Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Alternatieve onderdompeling in glucose om langdurige hyperglykemie bij zebravissen te produceren

5.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61935

⸱

5 mei 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol induceert niet-invasief hyperglykemie bij zebravissen gedurende maximaal 8 weken. Met behulp van dit protocol kan een diepgaand onderzoek worden gedaan naar de nadelige effecten van hyperglykemie.

Samenvatting

Zebravis (Danio rerio) is een uitstekend model om de effecten van chronische hyperglykemie te onderzoeken, een kenmerk van Type II Diabetes Mellitus (T2DM). Dit alternatieve onderdompelingsprotocol is een niet-invasieve, stapsgewijze methode om hyperglykemie gedurende maximaal acht weken op te wekken. Volwassen zebravissen worden afwisselend blootgesteld aan suiker (glucose) en water gedurende elk 24 uur. De zebravis begint de behandeling in een 1% glucoseoplossing gedurende 2 weken, vervolgens een 2% oplossing gedurende 2 weken en ten slotte een 3% oplossing voor de resterende 4 weken. In vergelijking met met water behandelde (stress) en met mannitol behandelde (osmotische) controles, hebben met glucose behandelde zebravissen een aanzienlijk hogere bloedsuikerspiegel. De met glucose behandelde zebravissen vertonen bloedsuikerspiegels van 3 keer die van controles, wat suggereert dat na zowel vier als acht weken hyperglykemie kan worden bereikt. Aanhoudende hyperglykemie werd geassocieerd met verhoogde Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) en verhoogde nucleaire factor Kappa B (NF-kB) niveaus in retina en verminderde fysiologische reacties, evenals cognitieve tekorten suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt om ziektecomplicaties te modelleren.

Inleiding

Zebravissen (Danio rerio) worden snel een veel gebruikt diermodel om zowel ziekte als cognitie te bestuderen1. Het gemak van genetische manipulatie en embryonale transparantie door de vroege ontwikkelingsfasen, maken ze een uitstekende kandidaat om menselijke ziekten met een bekende genetische basis te bestuderen. Zebravissen zijn bijvoorbeeld gebruikt om holt-oramsyndroom, cardiomyopathieën, glomerulocystische nierziekte, spierdystrofie en diabetes mellitus (DM) te bestuderen onder andere ziekten1. Bovendien is het zebravismodel ideaal vanwege het kleine formaat, het onderhoudsgemak en de hoge vruchtbaarheid van de soort2,3.

De zebravisalvleesklier is zowel anatomisch als functioneel vergelijkbaar met de alvleesklier van zoogdieren4. Zo maken de unieke kenmerken van grootte, hoge vruchtbaarheid en vergelijkbare endocriene structuren zebravissen een geschikte kandidaat voor het bestuderen van DM-gerelateerde complicaties. Bij zebravissen zijn er twee experimentele methoden die worden gebruikt om de langdurige hyperglykemie te induceren die kenmerkend is voor DM: een instroom van glucose (modellering type 2) en stopzetting van de insulinesecretie (modellering type 1)5,6. Experimenteel, om insulinesecretie te stoppen, kunnen pancreas β-cellen chemisch worden vernietigd met behulp van Streptozotocine (STZ) of Alloxan-injecties. STZ is met succes gebruikt bij knaagdieren en zebravissen, wat resulteert in complicaties geassocieerd met retinopathie7,8,9, cognitievestoornissen 10en ledemaatregeneratie11. Bij zebravissen regenereren β-cellen echter na de behandeling, waardoor "boosterinjecties" van STZ nodig zijn om diabetische aandoeningen te behouden12. Als alternatief kan de alvleesklier van de zebravis worden verwijderd6. Dit zijn beide zeer invasieve procedures, vanwege de meerdere injecties en uitgebreide hersteltijd.

Omgekeerd kan hyperglykemie niet-invasief worden geïnduceerd door blootstelling aan exogene glucose. In dit protocol worden vissen gedurende 24 uur5,13 of continu gedurende 2 weken 14,15,16ondergedompeld in een sterk geconcentreerde glucoseoplossing . Exogene glucose wordt transderderaal opgenomen, door inname en/of over de kieuwen, wat resulteert in verhoogde bloedsuikerspiegels. Aangezien deze niet-invasieve techniek de insulinespiegels niet direct manipuleert, kan zij niet beweren type 2 DM te induceren. Het kan echter worden gebruikt om complicaties te onderzoeken die worden veroorzaakt door hyperglykemie, een van de belangrijkste symptomen van Type 2 DM.

