Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.

Samenvatting

Het beheersen van biologische processen met behulp van licht heeft de nauwkeurigheid en snelheid waarmee onderzoekers veel biologische processen kunnen manipuleren verhoogd. Optische controle zorgt voor een ongekend vermogen om de functie te ontleden en heeft het potentieel om nieuwe genetische therapieën mogelijk te maken. Optogenetische experimenten vereisen echter adequate lichtbronnen met ruimtelijke, temporele of intensiteitscontrole, vaak een knelpunt voor onderzoekers. Hier beschrijven we hoe u een goedkoop en veelzijdig LED-verlichtingssysteem kunt bouwen dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende beschikbare optogenetische hulpmiddelen. Dit systeem is configureerbaar voor handmatige of computerbesturing met instelbare LED-intensiteit. We bieden een geïllustreerde stapsgewijze handleiding voor het bouwen van het circuit, het computergestuurd maken en het construeren van de LED's. Om de montage van dit apparaat te vergemakkelijken, bespreken we ook enkele basissoldeertechnieken en leggen we de circuits uit die worden gebruikt om de LED's te besturen. Met behulp van onze open-source gebruikersinterface kunnen gebruikers nauwkeurige timing en pulseren van licht op een pc of een goedkope tablet automatiseren. Deze automatisering maakt het systeem nuttig voor experimenten die LED's gebruiken om genen, signaalroutes en andere cellulaire activiteiten te regelen die grote tijdschalen overspannen. Voor dit protocol is geen voorafgaande expertise in elektronica vereist om alle benodigde onderdelen te bouwen of om het verlichtingssysteem te gebruiken om optogenetische experimenten uit te voeren.

Inleiding

Optogenetische hulpmiddelen worden alomtegenwoordig en er wordt voortdurend nieuwe technologie ontwikkeld om biologische processen zoals genexpressie, celsignalering en nog veel meer^optisch te beheersen ^1,2,3. De mogelijkheid om cellulaire processen met licht te regelen, zorgt voor snelle kinetiek, strakke ruimtelijke controle en dosisafhankelijke regulatie die kan worden geregeld door lichtintensiteit en blootstellingstijd. Om deze tools te gebruiken, is een apparaat nodig om deze parameters te regelen. We hebben onlangs een genetisch gecodeerde PhyB-PIF3 zoogdiergenschakelaar ontwikkeld die genen reversibel activeert en deactiveert met behulp van rood / verrood licht, respectievelijk⁴. Dit systeem werd getest in verschillende zoogdiercellijnen en maakte de ongeëvenaarde inductie van genexpressie mogelijk, zelfs met zeer kleine hoeveelheden licht, waaronder lichtpulsen. Onderzoekers die de PhyB-schakelaar en soortgelijke hulpmiddelen ^5,6 willen gebruiken, vragen vaak om informatie over methoden om de intensiteit en duur van de verlichting te regelen. Daarom hebben we dit protocol ontwikkeld met stapsgewijze instructies om een bredere acceptatie van deze tools voor optogenetica mogelijk te maken.

Vóór het wijdverbreide gebruik van LED's werden breedbandlichtbronnen met filters gebruikt om lichtgevoelige eiwitten zoals fytochromen^{7 te bestuderen}. Onlangs zijn sommige LED-verlichtingssystemen gepubliceerd samen met optogenetische hulpmiddelen 8,9,10,11,12, maar die protocollen kunnen aanzienlijke expertise in elektronica / software vereisen, gespecialiseerde apparatuur vereisen (bijv. 3D-printers, lasersnijmachines of fotomaskers), of bieden niet de stapsgewijze instructies die sommige onderzoekers nodig zouden hebben om in te zetten voor hun onderzoeksbehoeften. Hoewel onafhankelijke controle van individuele putten in een multiwellplaat nuttig kan zijn, is het vaak niet nodig wanneer onderzoekers slechts verschillende monsters in licht en donker of rood licht versus verrood licht hoeven te vergelijken. Ook zijn veel bestaande commerciële systemen duur, met beperkte aanpassingsmogelijkheden. De LED's die in dit protocol worden beschreven, zijn echter kosteneffectief, helder en kunnen op vele manieren worden gemonteerd; daarom kunnen ze worden gebruikt om verschillende soorten monsters te verlichten. Met het protocol en de meegeleverde software kunnen LED's variërend van ultraviolet (UV) tot NIR worden gebruikt en bestuurd met software om optogenetische experimenten uit te voeren met UVR8^13,14, Dronpa^15,16,^{LOV-domeinen 17,18}, Step Function Opsins^19,20, CRY2^21,22, PhyB ^{4,23,24 ,25}, bacteriële fytochromen 26,27,28,29 en andere lichtgevoelige systemen 30,31,32.

Dit protocol vormt een tutorial voor de assemblage van de circuits en andere hardware die nodig is om verschillende parameters voor lichtstimulatie te regelen, evenals de moleculaire / cellulaire hulpmiddelen om een optogenetisch experiment uit te voeren. Daarnaast rapporteren we plasmiden geoptimaliseerd van Kyriakakis et ^al.4 die kleiner en stabieler zijn voor klonen. Via dit protocol kunnen biologen zonder expertise in elektronica en optica verlichtingssystemen bouwen die flexibel en robuust zijn. Stap voor stap laten we zien hoe je LED-systemen bouwt, waardoor de technische bottleneck voor de bredere adoptie van optogenetische tools wordt weggenomen. Dit systeem kan gemakkelijk worden gebruikt in de meeste celkweekincubators, zelfs als ze geen draadpoorten bevatten. Zo hebben we het LED-systeem langer dan 6 maanden onafgebroken in een bevochtigde CO_2-incubator gehouden zonder dat de prestaties afnemen. We leggen ook uit hoe je het LED-systeem op een computer aansluit en koppelt met open-source software die we op GitHub aanbieden (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Het bouwen van een systeem met behulp van dit protocol biedt onderzoekers de basiskennis om potentiële problemen op te lossen, onderdelen te vervangen en functionaliteiten te verbeteren / uit te breiden.

Overzicht van het systeem

Het bouwen van het verlichtingssysteem omvat (1) het bouwen van het elektronische circuit, (2) het bouwen van de randapparatuur (voedingskabel, aan / uit-schakelaar, enz.), (3) het bouwen van de LED's, (4) het assembleren van al deze componenten en (5) het installeren van de software om de LED's te bedienen met een gebruikersinterface (figuur 1A). Eenmaal voltooid, kan het verlichtingssysteem maximaal vier LED's onafhankelijk van elkaar bedienen met een gebruikersinterface (figuur 1B). De gebruikersinterface stelt elke LED in staat om met bepaalde tijdsintervallen te pulseren en na een bepaalde tijd uit te schakelen. Er is ook een start-vertraging om verlichtingsprogramma's op een bepaald tijdstip te starten. Potentiometers (POTs) regelen de intensiteit van elke LED onafhankelijk of kunnen worden gebruikt voor handmatige LED-besturing zonder computer. De draden naar de LED's kunnen elke aangepaste lengte hebben, waardoor ze gemakkelijk in een incubator of laboratoriumruimte kunnen worden geplaatst. Vanwege het hoge vermogen van deze LED's kunnen ze worden gebruikt om een groot gebied met een enkele LED van een afstand te verlichten.

