoor te zorgen dat het conserveermiddel het filter binnenkomt. Vervang de tip na elk gebruik.
    OPMERKING: Net als bij de sedimentverzameling is deze stap niet nodig, maar het wordt sterk aanbevolen voor een verhoogde nucleïnezuuropbrengst later, vooral voor RNA.
  5. Verwijder een vierkant paraffinefilm en wikkel het strak rond elke opening / uiteinde van het filter om af te sluiten. Plaats het in paraffinefolie gewikkelde filter in een steriele monsterzak en plaats vervolgens de hele zak op ijs tijdens het verzamelen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kant die wordt gebruikt om het filter te wikkelen steriel is, d.w.z. niet eerder blootgesteld aan de omgeving.
  6. Bewaar bij terugkomst van de bemonstering de filters bij -20 °C voor 16S of -70 °C voor metatranscriptomics.

3. Extractie en kwantificering van nucleïnezuur

  1. Reinig het werkgebied met 10% bleekmiddel en 70% ethanol voordat u begint met de monsteroverdracht.
  2. Gebruik voor sediment (vanaf stap 1.5) in het algemeen ~ 0,25 g monster. Vuursteriliseer een metalen gereedschap door het in een bekerglas van 70% ethanol te dopen en de ethanol tussen de monsters af te branden.
  3. Voor filters (vanaf stap 2.6) verplaatst u het filtreerpapier in een steriele buis voor extractie. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
    1. Creëer een steriel, DNA- en RNA-vrij oppervlak door aluminiumfolie te vouwen zodat het binnenste deel van de vouw niet wordt blootgesteld aan de buitenomgeving en het gevouwen stuk te autoclaveren met de instellingen: 121,1 °C en 5 minuten droogtijd.
    2. Steriliseer een vise-grip met 70% ethanol en een open vuur. Gebruik vervolgens de vise-grip om de filterbehuizing op het steriele oppervlak open te breken en de kern uit de behuizing te verwijderen.
    3. Gebruik een steriel scalpel om het filterpapier weg te snijden van de kern door aan de boven- en onderkant en vervolgens langs de naad te snijden. Vouw het filterpapier met een steriel pincet en snijd het filter vervolgens in kleine stukjes met behulp van het scalpel.
    4. Plaats de filterstukken in een microcentrifugebuis voor extractie. Zorg ervoor dat het filterpapier niet in contact komt met oppervlakken die niet zijn gesteriliseerd of waar nucleïnezuur aanwezig kan zijn, omdat dit zou leiden tot ongewenste verontreiniging van het monster.
  4. Voer DNA-isolatie uit zoals eerder beschreven13 of met behulp van een in de handel verkrijgbare kolomgebaseerde kit (zie Tabel met materialen). De stappen voor de vermelde commerciële kit worden hieronder kort beschreven.
    1. Lyseer de cellen in het monster door het over te brengen naar een kralenbuis en het gedurende ten minste 5 minuten met hoge snelheid aan een celverstoorder te onderwerpen. Centrifugeer en breng het supernatant over in een steriele microcentrifugebuis.
    2. Voeg lysisbuffer toe aan het supernatant (1:1 volume) en breng over naar het meegeleverde filter (geel). Centrifugeer het filter.
    3. Breng het filter over naar een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Voeg de bereidingsbuffer (400 μL), centrifugeer en gooi de doorstroming weg.
    4. Voeg wasbuffer (700 μL) toe, centrifugeer en gooi de doorstroming weg. Voeg vervolgens wasbuffer (400 μL) toe, centrifugeer en gooi de stroom er weer doorheen.
    5. Breng het filter over naar een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Eluteer met 50 μL DNase/RNase vrij water en laat 5 minuten op kamertemperatuur zitten voordat je gaat centrifugeren.
    6. Bereid tijdens die periode het III-HRC-filter voor door het in een opvangbuis te plaatsen en de HRC-prepoplossing (600 μL) eraan toe te voegen, gevolgd door een centrifugatiestap van 3 min bij 8.000 x g.
    7. Plaats het voorbereide filter op een steriele microcentrifugebuis. Breng het eluteerde DNA van stap 3.4.5 over naar dit filter en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.000 x g. De doorstroming bevat het geëxtraheerde DNA.
  5. Bewaar DNA-extracten voor zowel sedimenten als filters bij -20 °C.
    OPMERKING: DNA-extracten kunnen ongeveer 8 jaar bij -20 °C worden bewaard, uitgaande van een stabiele temperatuur, beperkte blootstelling aan licht en geen schadelijke verontreinigingen14.
  6. Voer RNA-isolatie uit volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar RNA-extracten bij -80 °C.
    1. Lyseer de cellen in het monster door het over te brengen naar een kralenbuis en het gedurende ten minste vijf minuten met hoge snelheid aan een celverstoorder te onderwerpen. Centrifugeer en breng het supernatant over in een steriele microcentrifugebuis.
    2. Voeg lysisbuffer toe aan het supernatant (1:1 volume) en breng over naar de meegeleverde kolom (geel). Centrifugeer de kolom.
    3. Voeg een gelijk volume van 95-100% ethanol toe aan de doorstroming en meng door vijf keer op en neer te pipetteren.
    4. Plaats de IICG-kolom (groen) op een steriele microcentrifugebuis. Breng de gemengde oplossing over in de kolom en centrifuge.
    5. Voeg wasbuffer (400 μL) toe, centrifugeer en gooi de doorstroming weg.
    6. Voeg 5 μL DNase I en 75 μL DNA-verteringsbuffer toe aan de kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    7. Voeg de voorbereidingsbuffer (400 μL) toe, centrifugeer en gooi de doorstroming weg.
    8. Voeg wasbuffer (700 μL) toe, centrifugeer en gooi de doorstroming weg. Voeg vervolgens wasbuffer (400 μL) toe, centrifugeer en gooi de stroom er weer doorheen.
    9. Breng de kolom over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Eluteer met 50 μL DNase/RNase vrij water en laat 5 minuten zitten voordat je gaat centrifugeren.
    10. Bereid tijdens die incubatieperiode het III-HRC-filter voor door het in een opvangbuis te plaatsen en de HRC-voorbereidingsoplossing (600 μL) eraan toe te voegen, gevolgd door een centrifugatiestap van 3 minuten bij 8.000 x g.
    11. Plaats het voorbereide filter op een steriele microcentrifugebuis. Breng het elueerde RNA van stap 3.6.9 over naar dit filter en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.000 x g. De doorstroming bevat het geëxtraheerde RNA.
      OPMERKING: RNA-extracten kunnen slechts één jaar worden bewaard voordat ze beginnen af te breken15. Zowel DNA- als RNA-extracten worden afgebroken door herhaaldelijk vries-ontdooien. Sommige protocollen maken de extractie van zowel DNA als RNA uit hetzelfde monstermogelijk 16,17.
  7. Kwantificeer de geëxtraheerde DNA- en RNA-monsters met behulp van een fluorometer of een spectrofotometer. Zie tabel 1 bijvoorbeeld dna-concentratiewaarden van fluorometers. Voor een voorbeeld van een spectrofotometerkwantificeringsprotocol, zie referentie18. Sediment DNA-concentratiewaarden met de kit vermeld in table of materials variëren over het algemeen van 1 tot 40 ng / μL, terwijl filter-DNA-concentratiewaarden de neiging hebben te variëren van 0,5 tot 10 ng / μL. Sediment RNA-concentratiewaarden met de kit vermeld in tabel van materialen variëren over het algemeen van ongeveer 1 tot 20 ng / μL, terwijl filter RNA-concentratiewaarden meestal lager zijn, meestal variërend van 0,5 tot 5 ng / μL.

