3D-celgeprinte hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van pathologische progressie van solide kanker

Samenvatting

Hypoxie is een kenmerk van tumormicromilieu en speelt een cruciale rol bij de progressie van kanker. Dit artikel beschrijft het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie om een hypoxiegerelateerde pathologie van kanker samen te vatten.

Samenvatting

Micromilieu van kanker heeft een aanzienlijke invloed op de progressie van de ziekte. In het bijzonder is hypoxie de belangrijkste oorzaak van overleving, invasie en chemoresistentie van kanker. Hoewel verschillende in vitro modellen zijn ontwikkeld om hypoxiegerelateerde kankerpathologie te bestuderen, is het complexe samenspel van de in vivo waargenomen micromilieu voor kanker nog niet gereproduceerd vanwege het gebrek aan nauwkeurige ruimtelijke controle. In plaats daarvan zijn 3D-biofabrication-benaderingen voorgesteld om microfysiologische systemen te creëren voor een betere emulatie van kankerecologie en nauwkeurige evaluatie van de behandeling van kanker. Hierin stellen we een 3D-celprintbenadering voor om een hypoxische kanker-op-een-chip te fabriceren. De hypoxie-inducerende componenten in de chip werden bepaald op basis van een computersimulatie van de zuurstofverdeling. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van bioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om een type solide kanker samen te vatten. De resulterende chip realiseerde centrale hypoxie en verergerde maligniteit bij kanker met de vorming van representatieve pathofysiologische markers. Over het geheel genomen zal de voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide kanker-mimetisch microfysiologisch systeem naar verwachting de kloof overbruggen tussen in vivo en in vitro modellen voor kankeronderzoek.

Inleiding

De micromilieu van kanker is een kritische factor die de progressie van kanker aansturen. Meerdere componenten, waaronder biochemische, biofysische en cellulaire signalen, bepalen de pathologische kenmerken van kanker. Onder deze, hypoxie is sterk geassocieerd met kanker overleving, proliferatie, en invasie¹. Door de onbeperkte groei en deling van kankercellen raken voedingsstoffen en zuurstof continu uitgeput en ontstaat er een hypoxische gradiënt. Onder zuurstofarme omstandigheden activeren cellen hypoxie-induceerbare transcriptiefactor (HIF)-geassocieerde moleculaire cascade. Dit proces induceert een necrotische kern, activeert metabolische veranderingen en initieert hyperplasie en metastase van bloedvaten^2,3. Vervolgens veroorzaakt hypoxie in kankercellen de vernietiging van naburige normale weefsels. Bovendien wordt hypoxie sterk geassocieerd met de therapeutische weerstand van solide tumoren op multifactoriële manieren. Hypoxie kan radiotherapie ernstig belemmeren, aangezien de radiogevoeligheid beperkt is als gevolg van reactieve zuurstofsoorten^1,4. Bovendien verlaagt het de pH-niveaus van micromilieus voor kanker, wat de accumulatie van geneesmiddelen vermindert¹. Daarom is het reproduceren van pathologische kenmerken met betrekking tot hypoxie in vitro een veelbelovende strategie voor wetenschappelijke en preklinische bevindingen.

Het modelleren van een specifiek micromilieu van kanker is essentieel voor het begrijpen van de ontwikkeling van kanker en het verkennen van geschikte behandelingen. Hoewel diermodellen veel zijn gebruikt vanwege hun sterke fysiologische relevantie, bestaan er problemen met betrekking tot soortenverschillen en ethische problemen⁵. Hoewel conventionele 2D- en 3D-modellen de manipulatie en real-time beeldvorming van kankercellen mogelijk maken voor een diepgaande analyse, kan hun architecturale en cellulaire complexiteit niet volledig worden samengevat. Kankersferoïdemodellen zijn bijvoorbeeld veel gebruikt, omdat kankercelaggregatie in een sferoïde van nature hypoxie in de kern kan genereren. Bovendien zijn grote aantallen cellulaire sferoïden van uniforme grootte geproduceerd met behulp van op plastic of siliconen gebaseerde multiputsystemen^6,7. De lagere flexibiliteit met betrekking tot het vastleggen van de exacte heterogene structuur van kankerweefsels met conventionele platforms heeft echter de oprichting van een geavanceerde biofabrication-technologie vereist om een zeer biomimetisch platform te bouwen om kankeronderzoek te verbeteren⁸.