LED driver beschrijving

Om de intensiteit van de LED's van stroom te voorzien en te regelen, doorloopt dit protocol stappen om een "LED-stuurprogramma" te bouwen. Elke LED heeft een reeks spanningen waarin het werkt (figuur 1C). Tijdens bedrijf kan de uitgangsspanning van de regelaar, die de lichtintensiteit regelt, worden afgestemd door een potentiometer. De POT varieert de weerstand en past de uitgangsspanning/helderheid aan. Tuning met een 1kΩ (1 kilo-ohm) POT geeft wat we het "hoogspanningscircuit" noemen en heeft een bereik van 1,35 V tot 2,9 V. Aangezien 2,9 V te hoog is voor het bedienen van de LED's met lagere spanning (figuur 1C), tonen we een enkele wijziging (weerstand 3 of "R3" aanvullende figuur 1A) die het bereik beperkt om overeen te komen met de laagspannings-LED's. R3 dient om de maximale spanning die op de LED's wordt toegepast te verlagen tot 1,85 V (assemblage beschreven in aanvullende figuur 8) wanneer deze parallel loopt met de potentiometer. Door spanning te gebruiken om de helderheid te regelen in plaats van stroom, is het systeem flexibeler voor LED's met verschillende bedrijfsspanningen. Figuur 1C bevat een lijst van de hoog- en laagspannings-LED's om de optimale circuitselectie te begeleiden. Dit ontwerp houdt de minimale spanning laag genoeg zodat de LED volledig uit is wanneer de potentiometer is uitgeschakeld en de spanning niet boven de typische bedrijfsspanning van de LED kan komen. Voor PhyB-optogenetica gebruiken we dieprode en verrode LED's, die het laagspanningscircuit gebruiken.

Beschrijving van het LED-computerbesturingssysteem

Het LED-verlichtingssysteem kan worden gebruikt voor constante verlichting zonder een computer of microcontroller. Voor pulserende programma's en voor het regelen van individuele LED-timing moet echter een microcontroller worden geïnstalleerd. Om een microcontroller te gebruiken om de LED's te bedienen, is een transistor nodig om de microcontroller op het circuit aan te sluiten. Deze transistor detecteert spanning van de microcontroller en schakelt over van geleidend of isolerend. Om de "aan" en "uit" te regelen, gebruiken we een zogenaamde "NPN switching type transistor" (2N2222) als een controleerbare shunt over R2 (aanvullende figuur 1A). Wanneer de spanning van de microcontroller wordt toegepast op de transistorbasis, wordt de transistor geleidend en maakt de LED-spanning laag, waardoor de LED wordt uitgeschakeld. Zo worden de LED- en transistor-aan- en uit-toestanden rechtstreeks bestuurd door de microcontroller, die wordt bestuurd door de software die op de pc is geïnstalleerd.

Voor het maken van het verlichtingssysteem zijn de volgende stappen vereist: Bouw het elektrische circuit; bouw de voeding, handmatige aan/ uit-schakelaar, POP's en microcontrolleraansluiting; bouw de LED's; een zwarte doos te plaatsen die past bij het verlichtingssysteem; sluit alle bedrading en apparaten aan; installeer de LED-besturingssoftware, stimuleer de cellen met licht; genexpressie meten met behulp van een dubbele luciferasetest.

Protocol

1. Bouw het elektrische circuit

OPMERKING: Het protocol voor het bouwen van een enkel circuit voor een beschikbare LED wordt hier beschreven. Instructies om dit uit te breiden tot vier LED's zijn opgenomen in de aanvullende informatie.

1. Zet de rookabsorber en de soldeerbout aan. Voeg water toe aan de afwasspons, houd het soldeer bij de hand.
   LET OP: Zorg ervoor dat u veiligheidsmaatregelen neemt om rook te verwijderen en brandwonden te voorkomen.
2. Begin met het solderen van circuitcomponenten aan de printplaat (printplaat) in de volgorde die wordt weergegeven in de aanvullende panelen.
   OPMERKING: Gebruik een kleine hoeveelheid soldeer op de soldeerboutpunt om eerst het metaal van het onderdeel en de printplaat te verwarmen en extra soldeer rechtstreeks op de componenten te smelten; flux kan veel helpen.
3. Soldeerspringdraden en -onderdelen (aanvullend figuur 2 en aanvullend figuur 3).
   1. Gebruik voor de jumperdraden (de geïsoleerde bedrading die twee punten op de printplaat verbindt) twee stukken oranje [7,6 mm (0,3 inch)] en gele [12 mm (0,4 inch)] draden uit de jumperkit.
   2. Klem de printplaat op de "helpende handen" en steek de jumperdraden in de volgende gaatjes, buig de aansluitingen 45 graden en voeg flux toe (figuur 2, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3): a1 en a3 → grond (-) (oranje), a7 → voeding (+) # 7 (geel), d2 → d6 (geel).
   3. Soldeer en trim vervolgens de achterkant van de draden.
   4. Plaats de LM317T-spanningsregelaar in de volgende gaatjes, buig de pinnen en voeg flux toe (figuur 2 en aanvullende figuur 4): Adj → e5, V_uit → e6, V_in → e7.
   5. Soldeer eerst de linker- en rechterterminals, trim ze, soldeer en trim de middelste terminal.
   6. Om het laagspanningsbereik van het circuit in te stellen, plaatst u een weerstand van 820 Ω helemaal naar beneden in gaatjes, soldeer en trim c2 → c5 (figuur 2 en aanvullende figuur 5).
   7. Om LED-besturing door de microcontroller mogelijk te maken, plaatst u de transistor in b3-b5 (figuur 2 en aanvullende figuur 6): Collector → b3, Base → b4, Emitter → b5.
      OPMERKING: Wees je bewust van de oriëntatie van de transistor om correct in te brengen; controleer de specificaties om de aanduiding Collector, Base en Emitter te vinden.
4. Soldeer de wire-to-wire connectoren voor de POT, LED, microcontroller en voedingsbron.
   OPMERKING: Let op de kleur van de draden van de draad-naar-draad connectoren en of u een vrouwelijke of mannelijke draad-naar-draad connector gebruikt.
   1. Bepaal of een "laagspanningscircuit" of een "hoogspanningscircuit" vereist is voor de gewenste LED (figuur 1C).
      OPMERKING: Als de LED op de lijst "laagspanning" staat, is een weerstand parallel aan de POT vereist.
   2. Voor het "laagspanningscircuit" of "hoogspanningscircuit" plaatst u de draad van een vrouwelijke draad-naar-draadconnector door gat a5 (aanvullende figuur 7). Soldeer nog niet op zijn plaats als u het laagspanningscircuit maakt.
      OPMERKING: Draai de kale draaduiteinden zodat de kleine draadhaartjes niet uitbladderen. Als de draad te dik lijkt om door het gaatje te duwen zonder te rafelen, knip dan 2-6 strengen door en draai ze vervolgens weer aan elkaar (aanvullende figuur 7B-D).
   3. Als u het "hoogspanningscircuit" maakt, gaat u verder met stap 1.4.5. Als u het "laagspanningscircuit" maakt, duwt u een weerstand van 560Ω door hetzelfde gat (a5) en soldeert u met de draad-naar-draad connectorkabel.
   4. Sluit het andere uiteinde van de weerstand aan op de massa (aanvullende figuur 7G).
   5. Steek het andere uiteinde van de vrouwelijke draad-naar-draadconnector gesoldeerd in een gat van 5 dat het met de grond verbindt en soldeer het (aanvullende figuur 8A, B).
   6. Voor de aansluiting van de microcontroller steekt u het ene uiteinde van een mannelijke draad-naar-draadconnector in gat a4 en het andere in een gat dat is aangesloten op de massa (aanvullende figuur 9A-C).
   7. Voor de LED-aansluiting steekt u het ene uiteinde van een vrouwelijke draad-naar-draadconnector in gat a2 en het andere uiteinde in een gat dat op de grond is aangesloten (aanvullende figuur 9D, E).