4. 16S rRNA bibliotheek creatie

  1. Reinig het werkgebied met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Het werkgebied moet een afgesloten ruimte zijn die laminaire stromingsomstandigheden kan produceren (laminaire stromingskap).
  2. Gebruik de DNA-extracten (uit stap 3.5) en bereid monsters voor 16S rRNA amplicon sequencing met een standaard PCR-protocol, zoals beschreven op de website van het Earth Microbiome dat het V4 hypervariabele gebied van 16S rRNA19 versterkt onder laminaire stroomomstandigheden.
  3. Bereid een 2% agarose gel zoals eerder beschreven en laat het stollen17. Meng 7 μL PCR-product en 13 μL DNase-vrij water. Voeg een gel loading dye toe tot een eindconcentratie van 1x. Zodra agarose is gestold, laadt u deze PCR-productmix op een 2% agarose-gel.
    OPMERKING: Als alternatief kan in plaats daarvan een pre-cast gel worden gebruikt, omdat deze gels sneller lopen en vooraf worden gemaakt.
  4. Laat de gel gedurende 60-90 minuten op 90 V draaien om te controleren op de bandgrootte van 386 als succesvolle versterking voor 16S rRNA V4-amplicons, met behulp van het protocol van het Aardmicrobioom.

5. DNA 16S rRNA bibliotheek zuivering

  1. Pool 10 μL PCR-producten voor de monsters die heldere banden opleverden en 13 μL voor de monsters die zwakke banden opleverden in een steriele microcentrifugebuis van de juiste grootte.
  2. Controleer de concentratie van het resulterende zwembad met behulp van een fluorometer of spectrofotometer en bereid een 2% agarose-gel zoals voorheen. Idealiter zou het zwembad een concentratie van ten minste 10 ng / μL moeten hebben en de meeste monsters zouden een concentratie van ongeveer 25 ng / μL moeten hebben gehad.
  3. Concentratie en volume als het toelaat, belasting ongeveer 150-200 ng in een put van 2% agarose gel.
  4. Voer de gel 60-90 min uit op 90 volt.
  5. Zuiver de gepoolde bibliotheek door een 2% agarose-gel te gebruiken.
    1. Schrap de 386 bp DNA-band uit de gel en zuiver de gepoolde bibliotheek met behulp van een in de handel verkrijgbare kit zoals eerder beschreven20. Eluteer het gezuiverde DNA met 30 μL van 10 mM Tris-Cl (pH 8,5). Voer deze stap uit in een ander gebied dan DNA- of RNA-extractie om toekomstige besmetting te voorkomen, omdat het snijden van de gel PCR-ampliconen op zowel de experimentator als het omliggende gebied zal verspreiden.
  6. Controleer de concentratie van het gezuiverde zwembad met behulp van een fluorometer of spectrofotometer. Als de zuivering goed is verlopen, moet de concentratie minstens de helft zijn van die van het ongezuiverde zwembad. Over het algemeen moet de uiteindelijke concentratie variëren van 5 tot 20 ng / μL.
  7. Stuur de gezuiverde bibliotheken voor sequencing van de volgende generatie. Zorg ervoor dat ze koud worden gehouden tijdens het transport door droogijs in de zeecontainer op te snijgen.