3D-microfysiologische systemen (MPS's) zijn nuttige hulpmiddelen om de complexe geometrie en pathologische progressie van kankercellen samen te^{vatten 9}. Aangezien kankercellen de biochemische gradiënt van groeifactoren en chemokinen en de mechanische heterogeniteit die op het systeem wordt gereproduceerd, voelen, kunnen belangrijke kenmerken van kankerontwikkeling in vitro worden onderzocht. Bijvoorbeeld, kanker levensvatbaarheid, gemetastaseerde maligniteit, en resistentie tegen geneesmiddelen afhankelijk van de variërende zuurstofconcentraties is bestudeerd met behulp van MPSs^10,11. Ondanks recente vooruitgang is het genereren van hypoxische omstandigheden van in vitro modellen afhankelijk van complexe fabricageprocedures, waaronder aansluiting op fysieke gaspompen. Daarom zijn eenvoudige en flexibele methoden nodig om kankerspecifieke micromilieus op te bouwen.

3D-celdruktechnologie heeft veel aandacht gekregen vanwege de nauwkeurige controle van de ruimtelijke ordening van biomaterialen om inheemse biologische architecturen samen te^{vatten 12}. Deze technologie overwint met name de bestaande beperkingen van 3D-hypoxiemodellen vanwege de hoge beheersbaarheid en haalbaarheid voor het bouwen van de ruimtelijke kenmerken van het kankermicromilieu. 3D-printen vergemakkelijkt ook computerondersteunde productie door middel van een laag-voor-laag proces, waardoor een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare constructie van complexe geometrieën wordt geboden om echte weefselarchitecturen na te bootsen. Naast de voordelen van bestaande productiestrategieën voor 3D-MPS 's, kunnen de pathofysiologische kenmerken van kankerprogressie worden gereproduceerd door de biochemische, cellulaire en biofysische componenten^13,14te patroonen .

Hierin presenteren we een 3D-celprintstrategie voor een hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van de heterogeniteit van een solide kanker (Figuur 1)¹⁵. De fabricageparameters werden bepaald via een computationele simulatie van centrale hypoxievorming in het systeem. Kanker-stroma concentrische ringen werden afgedrukt met behulp van collageenbioinks die glioblastoomcellen en endotheelcellen bevatten om de pathofysiologie van glioblastoom, een type vaste kanker, na te bootsen. De vorming van een radiale zuurstofgradiënt verergerde de maligniteit van kanker, wat wijst op versterkte agressiviteit. Verder geven we toekomstperspectieven aan voor de toepassingen van de chip op patiëntspecifieke preklinische modellen. De voorgestelde aanpak voor het creëren van een solide-kanker-mimetisch microfysiologisch systeem zal naar verwachting de kloof tussen in vivo en in vitro modellen van kanker overbruggen.