2. Bouw voeding, handmatige aan / uit-schakelaar, POTs en microcontroller-aansluiting

1. Bouw de voeding.
   1. Soldeer een oranje [7,6 mm (0,3 inch)] jumper van a29 naar de grond (aanvullende figuur 10).
   2. Soldeer een vrouwelijke draad-naar-draadconnector van a30 naar de voeding (+) (aanvullende figuur 11A-C).
   3. Soldeer een mannelijke draad-naar-draadconnector van c29 tot c30 (aanvullende figuur 11D-F).
   4. Knip de connector af van een voedingskabel, leg de draden bloot en strip ze (aanvullende figuur 12A-C).
   5. Voeg flux toe aan de draden voordat u soldeert met behulp van een fluxpen (aanvullende figuur 3G).
   6. Plaats een krimpbuis van 3,18 mm (1/8 inch) rond een mannelijke draad-naar-draadconnector en een dikker stuk 4,76 mm (3/16 inch) over de voedingsdraad (aanvullende figuur 12D).
   7. Draai de draden van de voeding en de mannelijke draad-naar-draadconnector samen en soldeer (aanvullende figuur 12E, 13A, B).
   8. Plaats de krimpbuis met een kleinere diameter van 3,18 mm (1/8 inch) over de aansluitingen en krimp ze met een warmtepistool (aanvullende figuur 13C, D).
   9. Plaats een krimpbuis met een grotere diameter van 4,76 mm (3/16 inch) over de kleinere krimpbuis 3,18 mm (1/8 inch) en verwarm opnieuw (aanvullende figuur 13E, F).
2. Bouw de handmatige aan/uit-schakelaar.
   1. Plaats de krimpbuis 3,18 mm (1/8 inch) over de draden voor de schakelaar (aanvullende figuur 14A).
   2. Draai en soldeer de draden van een mannelijke draad-naar-draadconnector (aanvullende figuur 14B,C).
   3. Plaats de krimpbuis 3,18 mm (1/8 inch) over gesoldeerde delen en krimp met een warmtepistool (aanvullende figuur 14D, E).
3. Sluit de mannelijke wire-to-wire connector aan op de POT.
   1. Lus de zwarte draad van de draad-naar-draadconnector rond de middelste aansluiting van de POT (aanvullende figuur 15B).
   2. Draai de draad die strak rond de terminal is gespannen en soldeer deze (aanvullende figuur 15C).
      OPMERKING: Kleine precisietangen kunnen helpen bij het maken van een strakke draai.
   3. Herhaal dit met de rode draadverbinding met de terminal, zoals in aanvullende figuur 15D.
   4. Gebruik een tang om het metalen lipje bij de rode pijl te breken (aanvullende figuur 15E,F).
4. Bouw de microcontrollerverbinding (alleen nodig voor computergestuurde LED's).
   1. Als u een LED-stuurprogramma maakt voor meer dan één LED, snijdt u de zwarte draden af van alle vrouwelijke draad-naar-draadconnectoren op één na (aanvullende figuur 16A).
   2. Krimp de uiteinden van de draad-naar-draad connectoren, zoals aangegeven (aanvullende figuur 16B-D).
   3. Duw de gekrompen uiteinden door de rechthoekige connector (aanvullende figuur 16E).

3. Bouw de LED's

1. Strip de draaduiteinden (~5 mm) en breng flux aan met een fluxpen zoals in aanvullende figuur 3G.
   OPMERKING: Om de draden efficiënt op de LED-basis te solderen, moet flux worden toegevoegd aan de contacten op de LED-basis en de draden.
2. Vertin de draad door de draad van onderaf te verwarmen en soldeer van bovenaf toe te voegen (aanvullende figuur 17B).
3. Gebruik de fluxpen om flux op het oppervlaktecontact van de LED-basis te plaatsen (aanvullende figuur 17C).
4. Plaats een royale hoeveelheid soldeer op een grote soldeerpunt (~ 4-5 mm) (aanvullende figuur 17D), gebruik deze om de LED-basis bij het contact te verwarmen (aanvullende figuur 17E). Sleep het soldeer na enkele seconden over het contact (aanvullende figuur 17F). Herhaal stap 3.3 tot en met 3.4 op het andere contact (aanvullende figuur 17G).
   LET OP: De LED-basis kan erg heet worden tijdens het solderen. Plaats de LED-basis op een oppervlak dat niet smelt of brandt.
5. Klem de zwarte draad op het contact "C+" (de kathode) met behulp van de haarclips (aanvullende figuur 18A).
6. Plaats een royale hoeveelheid soldeer op de grote soldeerpunt (aanvullende figuur 18B) en druk deze op de draad totdat het soldeer op de LED-basis smelt (aanvullende figuur 18C). Houd de draad vast (aanvullende figuur 18D) en verwijder de soldeerbout terwijl u de draad op zijn plaats houdt (aanvullende figuur 18E).
7. Plaats een kleine hoeveelheid soldeerpasta op de pads voor de LED-aansluitingen (aanvullende figuur 19A, B) en plaats de LED over de pads met behulp van een tang (aanvullende figuur 19C).
   OPMERKING: Als de plaatsing een beetje uitvalt, is het goed; het zal op zijn plaats gaan zodra de soldeerpasta smelt.
8. Houd de rode draad op de "A+" (anode) en knip deze vast met een haarclip (aanvullende figuur 20A-C).
9. Plaats een royale hoeveelheid soldeer op de grote soldeerpunt (aanvullende figuur 20D) en druk deze op de draad totdat het soldeer op de LED-basis en de soldeerpasta onder de LED smelten (aanvullende figuur 20E).
   OPMERKING: Nadat de soldeerpasta is gesmolten, wordt de kleur zilver (aanvullende figuur 20H, I).
10. Kies de lengte van de draad die nodig is voor de gewenste opstelling. Strip de LED-draden en een mannelijke draad-naar-draadconnector (aanvullende figuur 21A) en voeg vervolgens flux toe zoals in aanvullende figuur 3G.
11. Plaats de krimpbuis over de draden. Gebruik een krimpbuis van 3,18 mm (1/8 inch) over de draad-naar-draadconnectoren en een krimpbuis van 4,76 mm (3/16 inch) over de draad (aanvullende figuur 21B).
12. Klem de draad-tot-draadconnector vast met een "helpende handen" en draai het uiteinde van de connector met de draad (aanvullende figuur 21C) en soldeer ze. Herhaal dit met de andere draad (aanvullende figuur 21D,E).
13. Plaats de krimpbuizen van 3,18 mm (1/8 inch) over het soldeer en krimp (aanvullende figuur 21F-G).
14. Plaats de krimpbuis van 4,76 mm (3/16 inch) over de krimpbuis van 3,18 mm (1/8 inch) en krimp (aanvullende figuur 21H-I).
15. Klem de LED-draden de "helpende handen" met tape eronder (aanvullende figuur 22A).
16. Meng epoxy volgens de instructies van de fabrikant en verdeel over de bovenkant van de gesoldeerde LED (aanvullende figuur 22B). Laat een nacht staan om uit te harden.
17. Als u deze monteert met een aanraakbevestiging, snijdt u een klein stukje van de aanraakbevestiging (aanvullende figuur 23A) en drukt u deze gedurende 30 s tegen de achterkant van de LED.
18. Gebruik een snel roterend gereedschap om een inkeping te maken op het deksel van een zwarte doos (aanvullende figuur 23C-E).
19. Bouw een bevestiging voor een enkele LED via een privacyfilm.
    1. Boor met behulp van de spadeboor een gat van 1,75 cm (11/16 inch) door de bovenkant van een zwarte doos waar de LED wordt geplaatst (aanvullende figuur 24A).
    2. Maak met behulp van een snel roterend gereedschap een inkeping aan één kant van het gat om ruimte te maken voor de LED-draad, zoals weergegeven in aanvullende figuur 24A.
    3. Knip een stuk privacyfilm (25-30 mm) en plak op de binnenkant van de zwarte doos die het gat bedekt waar de LED doorheen zal branden (aanvullende figuur 24A).
    4. Plaats de LED buiten de zwarte doos bovenop het gat met privacyfilm en tape op zijn plaats met elektrische tape (aanvullende figuur 24B-E).

4. Plaats een zwarte doos die past bij het verlichtingssysteem

1. Boor voor een vier LED-systeem vier gaten van 0,83 cm (21/64 inch) op het deksel op 3,81 cm (1,5 inch) uit elkaar waar de potentiometers worden bevestigd (aanvullende figuur 25).
2. Snijd met behulp van een snel roterend gereedschap een rechthoekig gat van 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 inch x 0,75 inch) in de linkerbovenhoek (aanvullende figuur 25).
3. Boor met behulp van de spadeboor een gat van 1,75 cm (11/16 inch) op de zwarte doos (aanvullende figuur 26).
4. Vijl de gaten en steek de grommet in het ingeboorde gat (aanvullende figuur 26).
5. Schuur voor de computergestuurde LED's het gebied waar de microcontroller in een zwarte doos wordt gelijmd, evenals de onderkant van de microcontrollerhouder.
6. Klik de microcontroller op de houder voordat u de houder in de zwarte doos vastzet en epoxy ze vervolgens op hun plaats (aanvullende figuur 27A).
7. Gebruik schuurpapier om de onderkant van twee clips en het gebied in een zwarte doos waar het circuit wordt geplaatst te schuren en bevestig de clips in de zwarte doos met de epoxy (aanvullende figuur 27A).
8. Bevestig de printplaat in clips (aanvullende figuur 27B).
9. Duw de aan/uit-schakelaar door het vierkante gat in het deksel in aanvullende figuur 25 en klik deze op zijn plaats (aanvullende figuur 28A).
10. Duw de POTs door de gaten op het deksel, schroef op hun plaats (aanvullende figuur 28A) en plaats de knop op de POT (aanvullende figuur 28B).