6. Creatie en zuivering van RNA-bibliotheken

  1. Verschillende commerciële kits kunnen worden gebruikt om RNA-bibliotheken te maken. Voor welke gebruikte ook, volg het protocol van de fabrikant zoals geschreven tijdens het werken in een steriele laminaire stromingsomgeving. Een zeer samengevatte versie van het protocol voor kit in de tabel met materialen wordt hieronder weergegeven21.
    1. Maak de eerste streng cDNA synthese master mix (8 μL nucleasevrij water en 2 μL First Strand Synthesis Enyzme Mix) en voeg deze toe aan het monster. Plaats het monster in de thermocycler met de voorwaarden die in het protocol zijn gespecificeerd.
    2. Maak de tweede streng cDNA-synthesemastermix (8 μL Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 4 μL Second Strand Synthesis Enzyme Mix en 48 μL nucleasevrij water) op ijs en voeg het toe aan het monster. Plaats in een thermocycler die gedurende een uur op 16 °C is ingesteld.
    3. Zuiver de reactie door de meegeleverde kralen (144 μL) toe te voegen en twee 80% ethanolwassingen (200 μL) uit te voeren.
    4. Eluteer met de meegeleverde TE-buffer (53 μL) en breng 50 μL van het supernatant over op een schone PCR-buis. Plaats de PCR-buis op ijs.
    5. Maak de end prep master mix (7 μL End Prep Reaction Buffer en 3 μL End Prep Enzyme Mix) op ijs en voeg deze toe aan de PCR-buis. Plaats de PCR-buis in een thermocycler met de voorwaarden die in het protocol zijn gespecificeerd.
    6. Meng de verdunde adapter (2,5 μL), Ligation Master Mix (30 μL) en Ligation Enhancer (1 μL) oplossingen op ijs. Voeg de gemengde oplossingen toe aan het monster en plaats deze gedurende 15 minuten bij 20 °C in een thermocycler.
    7. Zuiver de reactie door de meegeleverde kralen (87 μL) toe te voegen en ethanolwassingen (200 μL) en elutie uit te voeren zoals voorheen, behalve slechts 17 μL TE toevoegen.
    8. Voeg indices (10 μL) en de Q5 Master Mix (25 μL) oplossing toe en plaats in een thermocycler met de voorwaarden beschreven in het protocol.
    9. Zuiver de reactie door de meegeleverde kralen (45 μL) toe te voegen en twee ethanolwasbeurten (200 μL) toe te voegen en elueer met 23 μL TE. Breng 20 μL over op een schone PCR-buis.
  2. Controleer de bibliotheken op detecteerbare concentraties RNA met behulp van een bioanalyzer, fluorometer of spectrofotometer.
  3. Bundel de metatranscriptomische bibliotheken in een ongeveer equimolaire verhouding.
  4. Zuiver de bibliotheek volgens hetzelfde protocol voor de 16S-bibliotheekzuivering, met uitzondering van accijnsfragmenten tussen 250 en 400 bp. Terwijl de 16S-bibliotheek een duidelijke band had die het versterkte gebied vertegenwoordigde, is het resultaat hier een uitstrijkje.
  5. Controleer de concentratie van de gezuiverde bibliotheek zoals voorheen.
  6. Verzend de gezuiverde bibliotheek met droogijs naar een sequencingfaciliteit.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen RNA-extracten naar een universiteit of een privébedrijf worden gestuurd voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing.

7. Microbiële gemeenschap analyse

  1. Zodra de sequencing is voltooid, krijgt u toegang tot de voorbeeldgegevens. Download het naar een bruikbare computer.
    OPMERKING: Idealiter moet het apparaat ten minste 16 gigabyte RAM hebben. Voor een bespreking van computervereisten (voor Qiime2), zie https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808.
  2. Gebruik software, zoals mothur, QIIME2 en R, om 16S-rRNA-gegevens te analyseren. Zie hier https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ voor een voorbeeld QIIME2 16S analyse tutorial.
  3. Gebruik voor metatranscriptomics (RNA)-gegevens HUMAnN2 en ATLAS om te bepalen welke genen en routes in de monsters aanwezig zijn.
    OPMERKING: Een voorbeeld van een metatranscriptomics-pijplijn die culmineert in diversiteit en willekeurige bosanalyse wordt gepresenteerd in het bestand Aanvullende informatie. Alle opdrachten worden uitgevoerd via de opdrachtregel, bijvoorbeeld Terminal voor Mac-gebruikers.