Protocol

1. Computersimulatie van zuurstofgradiëntvorming

1. Generatie van een 3D geometrie model voor hypoxische kanker-op-een-chip printen
   1. Voer een 3D CAD-software uit.
   2. Schets het geometriemodel van hypoxische kanker-op-een-chip. Klik op Schets en selecteer het gewenste vlak om de geometrie te tekenen. Raadpleeg de tekening (figuur 2A) voor de detailschaal van elk onderdeel.
   3. Stel de dikte van de geometrie in door te klikken op Feature-Protrusion Boss/Base. Voer de gewenste dikte (zie figuur 2A) in het lege vak in en selecteer het groene controlepictogram om de 3D-geometrie te vormen.
      OPMERKING: De dimensie van de cancer-on-a-chip wordt gedefinieerd op basis van de gewenste hoeveelheden media en hydrogel. In dit experiment waren de gewenste volumes media en hydrogel respectievelijk ongeveer 1.500 μL en 500 μL, gebaseerd op de eerdere praktijkervaringen voor de oplossing van bioprinter op basis van extrusie.
   4. Sla het geometriebestand op als een 3D CAD-bestandsindeling (.prt of .stl).
2. Bepaling van de cellulaire dichtheid voor inductie van hypoxische kern
   1. Voer een simulatieprogramma voor fysieke diffusie uit.
   2. Klik op LiveLink en selecteer het gebruikte CAD-programma. Klik op Synchroniseren om de geometrie van de hypoxische kanker-op-een-chip in het simulatieprogramma te importeren. Omdat de binnenruimte van de kamer zal worden gevuld met een kweekmedium in een daadwerkelijke experimentele omgeving, zal zuurstof zich verspreiden over de binnenruimte van de kamer en de cellulaire constructie, die zal bestaan uit met cellen beladen hydrogels.
      OPMERKING: Raadpleeg het vorige onderzoek voor meer informatie over de fysische parameters¹⁵.
   3. Definieer de geïmporteerde 3D-geometrie als een regelvolume van de ruimte waarin zuurstof verspreidt en de cellen zuurstof verbruiken (Figuur 2B).
   4. Voer een computeranalyse uit voor gasdiffusieanalyse volgens een gebruikershandleiding en eerder vastgestelde methoden^16,17.
   5. Exporteer uit de computeranalyseresultaten de geschatte zuurstofconcentratiegegevens over doorsnede A-A' op elk tijdstip volgens de gebruikershandleiding. De bestuursvergelijking is gebaseerd op de eerste wet van Fick, uitgedrukt in Eq. (1) (Figuur 2C).
      
      waarbij c de concentratie is, D de zuurstofdiffusiecoëfficiënt, _N-cel de dichtheid van de cellen, de maximale opnamesnelheid van zuurstof en Km de Michaelis-Menten-constante. De constanten werden toegepast zoals beschreven in een eerdere publicatie¹⁵.
      OPMERKING: Elk keerpunt betekent een stappunt om de zuurstofdiffusie in de loop van de tijd te observeren.
   6. Evalueer of het minimale zuurstofgehalte een drempel van hypoxie bereikt en herhaal het computeranalyseproces met een toename of degradatie van de cellulaire dichtheid.
      OPMERKING: Definieer dat hypoxiegradiënt wordt gevormd in de constructie als het zuurstofgehalte van 80% in het hydrogelgebied na 24 uur minder dan 0,02 mM bedraagt.
   7. Bevestig het aantal cellen dat nodig is om de zuurstofgradiënt te genereren die hypoxie induceert in de centrale regio uit de eerste wet van Fick in stap 1.2.5 en de simulatieresultaten van stap 1.2.6.
      OPMERKING: In dit protocol was het celnummer 2 × 10⁶ cellen/elke constructie.