5. Sluit alle bedrading en apparaten aan

1. Label de draad-naar-draad connectoren (bijv. LED, POT, COM) (aanvullende figuur 29A).
2. Bevestig de gekrompen connectoren uit stap 2.4 (aanvullende figuur 16) aan de mannelijke draad-naar-draadconnector tussen de twee vrouwelijke connectoren (POT en LED) (aanvullende figuren 7A en S37).
3. Sluit de gekrompen uiteinden aan op de microcontroller (aanvullende figuur 30).
4. Trek de USB-kabel door de grommet en sluit deze aan op de microcontroller.
5. Trek de draden voor de LED's door de grommet en sluit deze aan op de vrouwelijke draad-naar-draadconnector aan de linkerkant van de microcontrolleraansluiting (aanvullende figuren 9D en 38).
6. Trek de draad voor de voeding door de grommet en sluit deze aan op de mannelijke wire-to-wire connector aan de rechterkant van de printplaat (aanvullende figuur 11D).
7. Sluit de mannelijke draad-naar-draadconnector van de aan/uit-schakelaar aan op de vrouwelijke draad-naar-draadconnector aan de rechterkant van de printplaat (aanvullende figuur 11A).
8. Sluit de mannelijke draad-naar-draad connectoren van de POP's op het deksel aan op de vrouwelijke draad-naar-draad connectoren op de printplaat (aanvullende figuren 8 en 36).
   OPMERKING: Schakel het circuit niet in zonder dat de potentiometers zijn aangesloten.

6. Installeer de LED-besturingssoftware

OPMERKING: Zie de gedetailleerde software-installatie-instructies in het aanvullende bestand op Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

1. Download en installeer de software voor het programmeren van de microcontroller
2. Download en installeer de pakketbeheerder.
3. Programmeer de microcontroller.
4. Download en installeer de runtime-engine.
5. Download de gebruikersinterface.

7. Stimuleer de cellen met licht

1. Transfecte HEK293 cellen.
   1. Plaat HEK293 cellen bij 100k cellen per put in een 24-well plaat.
   2. Gebruik de voorbeeldtabel om serumvrije media, polyethylenimine (PEI) en DNA-volumes (aanvullende figuur 39) en transfect te berekenen met behulp van het protocol van de fabrikant.
2. Cellen stimuleren met licht.
   OPMERKING: Cellen moeten na transfectie in het donker worden gehouden of worden behandeld met behulp van een lichtbron die het optogenetische systeem niet prikkelt.
   1. Bepaal welk type stimulatie op de cellen zal worden gebruikt (continu licht, pulserende intensiteit, enz.).
   2. Als de POP's zijn uitgeschakeld (tegen de klok in), schakelt u de LED-voeding in.
   3. Plaats een lichtmeter in de zwarte doos waar de cellen worden geplaatst en plaats het deksel met de LED over de meter. Pas de lichtintensiteit indien nodig aan.
   4. Als u de computer gebruikt om de LED's te bedienen, opent u de software van de gebruikersinterface.
   5. Programmeer de gebruikersinterface (figuur 5A,B).
      1. Selecteer in het linkerbovenpaneel de COM-poort voor de microcontroller en klik op Verbinden.
      2. Gebruik de panelen aan de rechterkant om elke LED te programmeren. Voor continu licht selecteert u een willekeurige tijd behalve nul in de "Tijd aan" en stelt u de "Time Off" in op nul.
      3. Programmeer in het rechteronderpaneel de hoofdtimingsregeling.
         1. Als u de verlichting wilt uitstellen, selecteert u een startvertraging (UU:MM).
         2. Als u alle LED's na een aangegeven tijd wilt uitschakelen, selecteert u een looptijd (HH:MM).
         3. Start het verlichtingsprogramma door op de knop Uitvoeren te klikken (figuur 5A).

8. Meet genexpressie met behulp van een dubbele luciferasetest

1. Bereid luciferasereagens door 10 ml luciferasebuffer te mengen met luciferasereagens en aliquot in buisjes van 1 ml die gedurende maximaal 1 jaar bij -80 °C moeten worden bewaard.
2. Bereid lysisbuffer 5x in 1x voor 100 μL voor N + 2 putjes. bijvoorbeeld voor 30 monsters, 30 x 20 μL 5X lysisbuffer en 30 x 80 μL MQ H₂O.
3. Renilla substraatoplossing bereiden: 20 μL Renilla substraat voor 1 ml Renilla buffer (deze hoeveelheid is geschikt voor 10 testen).
4. Verwijder cellen uit de incubator, adem de media op, voeg 100 μL 1x lysisbuffer per put toe en plaats deze op een shaker bij 100 RPM gedurende 15 minuten.
5. Zet in -20 °C gedurende ten minste 1 uur.
6. Voeg 100 μL luciferasereagens per monster toe aan een putje van een witte 96-wellsplaat.
7. Stel de plaatlezer in voor luminescentie. Stel met behulp van de luminometermodule van de plaatlezer de integratie in op 1 s.
8. Voeg ontdooide lysaten toe in putjes onder het luciferasereagens. Meng met behulp van een meerkanaals pipet 20 μL monster in het luciferasereagens en meet onmiddellijk de luminescentie.
9. Voeg na het afgelezen plateau 100 μL Renilla substraatoplossing toe en scan opnieuw.
10. Deel het Luciferase-signaal door het Renilla-signaal om rekening te houden met de efficiëntie van transfectie.
11. Vergelijk luciferasesignalen genormaliseerd voor transfectie-efficiëntie (vergelijk bijvoorbeeld het signaal van met rood licht verlichte en verrode licht verlichte monsters).

Resultaten

Zodra het voedingscircuit, de voeding, de aan/uit-schakelaar, de POP's en een LED zijn gemonteerd (tot aanvullende figuur 21), kan het circuit worden getest. Met alle POP's op hun plaats, regelt de POT de LED-intensiteit. Zodra de assemblage is voltooid tot aanvullende figuur 29, kan het systeem handmatig worden gebruikt voor optogenetica of andere toepassingen. Het volledige systeemvermogen kan handmatig worden bediend met de aan / uit-schakelaar. De intensiteit van elke LED kan onafhankelijk worden geregeld met behulp van de POT die op elk circuit is aangesloten.

Na het installeren van de software en het programmeren van de microcontroller, kan de gebruikersinterface communiceren met de microcontroller. Met de gebruikersinterface kunnen de LED's op verschillende manieren tijdelijk worden bediend: (1) elke LED kan worden geprogrammeerd om gedurende een bepaalde tijd aan te blijven, (2) elke LED kan worden geprogrammeerd om te pulseren, (3) een globale startvertraging (bijvoorbeeld bij transfecteren en schijnend licht 24 uur later) kan worden geprogrammeerd (figuur 6B), (4) de totale tijd dat het programma na de vertraging wordt uitgevoerd. Er zijn twee gebruikersinterfaces, een met grotere knoppen die twee LED's tegelijk kunnen bedienen en een andere die vier LED's kan bedienen (figuur 5A, B). De twee LED-gebruikersinterface is geoptimaliseerd voor tablets en is voldoende om rode en verrode LED's voor veel experimenten te besturen.