Onlangs werd de zebravis mutant pdx1-/- ontwikkeld door het manipuleren van het pancreas en duodenale homeobox 1 gen, een gen dat gekoppeld is aan de genetische oorzaak van Type 2 DM bij mensen. Met behulp van deze mutant zijn onderzoekers in staat geweest om verstoring van de alvleesklierontwikkeling, hoge bloedsuikerspiegel te repliceren en hyperglykemie-geïnduceerde diabetische retinopathie17,18tebestuderen .

In dit artikel beschrijven we een niet-invasieve hyperglykemie inductiemethode die een afwisselend onderdompelingsprotocol gebruikt. Dit protocol handhaaft hyperglycemische aandoeningen gedurende maximaal 8 weken met daaropvolgende complicaties waargenomen. Kortom, volwassen zebravissen worden gedurende 24 uur in een suikeroplossing geplaatst en vervolgens gedurende 24 uur in een wateroplossing. In tegenstelling tot continue onderdompeling in externe glucoseoplossingen, bootsen afwisselende dagen tussen suiker en water de stijging en daling van de bloedsuikerspiegel bij diabetes na. Een afwisselend glucoseprotocol maakt het bovendien mogelijk om hyperglykemie voor langere tijd te veroorzaken, omdat de zebravissen niet zo goed in staat zijn om de hoge externe glucoseomstandigheden te compenseren. Als bewijs van principe leveren we gegevens waaruit blijkt dat hyperglykemie veroorzaakt met behulp van dit protocol de retinale chemie en fysiologie verandert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de American University.

1. Het voorbereiden van de oplossingstanks

  1. Verkrijg zes tanks, twee voor elke experimentele groep (glucose, mannitol en water). Label een van de twee tanks 'behuizing tank' (het zal de vis huisvesten) en label de andere 'oplossing tank' (het zal de oplossing bevatten).
    OPMERKING: De mannitolbehandelingsgroep is de osmotische controle en de waterzuiveringsgroep is een behandelings-/stresscontrole. Het is belangrijk om de tanks, luchtvaartmaatschappijen/luchtstenen, deksels en reinigingsbenodigdheden gescheiden te houden voor elke behandelingsgroep
  2. Gebruik een tank van 2 L als het totale aantal gebruikte vis minder dan 20 is. Gebruik een tank van 4 L als het totale aantal gebruikte vis meer dan 20 is.
    OPMERKING: Gebruik een N van 5-10 per behandelingsgroep per bemonsteringstijdpunt.
  3. Houd de tanks in een waterbad bij 28-29 °C om de watertemperatuur te handhaven.
  4. Plaats de vissen op dag 1 gedurende 24 uur in hun respectieve behandelingsoplossingen (glucose, mannitol, water) ('Water to Treatment'). Breng de vis op dag 2 gedurende 24 uur over van hun behandelingsoplossingen naar water ('Behandeling naar water'). Breng de vis op dag 3 over van water naar behandelingsoplossingen ('Water naar behandeling'). Deze afwisselende blootstelling gaat de rest van het experiment door (figuur 1). Breng dagelijks met water behandelde controlevissen van water naar water.
  5. Zorg ervoor dat de vissen gedurende de duur van het experiment elke dag binnen hetzelfde venster van 2 uur worden gevoerd en overgebracht.

2. De vis bereiden

  1. Gebruik volwassen zebravissen (4 maanden – 1 jaar)5.
  2. Voer de vis gemalen Tetramin vlokken dagelijks bij aankomst in het lab.
  3. Noteer de pH en de temperatuur van alle tanks en noteer de algemene toestand van de vis.

3. Overbrengen van vis

  1. Breng vis in elke behandelingsgroep over van de behuizingstank naar de overeenkomstige oplossingstank met behulp van een standaard visnet.
  2. Plaats de tank met de vis terug in het waterbad, vervang de luchtsteen en het deksel van de tank. Deze tank is nu de 'behuizingstank' en de tank die de vis voorheen vasthield is nu de 'oplossingstank'.
  3. Gooi de oude oplossing weg en reinig de tank, samen met de tankdeksels, luchtvaartmaatschappijen, luchtstenen en netten om ophoping van glucose en mannitol te voorkomen.
    OPMERKING: Was geen artikelen met zeep. Gebruik water en een speciale schrobborstel/spons voor elke behandelingsconditie om de tanks goed te reinigen.
  4. Droog de nieuw gereinigde 'oplossingstanks' af met een papieren handdoek. Bereid de oplossingen voor de volgende dag voor met behulp van deze tank. Zorg ervoor dat de andere items worden gedroogd en gescheiden door geschikte behandelingsgroepen.
    OPMERKING: Houd bij welke oplossingen de vissen elke dag worden overgedragen, evenals de oplossingen die zijn voorbereid op de volgende dag. Bijvoorbeeld: Vis overgedragen van glucose naar H2O, nieuwe 1% glucoseoplossing voorbereid voor morgen.