2. Celkweek van kankercellen en stromale cellen

1. Voorbereiding van celkweekmedia om fysiologische stress te voorkomen
   1. Voor U-87 MG cellen (vereeuwigde menselijke glioblastoom cellijn), plaats 12 ml hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium met 10% foetale runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een T-75 celkweekkolf in een 37 °C, 5% CO₂ bevochtigde incubator gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Glioblastoom werd gekozen als een soort solide kanker omdat het agressieve kenmerken heeft in een hypoxische omgeving. Andere verschillende soorten kankers kunnen op dit model worden toegepast.
   2. Plaats voor menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) 12 ml endotheelcelgroeimedium in een T-75 celkweekkolf in een 5% CO₂ bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: HUVECs zijn gekozen omdat het een van de meest representatieve endotheelcellijnen is. Verschillende soorten stromale cellen kunnen ook op dit model worden toegepast.
2. Snelle ontdooiing van cryopreserved kankercellen en stromale cellen en hun onderhoud
   1. Verplaats cryovials met 5 x 10⁵ U-87 MG cellen en HUVECs van de vloeibare stikstofcontainer naar een laminaire stromingskast. Maak de dop onmiddellijk los en draai deze weer vast om de interne druk los te maken.
   2. Plaats de cryopreserved cellen voorzichtig gedurende 2 minuten in een waterbad op 37 °C, zodat de dop uit het water blijft. Spoel de flacons af met 70% ethanol onder laminaire stroming om besmetting te voorkomen.
   3. Breng de ontdooide cellen over in de kolven die de in stap 2.1 beschreven bereide celkweekmedia bevatten en plaats de celbevattende kolven in een bevochtigde incubator van 5% CO₂ bij 37 °C voor celterugwinning.
   4. Vernieuw de celkweekmedia om de 2 dagen en behoud de celgroei.
   5. Vervang na 24 uur ontdooien de celkweekmedia om cytotoxiciteit van dimethylsulfoxide (DMSO) te voorkomen, die werd gebruikt voor het bevriezen van cellen. Gebruik HUVECs, die minder dan 6 passages hebben ondergaan.

3. Bereiding van collageen pre-gel oplossing

1. Oplosbaarheid van collageenspons met 0,1 N zoutzuur (HCl)
   1. Bereid een oplossing van 0,1 N HCl voor en filtreer deze met een spuitfilter van 0,2 μm.
   2. Bereid voor 3 ml van een geneutraliseerde collageenvoorgeloplossing van 1% (w/v) collageensponsjes in 5 x 5 mm² stukken en met een gewicht van 30 mg.
   3. Breng de gesneden collageenstukken over in een steriele glazen flacon van 10 ml.
      OPMERKING: Bereid 1,5 keer het volume van de vereiste collageenhydrogel voor, gezien het verlies van de hydrogel als gevolg van het kleverige kenmerk van de collageenoplossing.
   4. Voeg 2,4 ml 0,1 N HCl toe aan de collageenhoudende glazen flacon en incubeer deze gedurende 3 dagen op de rocker bij 15 tpm en 4 °C.
      OPMERKING: Het volume van de 0,1 N HCl-oplossing was vier vijfde van het uiteindelijke volume van de vereiste collageenhydrogel. In dit geval werd 3 ml collageen bereid.
   5. Zeef na de spijsvertering de onverteerd collageendeeltjes met behulp van een 40 μm celzeef. Bewaar de zure collageenoplossing bij 4 °C en gebruik binnen 7 dagen.
2. pH-aanpassing voor 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing
   1. Centrifugeer de zure collageenoplossing bij 1224 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
   2. Voeg 30 μL fenolrode oplossing als pH-indicator toe aan een eindconcentratie van 1% (v/v) en 300 μL 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 10% (v/v) in de collageen pre-geloplossing.
   3. Neutraliseer de pH tot 7 met 1 N natriumhydroxide (NaOH) en controleer de kleurverandering.
      OPMERKING: Op basis van de formule voegen moedervlekken H⁺ = molariteit H⁺ x volume H⁺ = moedervlekken OH^-= molariteit OH^- x volume OH^-, 240 μL NaOH toe.
   4. Voeg gedestilleerd water toe om een totaal volume van 3 ml te verkrijgen.
   5. Bewaar na pH-aanpassing de 1% (w/v) geneutraliseerde collageen pre-geloplossing bij 4 °C en gebruik binnen 3 dagen.
      OPMERKING: Om de gelatie van de geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing vooraf te controleren, maakt u 50 μL collageendruppels op een kleine schaal met behulp van een pipet met positieve verplaatsing en incubeert u ze gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Raadpleeg de volgende drie methoden om de kruiskoppeling van collageendruppels te controleren.
   6. Controleer of de kleur van collageen is veranderd in ondoorzichtig wit van transparante kleur.
   7. Kantel de container en controleer of het collageen aan de onderkant van de container is hecht.
   8. Giet 1x PBS op de druppels en controleer of de collageenconstructie niet kapot is in de oplossing.