Voor grotere experimenten kan de tweede gebruikersinterface worden gebruikt om maximaal vier LED's aan te sturen. Bij het induceren van genexpressie hangt het verwachte resultaat af van verschillende parameters. Deze omvatten inductietijd, inductieniveaus (bijv. Hoeveelheid licht of medicijn) en kopienummer van het induceerbare construct in de cel. Om dit aan te tonen, hebben we de PhyB-genschakelaar getransfecteerd samen met verschillende hoeveelheden reporter-DNA (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% en 8% van het getransfecteerde DNA) (figuur 6A) en verlicht zoals weergegeven in figuur 6B. In monsters die PhyB bevatten, maar geen plasmide om fycocyanobilin (PCB-chromofoor) te produceren (d.w.z. niet reagerend op licht), neemt de expressie/lekheid van luciferasegenen toe met de hoeveelheid reporter-DNA (figuur 6C) (Verrode P < 0,0001, Lineaire regressie gevolgd door een Wald-test), (Red P < 0,0001, Lineaire regressie gevolgd door een Wald-test). Bovendien, wanneer de volledige PhyB-genschakelaar, inclusief de PCB-chromofoorproducerende plasmide (lichtgevoelige cellen), wordt verlicht voor verrood licht, neemt de Luciferase-expressie ook toe met de toenemende constructhoeveelheden van de verslaggever in de transfectiemix (figuur 6C, D) (Ver-rood licht P < 0,0001, Lineaire regressie gevolgd door een Wald-test). Evenzo, wanneer de lichtgevoelige cellen worden verlicht met rood licht, neemt de luciferase-expressie ook toe met een verhoogde hoeveelheid reporter (P < 0,0001, lineaire regressie gevolgd door een Wald-test). Bij het vergelijken van inductieniveaus van de met rood licht behandelde cellen met de met ver rood licht behandelde cellen, vonden we een kleine afname in de vouwactivering met toenemende hoeveelheid reporters (figuur 6E) (P = 0,0141, lineaire regressie gevolgd door een Wald-test).

Figuur 1: Een basisschakeling voor een enkele LED. (A) Een stroomdiagram met een overzicht van de stappen die nodig zijn om het LED-verlichtingssysteem te bouwen. (B) Het LED-verlichtingsbesturingssysteem. (links) Schakelkast voor het regelen van LED-intensiteit en timing. (midden) Een pc-tablet met een gebruikersinterface voor het aansturen van LED's. (rechts) Een zwarte doos voor het monteren van LED's en het plaatsen van cellen voor optische stimulatie. (C) Tabel om te bepalen of de LED een hoog- of laagspanningscircuit vereist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Instructies voor het solderen van de componenten op hun plaats. (A) Een voorbeeld van de stap-voor-stap cartoon instructies voor het bouwen van het circuit. (B,C) Voorbeeldinstructies met foto's van het apparaat dat wordt gemonteerd. (D) Voorbeeldinstructies voor het gelijktijdig samenstellen van meerdere circuits. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Weergaven van een geassembleerd LED-besturingssysteem. (A) Een bovenaanaanzicht naar buiten van het geassembleerde systeem. (B) Een binnenaanzicht van een geassembleerd vier LED-verlichtingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Instructies voor het opnieuw solderen van de LED op het koellichaam. (A) De LED-basis en een close-up van een dieprode LED. (B) Plaatsing van soldeerpasta op de LED-basis. (C) Foto van gesoldeerde LED. Rode pijlen wijzen naar soldeerpads. Vergeleken met grijs voor het solderen (A), ziet het soldeer er na het solderen metallic/glanzend uit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Software voor het aansturen van optogenetische experimenten. (A) Een twee LED-gebruikersinterface met grote knoppen voor eenvoudig gebruik met een goedkope tablet. (B) Een gebruikersinterface met vier LED's. Beide interfaces maken onafhankelijke LED-besturing mogelijk. Voor pulseren kunnen LED's worden geprogrammeerd om in en uit te schakelen voor specifieke pulsbreedtes en gespecificeerde duur. Het pulseren kan ook een startvertraging en een vooraf bepaalde totale looptijd hebben. (C) De LED-besturingstablet gemonteerd op een celkweekincubator. (D) Illustratie van het PhyB-gensysteem wanneer het wordt verlicht met verrood licht. Verrood licht houdt het gen in de "uit" of "donkere" toestand. (E) Illustratie van het PhyB-gensysteem wanneer het wordt verlicht met rood licht. Rood licht induceert genexpressie door de interactie tussen PhyB en PIF3 te bevorderen. Deze interactie lokaliseert het genactiveringsdomein (AD) dat is gefuseerd met PIF3 tot de UAS-promotor, waardoor het reporter-gen wordt geactiveerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Verwachte resultaten met behulp van het LED-systeem om PhyB te besturen. (A) Een plasmide dat codeert voor PhyB+PIF3 twee-hybride partners (pPK-351), een plasmide dat codeert voor phycocyanobilin (PCB-chromofoor) synthese-enzymen (pPK-352) en een Luciferase reporter plasmide (pPK-202). (B) Tijdlijn van lichtinductie-experimenten voor C-E. (C) Basale transcriptieniveaus (AKA lekkage) met toenemende hoeveelheden reporter-DNA. "Lek" monsters worden niet getransfecteerd met pPK-352 (d.w.z. niet reagerend op licht), maar worden verlicht met rood of verrood licht. Light Switch (LS) monsters omvatten alle licht-gen schakelaar plasmiden en worden verlicht met rood of verrood licht. (D) Lichtinductieniveaus als reactie op rood en verrood licht. (LS-Far-red light zijn dezelfde gegevens in C en D.) (E) Vouw inductie van luciferase in cellen verlicht met rood licht / verrood licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

 Klik hier om de aanvullende figuren 1-39 te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Elektronisch drivercircuit voor meerdere LED's. (A) Het schakelschema voor een enkel LED-systeem. (B) Het schakelschema voor een vier-LED-systeem.

Aanvullende figuur 2: Plaatsing van de circuitinterconnecties. (A) Klem uw printplaat op uw helpende handen. (B) Positie van hoofdcircuitspringers in de doorgaande gaten in de afbeelding. (C) Diagram van draadconnectoren die de coördinaten in kaart brengen. Teken voor de vier LED-systemen lijnen die elk circuit verdelen zoals afgebeeld (zwarte verticale lijnen). Aanvullende figuur 31-38 beschrijft de assemblage van vier circuits tegelijkertijd.

Aanvullende figuur 3: Solderen van de draden op de printplaat. (A) Buig jumpers zodat ze direct contact maken met de PCB en op hun plaats blijven tijdens het solderen. (B) Een andere weergave van de gebogen draden. (C) Draden na solderen. (D) Bijgesneden draden op de printplaat. (E) Gekrompen isolatie na verwarming met soldeer. (F) De isolatie op zijn plaats zetten om het doorgaande gat van de grond te bedekken (blauwe pijl) (G) Flux toevoegen aan een draaduiteinde of terminal.

Aanvullende figuur 4: Solderen van de spanningsregelaar op zijn plaats. (A) Kaart van de coördinaten van de spanningsregelaar. (B) Plaatsing van de spanningsregelaar. (C) Gebogen spanningsregelaar leidt. (D) Spanningsregelaars na solderen.

Aanvullende figuur 5: Solderen van de R1-weerstand op zijn plaats. (A) Kaart van de R1 weerstand (820Ω) coördinaten. (B) De weerstand door het lood trekken met behulp van een tang (C) De getrokken weerstand dicht bij de printplaat. (D) De gesoldeerde weerstand dicht bij de pcb.

Aanvullende figuur 6: Solderen van de transistor op zijn plaats. (A) Kaart van de transistorcoördinaten en oriëntatie. (B) Noteer de oriëntatie van de transistor; het label in dit model is gericht op de spanningsregelaar (LM317T). Controleer de specificatie van de transistor om er zeker van te zijn dat de "Emitter", "Base" en "Collector" zich in de juiste gaten bevinden. (C) De transistor met de terminals gebogen voor het solderen.