Resultaten

Het succes van DNA- en RNA-extracties kan worden geëvalueerd met behulp van een verscheidenheid aan apparatuur en protocollen. Over het algemeen wordt elke detecteerbare concentratie van een van beide voldoende geacht om te concluderen dat de extractie succesvol was. Als we tabel 1 onderzoeken, zouden alle extracties, op één na, succesvol worden genoemd. Falen in deze stap is vaak te wijten aan een lage initiële biomassa, slechte conservering van monsters of menselijke fouten tijdens de extractie. In het geval van filters kan de extractie succesvol zijn geweest, zelfs als de concentratie lager is dan de detectie. Als die extracten geen banden opleveren voor PCR (als ze 16S doen) of een detecteerbare concentratie na bibliotheekvoorbereiding (metatranscriptomics), dan hebben ze waarschijnlijk echt gefaald.

Als het 16S-protocol wordt gevolgd, duiden heldere banden na PCR-versterking, zoals te zien in putten 4 en 6 in figuur 1, op succes, terwijl een gebrek aan banden, zoals te zien in de andere putten in de bovenste rij, wijst op falen. Bovendien zou een heldere band in de gelstrook die een negatieve PCR-controle bevat, ook wijzen op een storing, omdat het riskant zou zijn om aan te nemen dat de verontreiniging die de negatieve controle(s) beïnvloedt, de monsters niet beïnvloedt.

Voor zowel 16S als metatranscriptomics kan het succes van sequencing worden geëvalueerd door te kijken naar het aantal verkregen sequenties(figuur 2). 16S-monsters moeten minimaal 1.000 sequenties hebben, waarbij ten minste 5.000 ideaal zijn(figuur 2A). Evenzo moeten metatranscriptomics-monsters minimaal 500.000 sequenties hebben, waarbij ten minste 2.000.000 ideaal zijn(figuur 2B). Monsters met minder sequenties dan die minima mogen niet worden gebruikt voor analyses, omdat ze mogelijk niet nauwkeurig hun bacteriële gemeenschap weergeven. Monsters die tussen het minimum en ideaal vallen, kunnen echter nog steeds worden gebruikt, hoewel de resultaten voorzichtiger moeten worden geïnterpreteerd als veel monsters in dat bereik vallen.

Het succes van de daaropvolgende downstream-analyse kan eenvoudig worden bepaald op basis van het feit of de verwachte uitvoerbestanden zijn verkregen of niet. In ieder geval moeten programma's, zoals QIIME2 en R(figuur 3),de evaluatie van potentiële significante verschillen tussen de bacteriële gemeenschappen op basis van fracking mogelijk maken. De gegevens voor figuur 3 werden verkregen door sedimentmonsters te verzamelen van eenentwintig verschillende locaties op dertien verschillende stromen voor 16S- en metatranscriptomics-analyse. Van die eenentwintig locaties waren er twaalf stroomafwaarts van fracking-activiteit en geclassificeerd als HF +, en negen van hen waren ofwel stroomopwaarts van fracking-activiteit of in een stroomgebied waar fracking niet voorkwam; deze stromen werden geclassificeerd als HF-. Naast de aanwezigheid van fracking-activiteit waren de stromen verder vergelijkbaar.

Die verschillen kunnen de vorm aannemen van consistente samenstellingsverschuivingen op basis van frackingstatus. Als dat het geval zou zijn, zou van HF+- en HF-monsters worden verwacht dat ze zich uit elkaar clusteren in een PCoA-plot, zoals het geval is in figuur 3A en figuur 3B. Om te bevestigen dat die schijnbare verschuivingen niet alleen een artefact van de wijdingsmethode zijn, is verdere statistische analyse nodig. Bijvoorbeeld, een PERMANOVA22-test op de afstandsmatrix waarop figuur 3A en figuur 3B zijn gebaseerd, onthulde significante clustering op basis van frackingstatus, wat betekent dat de waargenomen scheiding in de plot consistent is met verschillen tussen de bacteriële gemeenschappen van de monsters, in plaats van een artefact van wijding. Een significant PERMANOVA- of ANOSIM-resultaat is een sterke indicatie van consistente verschillen tussen HF + - en HF-monsters, wat erop zou wijzen dat de HF + -monsters werden beïnvloed door fracking, terwijl een hoge p-waarde zou aangeven dat de monsters niet werden beïnvloed. Metatranscriptomische gegevens kunnen ook worden gevisualiseerd en geëvalueerd met behulp van dezelfde methoden.