4.3D afdrukken van gasdoorlatende barrière

1. 3D-printen van een offerpoly (ethyleen-vinylacetaat) (PEVA) mal
   1. Genereer de 3D-geometrie van de offer-PEVA-mal die in stap 1 is gedefinieerd met behulp van een 3D CAD-software (figuur 3A).
      OPMERKING: De 3D-geometrie en de gedetailleerde modelschaal, inclusief afmetingen, eenheden en lijntypen, zijn weergegeven in figuur 2A.
   2. Converteer het 3D CAD-bestand naar een STL-bestandsindeling door op Bestand | te klikken Save-File type als STL. Klik ook op Optie | Uitvoerformulier als ASCII voor het genereren van G-code.
   3. Klik op Bestand | Open het STL-bestand en selecteer het opgeslagen STL-bestand om het gegenereerde STL-bestand te importeren. Klik op Segmentmodel van STL-CAD-wisselaar om automatisch de G-code van de offerende PEVA-mal te genereren (Figuur 3B, C).
      OPMERKING: Het afdrukpad wordt gegenereerd met de verbinding van doorsneden punten tussen de fundamentele figuur van het STL-bestand en het snijvlak (d.w.z. laag). Kortom, de fundamentele figuur van een fragment in een STL-bestand is een driehoek die de 3D-coördinaten bevat. Nadat de doorsneden punten tussen de driehoek en de laag zijn verkregen, wordt een G-code voor afdrukken gegenereerd door elk punt te verbinden zonder een overlappend pad op een laag¹⁸. Elk algoritme voor het genereren van G-code aan boord van software kan worden gebruikt om afdrukpaden voor de chipfabricage te genereren.
   4. Bereid een steriele lijm en hydrofiele histologie dia.
      OPMERKING: Het hydrofiele schuifglas is van cruciaal belang voor de permanente hechting van polydimethylsiloxaan (PDMS) op het glas en de hechting van de collageenconstructies die kankercellen en stromale cellen inkapselen.
   5. Print de offerPEVA mal op de glijbaan met een 50 G precisiemondstuk bij een pneumatische druk van 500 kPa bij 110 °C.
      OPMERKING: De lijnbreedte wordt beïnvloed door de toevoersnelheid, de spuitmondmeter en de temperatuur van het materiaal. Het mondstuk van 50 G werd gebruikt en een toevoersnelheid van 400 werd toegepast om een lijnbreedte van 500 μm voor de offermuur te genereren. De mondstukmeter, pneumatische druk en toevoersnelheid worden gedefinieerd met praktische resultaten¹⁹. De offerwand moet voldoende dik zijn om de PDMS-oplossing vast te houden, wat de volgende fabricagestap is.
2. Gieten van polydimethylsiloxaan (PDMS) barrière
   1. Meng 6 ml PDMS-basis elastomeer en 0,6 ml uithardingsmiddel homogeen gedurende 5 minuten in een plastic reservoir. Dit kan 6 hypoxische kanker-op-chips fabriceren, gezien het verlies als gevolg van het kleverige kenmerk van PDMS.
   2. Plaats de gemengde PDMS-oplossing in een wegwerpspuit van 10 ml en plaats de spuitkop met een 20 G plastic taps toelopende doseertip.
   3. Vul de offer PEVA-mal met de gemengde PDMS-oplossing in de spuit. Het gemengde PDMS vult de offerende PEVA-mal met een bol oppervlak. De hoogte van de PDMS-barrière zal hoger zijn dan die van de PEVA-mal.
   4. Hard de PDMS-barrière meer dan 36 uur uit in een oven op 40 °C om het smelten van PEVA te voorkomen. Verhoog de temperatuur niet tot meer dan 88 °C, de smelttemperatuur van PEVA.
   5. Maak de offerende PEVA-mal los met een precisie-pincet en steriliseer de gasdoorlatende barrière bij 120 °C in een autoclaaf.