Aanvullende figuur 7: Solderen van de draad-naar-draad connector voor de potentiometer op zijn plaats (plus een weerstand van 560Ω voor het laagspanningscircuit). (A) Kaart van de coördinaten van de draad-naar-draad connector (plus de R3-560Ω als het laagspanningscircuit wordt gebouwd, wordt de draad-naar-draad connector in het gat vóór de weerstand geplaatst). (B) Een vrouwelijke wire-to-wire connector. (C) Om het monteren van de weerstand en de draad-naar-draad connector in het doorgaande gat te vergemakkelijken, worden 3-5 strengen van de gevlochten draad gebogen. (D) De strengen worden afgesneden met draadsnijders zo dicht mogelijk bij de isolatie. (E) Ingebrachte rode draad van een vrouwelijke draad-naar-draad connector door het a5 doorgaande gat (voor het laagspanning circuit insert R3 door hetzelfde doorgaande gat). (F) Onderzijde van de weerstand en wire-to-wire connector voor het solderen. (G) Afbeelding van de gesoldeerde R3-weerstand die op de grond is aangesloten (F = Vrouwelijk).

Aanvullende figuur 8: Solderen van de draad-naar-draad connector voor de potentiometer aan de massa. (A) Kaart van de coördinaten van de massaverbinding voor de potentiometer wire-to-wire connector. (B) Bovenaanzicht van de potentiometer wire-to-wire connector parallel met R3 (F = Female).

Aanvullende figuur 9: Solderen van de microcontroller en LED wire-to-wire connectoren. (A) Kaart van de coördinaten van de draad-naar-draadconnector voor het aansluiten van de 2N222A en de massa op de microcontroller. (B) Gesoldeerde mannelijke wire-to-wire connector. (C) Bovenaanzicht van (B). (D) Kaart van de vrouwelijke wire-to-wire connector coördinaten voor het aansluiten van de ingang van het circuit en de aarde op de LED. (E) Gesoldeerde vrouwelijke draad-naar-draad connector (F = Vrouwelijk, M = Mannelijk).

Aanvullende figuur 10: Solderen van de jumper voor het voedingscircuit. (A) Kaart van de coördinaten van de oranje jumper voor het aansluiten van de voeding op de grond. (B) De oranje trui op zijn plaats gesoldeerd. (C) Het zicht aan de onderkant van de jumper op zijn plaats gesoldeerd.

Aanvullende figuur 11: Solderen van de aan/uit-schakelaar en de draad-naar-draadconnectoren van de voedingsbron. (A) Kaart van de coördinaten van de vrouwelijke draad-naar-draadconnector voor het aansluiten van de aan/uit-schakelaar. (B) De vrouwelijke wire-to-wire connector op zijn plaats gesoldeerd. (C) Een andere visie op (B). (D) Kaart van de coördinaten van de mannelijke draad-naar-draadconnector voor het aansluiten van de voedingsbron. (E) Gesoldeerde mannelijke wire-to-wire connector. (F) Een andere weergave van (E) (F = Vrouw, M = Man).

Aanvullende figuur 12: De voeding aansluiten op een mannelijke draad-naar-draadconnector. (A) De ongewijzigde voeding. (B) Het afsnijden van de voedingsdraden. (C) De voedingsdraden gestript en met overtollige isolatie weggesneden. (D) Plaatsing van krimpbuis rond voedingsdraden. Buizen die de twee verbindingen scheiden (rode pijlen) en buizen om de gescheiden draden vast te houden (gele pijl). (E) Gedraaide draden die de voeding verbinden met de vrouwelijke draad-naar-draadconnector.

Aanvullende figuur 13: Solderen en isoleren van de voedingsaansluiting naar een mannelijke draad-naar-draadconnector. (A) De gesoldeerde verbinding tussen de voedingsbodem en een vrouwelijke draad-naar-draadconnector. (B) De gesoldeerde verbinding tussen de positieve aansluiting van de voeding en een vrouwelijke wire-to-wire connector. (C) Krimpbuis getrokken over de gesoldeerde individuele verbindingen (rode pijl). (D) Zowel voedingsaansluitingen gesoldeerd als met warmtebehandelde krimpbuis. (E) Plaatsing van krimpbuis over individuele verbindingen (gele pijl). (F) Voltooide voeding.

Aanvullende figuur 14: Solderen van de aan/uit-schakelaar aan een mannelijke draad-naar-draadconnector. (A) Aan / uit-schakelaar met gestripte draden en krimpbuis geplaatst over de draden (rode pijlen). (B) Draden die de schakelaar en de mannelijke draad-naar-draadconnector verbinden, aan elkaar gedraaid voordat ze worden gesoldeerd. (C) Plaats de krimpbuis over de gesoldeerde verbindingen. D) Aansluitingen bedekt met de warmtebehandelde krimpbuis. (E) Een aan/uit-schakelaar gemonteerd met een mannelijke wire-to-wire connector.

Aanvullende figuur 15: Een potentiometer aansluiten op een mannelijke draad-naar-draadconnector. (A) De potentiometeronderdelen. (B) Een mannelijke draad-naar-draad connector gedraaid en gebogen om te haken rond de middelste terminal van de potentiometer. (C) Een mannelijke draad-naar-draad connector gedraaid rond de middelste terminal van de potentiometer. (D) Gesoldeerde wire-to-wire verbindingen. (E) Rode pijl die naar het metalen tabblad wijst voordat het wordt verwijderd. (F) De potentiometer na verwijdering van metalen tabs.

Aanvullende figuur 16: Bedrading van de microcontrollerverbinding. (A) Draden voor vrouwelijke draad-naar-draad connectoren gestript en gesneden ter voorbereiding op het krimpen. (B) Plaatsing van de krimp op de draad-naar-draadconnector. (C) Krimpen van de draad-naar-draad connector. (D) Gekrompen draad-naar-draad connector. (E) Volledig geassembleerde microcontrollerverbinding.

Aanvullende figuur 17: Soldeerdraden en LED op de LED-basis Deel 1. (A) Materialen die nodig zijn om de LED aan de LED-basis te solderen. (B) Het aanboren van de punt van de gestripte draad. (C) Flux aanbrengen op het contact van de LED-basis. (D) Het toevoegen van soldeer aan de grote soldeerpunt om de LED-basis te vertinten. (E) Plaatsing van soldeer op het contact om de LED-basis te verwarmen. (F) De LED-basis na het slepen van de soldeerpunt over het contact. (G) Dezelfde procedure voor het andere contact.

Aanvullende figuur 18: Soldeerdraden en LED op de LED-basis Deel 2. (A) Een vertinde draad die met behulp van een haarclip aan het contact is vastgeklikt. Merk op dat de zwarte draad is gesoldeerd aan de kathode "C-". (B) Toevoeging van een royale hoeveelheid soldeer aan de soldeerpunt. (C) De soldeerpunt drukt op de draad en smelt het soldeer op de LED-basis en de draad. (D) De draad vasthouden zodat deze blijft zitten wanneer de soldeerbout wordt verwijderd. (E) De draad op zijn plaats houden totdat het soldeer hard wordt.

Aanvullende figuur 19: Soldeerdraden en LED op de LED-basis Deel 3. (A) Gebruik een scherpe punt om soldeerpasta op de LED-basis te plaatsen voor het monteren van de LED. (B) De LED-basis met de soldeerpasta op zijn plaats. (C) Plaatsing van de LED op de LED-basis, zodat de contacten van de LED- en LED-basis overeenkomen.

Aanvullende figuur 20: Soldeerdraden en LED op de LED-basis Deel 4. (A) De zwarte draad die nog steeds door de haarclip aan het contact wordt vastgeklikt. (B,C) Met behulp van een tweede haarclip wordt de rode draad op zijn plaats gehouden. Merk op dat de rode draad is gesoldeerd aan de anode "A +". (D) Toevoeging van een royale hoeveelheid soldeermiddel aan de soldeerpunt. (E) De soldeerpunt drukt op de draad, waardoor het soldeer op de LED-basis en de draad smelt, evenals de soldeerpasta onder de LED. (F) De hete LED-basiskoeling na solderen. (G) De LED-basis met de draden en LED gesoldeerd. (H,I) Rode pijlen wijzen naar soldeerpads. Na het solderen ziet het soldeer er metallic/glanzend uit (vergeleken met grijs voor het solderen (aanvullende figuur 16D)).