Onderzoek naar differentiële kenmerken (microben of functies) kan bewijs onthullen dat monsters ook zijn beïnvloed. Een methode voor het bepalen van differentiële kenmerken is het maken van een willekeurig forestmodel. Het willekeurige forestmodel kan worden gebruikt om te zien hoe goed de frackingstatus van de monsters correct kan worden geclassificeerd. Als het model toevallig beter presteert dan verwacht, zou dat extra bewijs zijn van verschillen die afhankelijk zijn van de frackingstatus. Bovendien zouden de belangrijkste voorspellers onthullen welke kenmerken het belangrijkst waren voor het correct onderscheiden van monsters (figuur 3C). Die functies zouden dan ook consistent verschillende waarden hebben gehad op basis van frackingstatus. Zodra die differentiële kenmerken zijn bepaald, kan de literatuur worden bekeken om te zien of ze eerder zijn geassocieerd met fracking. Het kan echter een uitdaging zijn om studies te vinden die differentiële functies hebben bepaald, omdat de meeste alleen 16S rRNA-samenstellingsgegevens hebben gebruikt. Daarom zou een mogelijke methode voor het evalueren van de implicaties van differentiële functies zijn om te zien of ze eerder in verband zijn gebracht met potentiële resistentie tegen biociden die vaak worden gebruikt in frackingvloeistof of dat ze kunnen helpen bij het verdragen van sterk zoute omstandigheden. Bovendien zou onderzoek naar het functionele profiel van een taxon van belang bewijs kunnen leveren voor de impact van fracking(figuur 3D). Als een taxon bijvoorbeeld wordt geïdentificeerd als differentieel door het willekeurige bosmodel, kan het antimicrobiële resistentieprofiel in HF + -monsters worden vergeleken met het profiel in HF-monsters en als ze sterk verschillen, kan dat erop wijzen dat frackingvloeistof met biociden in de stroom terecht is gekomen.

SampleIDConcentratie (ng/μL)
11.5
21.55
30.745
40.805
57.82
60.053
70.248
80.945
91.82
100.804
110.551
121.69
134.08
14Below_Detection
157.87
160.346
172.64
181.15
190.951

Tabel 1: Voorbeeld DNA concentraties op basis van Fluorometer 1x DS DNA hoge gevoeligheid assay. Extracties voor al deze monsters, met uitzondering van 14, zouden als succesvol worden beschouwd vanwege het hebben van detecteerbare hoeveelheden DNA.

figure-results-1
Figuur 1: Voorbeeld e-gel met PCR producten. De gel werd vooraf gekleurd en gevisualiseerd onder een UV-licht, waardoor het aanwezige DNA gloeide. PCR werkte voor de monsters in put 4 en 6 op de eerste rij, omdat ze beide één enkele heldere band van de verwachte grootte hadden (gebaseerd op de ladder). PCR voor de monsters in de andere zes putten faalde, omdat ze geen banden produceerden. De positieve controle (eerste put, tweede rij) had een heldere band, wat aangeeft dat PCR correct werd uitgevoerd, en de negatieve controles (put 6 en 7, tweede rij) hadden geen banden, wat aangeeft dat monsters niet besmet waren. Als een negatief een band had die zo helder was als de monsters, zou PCR als een mislukking zijn beschouwd, omdat het riskant zou zijn om aan te nemen dat de monsters amplicons hadden die niet alleen het gevolg waren van besmetting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbeeldreekstellingen. (A) 16S voorbeeldreekstellingen. Bijna al deze 16S-monsters hadden meer dan 1.000 sequenties. De zeer weinigen die minder dan 1.000 sequenties hadden, moeten worden uitgesloten van stroomafwaartse analyses, omdat ze onvoldoende sequenties hadden om hun bacteriële gemeenschappen nauwkeurig weer te geven. Verschillende sequenties hadden tussen de 1.000 en 5.000 sequenties; hoewel ze niet ideaal zijn, zouden ze nog steeds bruikbaar zijn omdat ze het absolute minimum overschrijden, en de meerderheid van de monsters overschrijdt ook het ideale minimum van 5.000. (B) Metatranscriptomics voorbeeld telt. Alle monsters overschreden zowel het minimale (500.000) als het ideale minimum (2.000.000) aantal sequenties. Daarom was sequencing voor allemaal succesvol en konden ze allemaal worden gebruikt in downstream-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeeldanalyse. (A) PCoA plot op basis van coördinaten berekend met een gewogen Unifrac afstandsmatrix gemaakt en gevisualiseerd via QIIME2. (B) PCoA-plot op basis van coördinaten berekend met de gewogen Unifrac-afstandsmatrix die wordt geëxporteerd uit QIIME2. De coördinaten werden gevisualiseerd met behulp van de Phyloseq- en ggplot2-pakketten in R. Metadata-vectoren werden op de plot aangebracht met behulp van het Vegan-pakket. Elk punt vertegenwoordigt de bacteriële gemeenschap van een monster, met dichterbij gelegen punten die meer vergelijkbare gemeenschapssamenstellingen aangeven. Clustering op basis van frackingstatus voor deze 16S sedimentmonsters werd waargenomen (PERMANOVA, p=0,001). Bovendien onthullen de vectoren dat de HF + -monsters de neiging hadden om hogere niveaus van barium, bromide, nikkel en zink te hebben, wat overeenkwam met een andere bacteriële samenstelling van de gemeenschap in vergelijking met de HF-monsters. (C) Plot van de beste voorspellers voor een willekeurig bosmodel dat testte waar bacteriële abundanties konden worden gebruikt om de frackingstatus tussen de monsters te voorspellen. Het random forest-model is gemaakt via R met behulp van het randomForest-pakket. De top 20 voorspellers worden getoond, evenals de resulterende afnames in onzuiverheid (maat voor het aantal HF + en HF-monsters gegroepeerd) in de vorm van Mean Decrease in Gini Index wanneer ze worden gebruikt om monsters te scheiden. (D) Cirkeldiagram met het antimicrobiële resistentieprofiel van het Burkholderiales-profiel op basis van metatranscriptomische gegevens. Sequenties werden eerst geannoteerd met Kraken2 om te bepalen tot welke taxa ze behoorden. BLAST werd vervolgens gebruikt met die geannoteerde sequenties en de MEGARes 2.0-database om te bepalen welke antimicrobiële resistentiegenen (in de vorm van "MEG_#") actief tot expressie werden gebracht. Antimicrobiële resistentiegenen die tot expressie werden gebracht door leden van Burkholderiales werden vervolgens geëxtraheerd om te zien welke het meest voorkwamen onder die taxa. Hoewel het duurder en tijdrovender is, maakt metatranscriptomics functionele analyses mogelijk, zoals deze, die niet kunnen worden gedaan met 16S-gegevens. Met name Kraken2 werd gebruikt voor deze voorbeeldanalyse, in plaats van HUMAnN2. Kraken2 is sneller dan HUMAnN2; het produceert echter alleen compositorische informatie, in plaats van samenstelling, bijdrage en functies (genen) en pathways zoals HUMAnN2 doet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand: een voorbeeld van een metatranscriptomics-pijplijn. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Discussie