4. Voorbereiding van de oplossing na overdracht

  1. Suikeroplossingen bereiden
    1. Vul elke oplossingstank met 2 L (of 4 L) systeemwater (systeemwater wordt gedefinieerd als water dat is behandeld met de juiste verhouding zoutoplossing en op dezelfde temperatuur is als voorraad- en behandelingstanks).
    2. Meet de juiste hoeveelheid glucose en mannitol (zie stap 5 hieronder) met behulp van een bovenste laadweegschaal en afzonderlijke weegboten voor elke chemische stof.
    3. Voeg de gewogen glucose- of mannitol aliquot toe aan de juiste, gereinigde oplossingstank, die alleen systeemwater bevat.
    4. Roer de glucose- en mannitoloplossingen met aparte glazen roerstaafjes tot de suikers volledig zijn opgelost.
    5. Breng oplossingstanks terug naar het waterbad en dek af met de bijbehorende deksels.
  2. Wateroplossingen voorbereiden
    1. Vul experimentele tanks (2 L of 4 L) met systeemwater.
    2. Breng deze 'oplossingstanks' terug naar het waterbad en dek af met de bijbehorende deksels.

5. Percentages wijzigen

  1. Houd de vis in een 1% oplossing tijdens de eerste 2 weken van de behandeling: 40 g glucose of mannitol in een 4 L-tank.
  2. Houd de vis in een 2% oplossing tijdens week 3 en 4 van de behandeling: 80 g glucose of mannitol in een 4 L tank.
  3. Houd de vis in een 3% oplossing voor de laatste 4 weken van de behandeling: 120 g glucose of mannitol in een tank van 4 L.

6. Bloedglucosewaarden meten en weefsel verzamelen

  1. Verdoof vis 2 tegelijk in een 0,02% Tricaine-oplossing.
  2. Onthoofd de vis direct achter de kieuwen met behulp van een scheermesje.
  3. Meet de bloedsuikerwaarde.
    OPMERKING: We gebruiken een bloedglucosemeter (bijv. Freestyle Lite) om de bloedglucose te meten en de teststrip direct op het blootgestelde hart te plaatsen (hartbloedmonster).
  4. Ontleed het gewenste weefsel van de vis (hersenen, spieren, enz.).
  5. Bewaar verzameld weefsel door invriezen op droog ijs en op te slaan in een vriezer van -80 °C, te bevestigen in 4% paraformaldehyde of in een bufferoplossing te plaatsen voor onmiddellijk gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol (figuur 1) worden de bloedsuikerwaarden significant verhoogd na zowel 4 weken als 8 weken behandeling (figuur 2A), waarbij hyperglykemie wordt gedefinieerd als 3x de controlegemiddelden van zowel met water behandelde als met mannitol behandelde groepen. Waterbehandelde controles worden dagelijks in en uit het water overgebracht, wat zorgt voor een spannings-/hanteringscontrole. Mannitol dient als een osmotische controle in in vitro gl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Diabetes is een landelijk probleem. Studies tonen aan dat tegen 2030 naar schatting 400 miljoen mensen een vorm van diabetes zullen hebben. In knaagdiermodellen wordt Type 2 DM bestudeerd met behulp van genetische manipulatie. Bij ratten geven de Zucker diabetische vetratten (ZDF) en de Otsuka Long-Evans Tokushima-vetratten (OLETF) meer informatie over de effecten van type 2 DM10. Bovendien zijn vetrijke diëten gebruikt bij knaagdieren om hyperglykemie te induceren. Dit weerspiegelt de niet-invasi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We willen graag VPC, CJR en MCP erkennen voor de ontwikkeling van dit protocol. EMM kreeg financiële steun van het American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support om dit onderzoek uit te voeren. Dit werk werd ook ondersteund door een American University Faculty Mellon Award en financiering via het American University College of Arts and Sciences (beide aan VPC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Airline Tubingpetsmart5291863Dit kan worden gebruikt in de tank om lucht te circuleren
Airpumppetsmart5094984Dit kan worden gebruikt in de tank om lucht te circuleren
Airstonespetsmart5149683Dit kan worden gebruikt in de tank om lucht te circuleren
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

Referenties

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232(2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , iConcept Press Ltd. Hong Kong. (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43(2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hyperglykemie bij zebravissenglucose-immersiealternatieve blootstellingbloedsuikermetingretina-analyseGFAP-expressieNF-kB-activatieERG-registratiescognitieve beoordelingdiabetesmodel
Alternatieve onderdompeling in glucose om langdurige hyperglykemie bij zebravissen te produceren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.