Aanvullende figuur 21: De LED-draad aansluiten op een mannelijke draad-naar-draadconnector. (A) Gestripte draden en mannelijke draad-naar-draad connector naast de krimpbuis in tweeën gesneden (1/8 inch en 3/16 inch). (B) Plaatsing van de krimpbuis over de draden voordat u soldeert. (C) Draden aan elkaar gedraaid voor het solderen. (D) De gesoldeerde verbinding van de draad naar de draad-naar-draad connector. (E) Zowel de rode als de zwarte draden aan elkaar gesoldeerd. (F) Plaatsing van de 1/8 inch krimpbuis over de gesoldeerde aansluiting. (G) De krimpbuis na het krimpen met het warmtepistool. (H) Plaatsing van de 3/16 inch krimpbuis over de kleinere krimpbuis. (I) De verbinding gesoldeerd en afgedicht met de krimpbuis.

Aanvullende figuur 22: Bevestiging van de draden en LED's aan de LED-basis met behulp van epoxy. (A) Gebruik een houten applicator om epoxy in de LED-basis te plaatsen. Een tape wordt eronder geplaatst om eventuele druipende epoxy op te vangen. (B) Epoxy wordt gelijkmatig over het gehele oppervlak verspreid. (C) De LED wordt 's nachts achtergelaten om uit te harden.

Aanvullende figuur 23: Montage van LED's in een deksel van de doos. (A) Een LED met een touch-bevestigingsstuk bevestigd voor eenvoudige montage. (B) Verschillende kleuren LED's gemonteerd aan de binnenkant van een zwarte doos met behulp van een aanraakbevestiging. (C) Een inkeping op het deksel van de zwarte doos gemaakt door een snel roterend gereedschap om ruimte te maken voor de LED-draad. (D) Een zwarte doos voor het stimuleren van de cellen met aanraakbevestigingen voor het monteren van de LED. (E) Plaatsing van een multiwell schotel in de touch fastener versie van de LED box.

Aanvullende figuur 24: Montage van LED's buiten een deksel van een doos. (A) Gat geboord in het deksel van de zwarte doos met een inkeping van het snelle roterende gereedschap om ruimte te maken voor de draad (rode pijl). (B) LED geplaatst in het gat met de draad in de inkeping, op zijn plaats gehouden met elektrische tape. (C) Er worden nog twee stukjes tape gebruikt om de LED vast te zetten. De achterkant van het koellichaam wordt blootgesteld om de warmte-uitwisseling te maximaliseren. (D) Privacyfilm geplakt over het gat waar de LED wordt geplaatst. De rode pijl wijst naar de privacyfilm. (E) Een zwarte doos voor het stimuleren van de cellen met een LED gemonteerd buiten de doos en met privacyfilm voor het verspreiden van de verlichting. (F) Plaatsing van een multiwell schotel in de externe LED + privacy film versie van de LED box.

Aanvullende figuur 25: Boorgaten op het deksel van de doos voor de aan /uit-schakelaar en potentiometers. (A) Een CAD-tekening met geannoteerde afmetingen van het deksel van de doos. (B) Het deksel van de doos met de potentiometer en de gaten van de aan/uit-schakelaar.

Aanvullende figuur 26: Het draaduitlaatgat voorbereiden. (A) Een CAD-tekening met geannoteerde afmetingen. (B) Afbeelding van het geboorde gat met de boor. (C) Gladstrijken van uitlaatgaten met snel roterend gereedschap of archiveringsgereedschap. (D) Het plaatsen van grommet in uitlaatgat.

Aanvullende figuur 27: Plaatsing van de microcontroller en de pcb in de doos. (A) De microcontrollerhouder (oranje) en PCB-houders in de doos. (B) De microcontroller en PCB bevestigd in de doos.

Aanvullende figuur 28: Plaatsing van de potentiometers en de aan/uit-schakelaar. (A) Een vooraanzicht van een deksel van de doos met een aan/uit-schakelaar en vier POP's. (B) Een vooraanzicht van het deksel van de doos met potentiometerknoppen toegevoegd. (C) Een achteraanzicht van het deksel van de doos met de bevestigde onderdelen.

Aanvullende figuur 29: Het geassembleerde LED-besturingssysteem. (A) Een open besturingskast met de draden gelabeld met een labelprinter en ritssluiting voor organisatie. (B) De doos zodra deze volledig is geassembleerd met elke POT gelabeld samen met de pincode.

Aanvullende figuur 30: Plaatsing van de gekrompen draad-naar-draadconnector. (A) Foto van de gekrompen wire-to-wire connectoren voor een vier LED-microcontroller systeem. (B) Plaatsing van de gekrompen connector in de microcontrollerpoorten.

Aanvullende figuur 31: Het plaatsen van de jumperdraden. (A) Een printplaat met de coördinaten van de rode jumperdraden gelabeld. (B) Een printplaat met de coördinaten van de gele jumperdraden gelabeld.

Aanvullende figuur 32: Het plaatsen van de jumperdraden. Een printplaat met coördinaten van de gele jumperdraden.

Aanvullende figuur 33: Het toevoegen van de spanningsregelaars. De LM317T spanningsregelaars worden toegevoegd aan het circuit met hun coördinaten gelabeld in de diagrammen.

Aanvullende figuur 34: Inbrengen van de weerstanden van 820Ω. De R1-weerstanden worden aan het circuit toegevoegd met hun coördinaten gelabeld in de diagrammen.

Aanvullende figuur 35: Inbrengen van de transistors. De 2N2222A transistors worden toegevoegd aan het circuit met hun coördinaten gelabeld in de diagrammen.

Aanvullende figuur 36: Het plaatsen van de Female wire-to-wire connectoren en weerstanden (optioneel) voor de POT-aansluiting. De draden en weerstanden worden aan het circuit toegevoegd met hun coördinaten gelabeld in de diagrammen. (A) Plaats de rode draad, gevolgd door de R2-weerstand (560Ω) (alleen voor het laagspanningscircuit). (B) Steek het andere uiteinde van de weerstand in het aangegeven grondgat. (C) Steek de zwarte draden in de gemarkeerde gaten om verbinding te maken met aarde. Opmerking: R2 (560Ω) is evenwijdig aan de potentiometer.

Aanvullende figuur 37: Het plaatsen van mannelijke draad-naar-draad connectoren voor de microcontrolleraansluiting en voeding. De draden worden toegevoegd aan het circuit met hun coördinaten gelabeld in de diagrammen. (A) Steek de rode draden in de aangegeven gaten. (B) Steek de zwarte draden in de gemarkeerde gaten.

Aanvullende figuur 38: Led-connectoren van draad tot draad toevoegen. (A) Vrouwelijke draad-naar-draad connectoren met de rode loodcoördinaten gemarkeerd. (B) Vrouwelijke draad-naar-draadconnector met de zwarte loodcoördinaten gemarkeerd.

Aanvullende figuur 39: Het opzetten van een PhyB-PIF3 genschakelaarexperiment. (A) Een voorbeeldtabel van een basismengsel met Renilla voor de interne controle. (B) Een voorbeeldtabel voor het opzetten van het DNA-mengsel voor een Dual-Luciferase Reporter Assay van een PhyB-PIF3 optogenetisch experiment. (C) Een voorbeeldtabel voor het instellen van PEI-transfectiereagens en het aliquoteren van het mengsel op cellen (druppelsgewijs). (D) Plaatsing van de lichtmeter voor het instellen van de LED-helderheid.

Discussie

Het hier beschreven LED-systeem is in ons lab gebruikt om verschillende optogenetische hulpmiddelen te optimaliseren, te karakteriseren en ermee te werken. In Kyriakakis et ^al.4 hebben we veel combinaties van PhyB-PIF-genschakelaars parallel getest. Vervolgens gebruikten we dit systeem om lichtpulsen op verschillende frequenties te testen om de kinetiek van de genschakelaar en de effectieve lichtintensiteit te meten. Dit systeem werd ook gebruikt om twee optogenetische systemen te optimaliseren en te karakteriseren die blauw licht gebruiken voor stimulatie ^5,6. Omdat slechts één LED helder genoeg hoefde te zijn om de meeste optogenetische hulpmiddelen te activeren, is het niet altijd nodig om een systeem met grote aantallen LED's over elke put te kopen. Deze opstelling is goedkoop, betrouwbaar, eenvoudig opnieuw te configureren en vereist geen voorafgaande elektrische expertise om het montageprotocol te volgen.