De methoden die in dit artikel wordenbeschreven,zijn ontwikkeld en verfijnd in de loop van verschillende studies die door onze groep zijn gepubliceerd tussen 2014 en 20187,8,10 en zijn met succes gebruikt in een samenwerkingsproject om de effecten van fracking op aquatische gemeenschappen te onderzoeken in een driejarig project dat binnenkort een paper voor publicatie zal indienen. Deze methoden zullen in de loop van de rest van het project verder worden gebruikt. Bovendien beschrijft andere huidige literatuur die de impact van fracking op stromen en ecosystemen onderzoekt, vergelijkbare methoden voor het verzamelen, verwerken en analyseren van monsters7,8,10,11. Geen van die artikelen maakte echter gebruik van metatranscriptomische analyse, waardoor dit artikel de eerste is om te beschrijven hoe die analyses kunnen worden gebruikt om de impact van fracking op nabijgelegen stromen op te helderen. Bovendien zijn de hier gepresenteerde methoden voor het verzamelen van monsters gedetailleerder, evenals de maatregelen die zijn genomen om besmetting te voorkomen.

Een van de belangrijkste stappen van ons protocol is het verzamelen en bewaren van eerste monsters. Veldbemonstering en -verzameling brengt bepaalde uitdagingen met zich mee, omdat het handhaven van een aseptische of steriele omgeving tijdens het verzamelen moeilijk kan zijn. Tijdens deze stap is het van vitaal belang om besmetting van monsters te voorkomen. Om dit te doen, moeten handschoenen worden gedragen en mogen alleen steriele containers en gereedschappen in contact komen met monsters. Monsters moeten ook onmiddellijk na het verzamelen op ijs worden geplaatst om de afbraak van nucleïnezuur te verminderen. Het toevoegen van een commercieel nucleïnezuurconserveringsmiddel bij het verzamelen kan ook de nucleïnezuuropbrengst verhogen en ervoor zorgen dat monsters na het verzamelen voor langere tijd kunnen worden bewaard. Wanneer nucleïnezuurextractie wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de juiste hoeveelheid monster te gebruiken, te veel kan spinfilters verstoppen die worden gebruikt voor extractie (voor die protocollen die er gebruik van maken), maar te weinig kan resulteren in lage opbrengsten. Zorg ervoor dat u de instructies volgt voor de kit die wordt gebruikt.

Net als bij veldverzameling is het vermijden of minimaliseren van verontreiniging ook belangrijk tijdens nucleïnezuurextractie en monstervoorbereiding, vooral bij het werken met monsters met een lage nucleïnezuuropbrengst, zoals suboptimale sedimentmonsters (monsters die een grote hoeveelheid grind of rotsen bevatten) of watermonsters. Daarom moeten, net als bij het verzamelen van monsters, handschoenen worden gedragen tijdens al deze stappen om besmetting te verminderen. Bovendien moeten alle werkoppervlakken die tijdens laboratoriumprocedures worden gebruikt, vooraf worden gesteriliseerd door af te vegen met een 10% bleekoplossing, gevolgd door een 70% ethanoloplossing. Voor pipetteerstappen (3-6) moeten filtertips worden gebruikt om verontreiniging door de pipet zelf te voorkomen, waarbij de uiteinden worden vervangen telkens wanneer ze een niet-steriel oppervlak raken. Alle gereedschappen die worden gebruikt voor laboratoriumwerk, inclusief pipetten, moeten voor en na worden afgeveegd met de bleek- en ethanoloplossingen. Om de verontreiniging te evalueren, moeten extractie blanco's en negatieven (steriele vloeistof) worden opgenomen tijdens elke set nucleïnezuurextracties en PCR-reacties. Als kwantificering na extracties een detecteerbare hoeveelheid DNA/RNA in de negatieven aan het licht komt, kunnen extracties worden herhaald als er nog voldoende monster over is. Als negatieve monsters voor PCR versterking vertonen, moet probleemoplossing worden uitgevoerd om de bron te bepalen en vervolgens moeten de monsters opnieuw worden uitgevoerd. Om rekening te houden met lage niveaus van verontreiniging, wordt aanbevolen om extractie blanco's en PCR-negatieven te sequencen, zodat de verontreinigingen kunnen worden geïdentificeerd en, indien nodig, verwijderd tijdens computationele analyse. Omgekeerd kan PCR-versterking ook falen door verschillende oorzaken. Voor omgevingsmonsters is remming van de PCR-reactie vaak de boosdoener, wat te wijten kan zijn aan een verscheidenheid aan stoffen die interfereren met Taq-polymerase23. Als remming wordt vermoed, kan water van PCR-kwaliteit (zie Tabel met materialen)worden gebruikt om de DNA-extracten te verdunnen.

Dit protocol heeft een paar opmerkelijke beperkingen en potentiële problemen. Het verzamelen van monsters kan een uitdaging zijn voor zowel water- als sedimentmonsters. Om voldoende biomassa te krijgen, moet idealiter 1 L beekwater door een filter worden geduwd. De poriën van het filter moeten klein zijn om microben te vangen, maar kunnen ook sediment vangen. Als er door recente regenval veel sediment in het water zit, kan het filter verstoppen waardoor het moeilijk wordt om het hele volume door het filter te duwen. Voor sedimentverzameling kan het een uitdaging zijn om de diepte van sediment tijdens het verzamelen in te schatten. Bovendien is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het verzamelde sediment voornamelijk grond is, omdat kiezels en rotsen zullen leiden tot een lagere nucleïnezuuropbrengst en mogelijk geen nauwkeurige weergave zijn van de microbiële gemeenschap. Ten slotte is het ook van vitaal belang dat monsters na het verzamelen op ijs worden bewaard, vooral als er geen conserveermiddel wordt gebruikt.

Hoewel dit protocol zowel metatranscriptomics als 16S-labprotocollen omvat, moet worden benadrukt dat deze twee methoden zeer verschillend zijn in zowel het proces als het type gegevens dat ze leveren. Het 16S rRNA-gen is een algemeen gericht gebied, sterk geconserveerd in bacteriën en archaea, en nuttig voor het karakteriseren van de bacteriële gemeenschap in een monster. Hoewel een gerichte en specifieke aanpak, is het oplossen van soortenniveau vaak onbereikbaar en is het karakteriseren van nieuw uiteenlopende soorten of stammen moeilijk. Integendeel, metatranscriptomics is een bredere benadering die alle actieve genen en microben in een monster vangt. Terwijl 16S alleen gegevens levert voor identificatie, kan metatranscriptomics functionele gegevens leveren, zoals tot expressie gebrachte genen en metabole routes. Beide zijn waardevol en in combinatie kunnen ze onthullen welke bacteriën aanwezig zijn en welke genen ze tot expressie brengen.