In de aanvullende aanvullende figuren 31-38 beschrijven we hoe u maximaal vier LED's in het systeem kunt opnemen. Hoewel dit sommige experimenten kan beperken die een groot aantal parallelle omstandigheden vereisen, kunnen meer LED's worden toegevoegd door de 9 Volt-voeding die in dit protocol wordt gebruikt, te vervangen door een hoger wattage. Op dezelfde manier kunnen verschillende LED's met een lager vermogen parallel aan elk circuit worden aangesloten. In deze laatste opstelling zullen sommige LED's niet individueel worden aangestuurd, maar dit kan handig zijn wanneer er veel LED's nodig zijn om een groter gebied te bestrijken. Eenmaal bekend met de elektronica van dit systeem, zijn er veel manieren om het aan te passen. Aanvullende strategieën voor het aanpassen van het systeem omvatten het plaatsen van de LED verder of dichter bij het monster en het verlichten door filters / diffusers voor homogene verlichtingsomstandigheden of om verwarming te voorkomen zoals in (aanvullende figuur 23) en Allen et ^al.5. Een ander opvallend kenmerk van ons LED-ontwerp is dat het is ingekapseld in epoxy en een aanraaksluiting aan de achterkant heeft; hierdoor kan de LED vrijwel overal veilig en gemakkelijk worden geplaatst: in incubators, vistanks, dierenkooien, muren, enz.

Veel experimenten die optogenetica gebruiken om genen, signaalroutes en andere cellulaire activiteit te regelen, vereisen vaak pulseren, overspannen grote tijdschalen of moeten worden uitgevoerd in een incubator, waardoor automatisering of manipulatie op afstand zonder microscoop vereist is. Dit LED-systeem is gedurende enkele maanden continu getest in een bevochtigde CO_2-incubator zonder problemen. Bovendien, met omkeerbare systemen zoals PhyB optogenetische systemen, moet de experimentator mogelijk specifieke pulserende verlichtingsschema's programmeren. In ons vorige werk⁴ gebruikten we pulserende programma's om de reversibiliteitsdynamiek van een PhyB-PIF3-schakelaar in zoogdiercellen te testen via de gebruikersinterface. Met behulp van de methodologie die in dit manuscript wordt beschreven, is het programmeren van een pulserend protocol eenvoudig en biedt het de flexibiliteit en autonomie die nodig is voor vele soorten optogenetische experimenten op een gebruiksvriendelijke manier.

De meest kritieke stappen bij het bouwen van dit systeem zijn het samenstellen van het elektrische circuit op de printplaat en het aansluiten van de componenten, die worden beschreven in sectie 1 en sectie 2. Het is essentieel om elke stap in deze secties zorgvuldig te volgen en de pinhole-nummers regel voor regel te controleren voordat u elk onderdeel soldeert. In hoofdstuk 2 wordt uitgelegd hoe u de componenten instelt die op het circuit worden aangesloten. Om ervoor te zorgen dat de componenten in de juiste richting aansluiten, is het vooral belangrijk om ervoor te zorgen dat de kleuren van de zwarte en rode draden op de draad-naar-draad connectoren overeenkomen. Kleine vergissingen in deze twee secties zullen zeer waarschijnlijk van invloed zijn op de functionaliteit van het systeem. Inderdaad, de eerste stap bij het oplossen van problemen met deze methode is om te controleren of het circuit correct is gebouwd en of alle verbindingen aanwezig zijn. Ten tweede is het van bijzonder belang om de soldeerkwaliteit te controleren op losse verbindingen en de draden op affakkelende draden die het circuit kortsluiten. Een derde stap zou zijn om ervoor te zorgen dat de LED's correct werken, wat kan worden gedaan met behulp van een voeding of een 1,5 V-batterij door de twee aansluitingen van de LED met alligatorclips te knippen. Een andere potentieel kritische overweging is om verwarming te voorkomen (bij gebruik van de LED's op hoog vermogen) of het verspreiden van het licht voor een bredere spreadverlichting. Om deze overwegingen aan te pakken, kunnen de LED's buiten een zwarte doos worden gemonteerd met "privacyfilm" aan de binnenkant, zoals beschreven in aanvullende figuur 23 en Allen et ^al.5. Vanwege de eenvoud van dit systeem is het niet moeilijk om het uit elkaar te halen om modulaire componenten te verifiëren, aan te passen, te upgraden of te repareren.

Een andere kritische factor voor induceerbare gensystemen is om te overwegen hoeveel activering vereist is of hoeveel lekkage acceptabel is voor het biologische systeem dat wordt gecontroleerd. Zoals te zien is in figuur 6, kunnen deze variëren met de hoeveelheid reporter-DNA. Bovendien zal de transfectie-efficiëntie en dus het aantal reporterconstructies in elke cel variëren. Het kan voor sommige experimenten voordelig zijn om een cellijn te maken met een vaste hoeveelheid reporter- of PhyB-genschakelaarcomponenten en te screenen op klonen met het gewenste bereik van geïnduceerde expressie, zoals vaak wordt gedaan met induceerbare systemen voor geneesmiddelen. Vanwege de grootte en instabiliteit van lentivirale plasmide pPK-230⁴, maakten we ook niet-lentivirale plasmideversies van de PhyB-schakelaar in de pcDNA-backbone pPK-351 (Addgene #157921) en pPK-352 (Addgene #157922).

Door dit LED-verlichtingssysteem volgens dit protocol te bouwen, beschikken gebruikers over alle componenten die nodig zijn om een breed scala aan optogenetische experimenten in vitro en in vivo uit te voeren. In combinatie met de instructies voor het gebruik van PhyB-PIF3 in zoogdiercellen, zal dit protocol niet-ingenieurs en biologen in staat stellen om, flexibel en effectief, op PhyB gebaseerde optogenetica in verschillende contexten te gebruiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
18AWG 2pin RED Black wire	Amazon	15M-28AWG-2468	Goedkope draad om LED's op het stroomcircuit aan te sluiten. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
1K Ohm potentiometer	Amazon	52161500	2 x 1K Ohm potentiometer potentieel + 2 x zwarte draaiknop. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
20 Gauge Silicone JST Connector	Amazon	SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors	Deze zijn heel gebruikelijk en er zijn veel equivalenten. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solid jumper wires	Amazon	WJW-60B-R	Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 ohm 1/2watt 1% tolerantie	Amazon	a14051600ux0301	Uxcell a14051600ux0301 60 stuks Axial Lead 1% tolerantie Gekleurde Ring Metalen Film Weerstand Weerstand, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerantie	Amazon	TTL-A-8035-50Ea	Set van 50Ea Metalen Film Weerstand 820 Ohm 1% 1/2W (0,5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
A Male naar B Male kabel (10 voet)	Amazon	Part# 30-001-10B	De kabel die bij de Arduino wordt geleverd, past niet goed in de doos. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino UNO equivalent	Amazon	Elegoo EL-CB-001	UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 met USB-kabel voor Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino houder	Digikey	X000018	Past erg goed. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Zwarte dozen voor circuits en lichtkamers	Amazon	1591ESBK	Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Blauwe LED	Digikey	LXML-PB01-0040	LED LUXEON REBEL BLAUW SMD. Gebruikte "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Kabelbinders	Amazon	sd027	Tarvol Nylon Zip Ties (Verpakking van 100) 8 Inch met zelfsluitende kabelbinders (Wit). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Command koelkastklemmen	Amazon	17210CLR	Klemmen voor het vasthouden van de printplaat in de zwarte doos. Command strips kunnen ook worden gebruikt. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyaan LED	Digikey	LXML-PE01-0070	LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Gebruikte "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
Elektrisch plakband - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack	Amazon	03429NA	Scotch 700 Elektrisch Plakband, 03429NA, 3/4 inch x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Farred LED 720nm	Luxeon Star LEDs	LXML-PF0