Dit artikel beschrijft methoden voor veldverzameling en monsterverwerking voor zowel 16S rRNA als metatranscriptomische analyses in de context van het bestuderen van fracking. Daarnaast beschrijft het verzamelmethoden voor hoogwaardige DNA / RNA uit monsters met een lage biomassa en voor langdurige opslag. De hier beschreven methoden zijn het hoogtepunt van onze ervaringen met het verzamelen en verwerken van monsters in onze inspanningen om te leren hoe fracking nabijgelegen stromen beïnvloedt door de structuur en functie van hun microbiële gemeenschappen te onderzoeken. Microben reageren snel op verstoringen, en bijgevolg kunnen welke microben aanwezig zijn en de genen die ze tot expressie brengen informatie geven over de effecten van fracking op ecosystemen. Over het algemeen kunnen deze methoden van onschatbare waarde zijn voor ons begrip van hoe fracking deze belangrijke ecosystemen beïnvloedt.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de financieringsbronnen erkennen voor de projecten die hebben geleid tot de ontwikkeling van deze methoden, met die bronnen: het Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) via het Precollege en Undergraduate Science Education Program, evenals door de National Science Foundation (http://www.nsf.gov) via NSF-awards DBI-1248096 en CBET-1805549.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
200 Proof EthanolThermo Fisher ScientificA4094400 mL moet worden toegevoegd aan Buffer PE (zie Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) en 96 mL moet worden toegevoegd aan de DNA/RNA Wash Buffer (zie ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol).
Extra ethanol is nodig voor de ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep en NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits.
AgaroseThermo Fisher ScientificBP1356-100100 g per fles. 0,6 g agarose zou nodig zijn om een 2% 30 mL gel te maken.
Desinfecterend bleekmiddelWalmart (Clorox)Geen catalogusnummerGebruik een 10% bleekmiddeloplossing voor het reinigen van het werkgebied voor en na laboratoriumprocedures
DNA gel loading dyeThermo Fisher ScientificR0611Elk door de gebruiker gemaakt (d.w.z. niet-e-gel) dient ladingsverf te bevatten met alle monsters in de verhouding van 1 µL verf op 5 µL monster
DNA ladderMilliporeSigmaD3937-1VLEen ladder moet op elke gel/e-gel worden uitgevoerd
DNA/RNA Shield (2x)Zymo ResearchR1200-1253 mL per sedimentmonster (50 mL conische) en 2 mL per watermonster (filter)
Ethidium bromideThermo Fisher ScientificBP1302-10Wordt gebruikt voor het kleuren van door gebruikers gemaakte e-gels
Forward PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)51-01-19-060,5 µL per PCR-reactie
IsopropanolMilliporeSigma563935-1LMeestal minder dan 2 mL per bibliotheek. Het benodigde volume varieert naargelang de massa van het uitgesneden gelfragment (zie Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). 
PCR-grade waterMilliporeSigma331593200113 µL per PCR-reactie (ervan uitgaande dat 1 µL van sjabloon-DNA-monster wordt gebruikt)
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific1300001210 µL per PCR-reactie
Reverse PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)51-01-19-070,5 µL per PCR-reactie
TBE Buffer (Tris-boraat-EDTA)Thermo Fisher ScientificB521 L van 10x TBE-buffer (30 mL van 1x TBE-buffer zou nodig zijn om één 30 mL gel te maken)
1 L flesThermo Fisher Scientific02-893-4EEen nodig per stroom (dezelfde fles kan voor meerdere stromen worden gebruikt als deze tussen gebruiken wordt gesteriliseerd)
1,5 mL MicrocentrifugebuizenMilliporeSigmaBR780400-450EA5 microcentrifugebuizen zijn nodig per DNA-extractie en er zijn er nog 3 nodig om RNA te zuiveren (zie ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol)
2% Agarose e-gelThermo Fisher ScientificG401002Elke gel kan 10 monsters uitvoeren (dus 9 met een PCR-negatief en 8 als de extractie-negatief op dezelfde gel wordt uitgevoerd)
50 mL ConicalsCellTreat2294211 50 mL conische nodig per sedimentmonsters
500 mL BekerMilliporeSigmaZ740580Slechts 1 nodig (voor vlamsterilisatie)
AluminiumfolieWalmart (Reynolds KITCHEN)Geen nummerAluminiumfolie kan worden gevouwen en geautoclaveerd. Het deel dat niet is blootgesteld aan de omgeving kan vervolgens worden gebruikt als een steriele, DNA- en RNA-vrije oppervlakte voor het verwerken van filters
(een gevouwen stuk per filter om kruisbesmetting te voorkomen)
AutoclaafGettingeLSS 130Slechts een nodig
CentrifugeMilliporeSigmaEP5404000138-1EASlechts 1 nodig
KoelerULINES-22567Bijna elke koeler kan worden gebruikt. Deze is vermeld omdat hij van schuim is gemaakt, waardoor hij lichter is en dus gemakkelijker mee te nemen voor veldbemonstering.
Disruptor GenieBio-Rad3591456Slechts een nodig
ElectroforesekamerBio-Rad1664000EDUSlechts 1 nodig
Elektroforese voedingBio-Rad1645050Slechts 1 nodig
Vriezer (-20 C)K2 SCIENTIFICK204SDFEen nodig om DNA-extracten op te slaan
Vriezer (-80 C)K2 SCIENTIFICK205ULTEen nodig om RNA-extracten op te slaan
HandschoenenThermo Fisher Scientific19-020-352Het catalogusnummer is voor Medium handschoenen.
HitteblokMilliporeSigmaZ741333-1EASlechts een nodig
LabbranderSterlitech177200-00Slechts een nodig
LaminairstroomkapAirClean SystemsAC624LFUVSlechts 1 nodig
BibliotheekzuiveringskitQiagen28704Een kit heeft genoeg voor 50 reacties
MagneetplaatAlpaquaA001219Slechts een nodig
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75004061Slechts een nodig
Micropipet (1000 µL volume)Pipette.comL-1000Slechts 1 nodig
Micropipet (2 µL volume)Pipette.comL-2Slechts 1 nodig
Micropipet (20 µL volume)Pipette.comL-20Slechts 1 nodig
Micropipet (200 µL volume)Pipette.comL-200RSlechts 1 nodig
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification BeadsNew England BioLabs Inc.E7775SEen kit heeft genoeg reagentia voor 24 monsters.

Referenties

  1. The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013).
  2. Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
  3. McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
  4. Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
  5. Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
  6. Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
  7. Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683(2018).
  8. Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697(2018).
  9. Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133(2019).
  10. Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41(2018).
  11. Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522(2014).
  12. Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
  13. JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020).
  14. Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011).
  15. ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020).
  16. QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020).
  17. ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020).
  18. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  19. 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018).
  20. Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/5063/gel-purification (2020).
  21. New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020).
  22. Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
  23. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microbi le gemeenschapstroomsedimentwaterbemonsteringextractie van nucle nezuren16S rRNA sequencingmetatranscriptomische analysePERMANOVA analyseRandom Forest modelantimicrobi le resistentie

Gerelateerde artikelen