5. Bereiding van celgekapte collageenbio-inkten

1. Loslating van de voorbereide kankercellen en stromale cellen
   OPMERKING: Gezien de levensvatbaarheid van de cel moet het hele afdrukproces zo snel mogelijk na het loskoppelen van de cellen worden voltooid.
   1. Was kanker en stromale cellen met 10 ml 1x PBS met behulp van een serologische pipet; behandel met 2 ml trypsine-ethyleenaminetetraazijnzuur (EDTA) met 2 ml met behulp van een pipet en incubeer ze gedurende 3 minuten bij 37 °C.
   2. Neutraliseer de trypsinized cellen met 3 ml celkweekmedia; verzamel de suspensus van cellen in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 516 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
   3. Aspireer de supernatant langzaam; resuspendeer de celkorrels in 5 ml celkweekmedia en tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
   4. Breng 5 x 10⁶ cellen van elk celtype over in nieuwe conische buizen van 15 ml en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 20 °C bij 516 x g.
   5. Aspireer de supernatant eraf en leg hem op nat ijs.
2. Mengen van elk celtype met de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing
   OPMERKING: Om thermische stolling van de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing te voorkomen, moet dit proces worden uitgevoerd op nat ijs.
   1. Resuspendeer elk type celpellet verzameld in stap 5.1.4 met elk 20 μL celkweekmedia.
   2. Voeg 1 ml van de 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing toe aan elk van de geresuspendeerde celsuspensussingen en meng ze homogeen met behulp van een positieve verplaatsing pipet. De uiteindelijke concentratie van elk celtype is 5 x 10⁶ cellen/ml.
   3. Breng de met cellen ingekapselde collageenbioinks over in wegwerpspuiten van 3 ml met behulp van een positieve wegwerppipet en bewaar de spuiten bij 4 °C tot 3D-celprinten.

6.3D celdruk van kanker-stroma concentrische ringen

1. 3D-celprinten van collageenbioinks die kankercellen en stromale cellen inkapselen
   1. Genereer de 3D-geometrie van de kanker-stroma concentrische ringen gedefinieerd in stap 1.2 met behulp van een 3D CAD-software.
      OPMERKING: De afmetingen van de kanker stroma concentrische ringen worden gedefinieerd via gesimuleerde parameters. De afmetingen van de laatste dimensieparameter worden weergegeven in figuur 3A.
   2. Converteer het 3D CAD-bestand naar een STL-bestandsformaat en genereer een G-code van de kanker-stroma concentrische ringen met behulp van een STL-CAD-wisselaar.
      OPMERKING: Raadpleeg de notitie in stap 4.1.2 voor het algoritme voor het genereren van G-code.
   3. Plaats de met cellen ingekapselde collageenbioinks in wegwerpspuiten van 3 ml op de kop van de 3D-printer en stel de temperatuur van het hoofd en de plaat in op 15 °C.
      OPMERKING: Als de temperatuur van de kop en plaat van de printer meer dan 37 °C bereikt, wordt het bioink aan elkaar gekoppeld en wordt het niet meer afgedrukt.
   4. Laad het gegenereerde afdrukpad op de besturingssoftware van de 3D-printer.
   5. Door op de startknop te klikken, drukt u de collageenbioinks af die kankercellen en stromale cellen inkapselen op de gasdoorlatende barrière volgens de geladen G-code met een 18 G plastic naald bij pneumatische druk van ongeveer 20 kPa bij 15 °C.
   6. Plaats aan het einde van elke drukbewerking handmatig een gesteriliseerde glazen afdekking van 22 mm x 50 mm bovenop de gasdoorlatende barrière om de hypoxische gradiënt te genereren.
      OPMERKING: Vergelijk twee groepen, afhankelijk van de aanwezigheid van glasafdekking (GR+) en afwezigheid (GR-) daarvan om de generatie van de hypoxische gradiënt te verifiëren.
   7. Na het genereren van drie hypoxische kanker-op-chips, breng de chips over naar een incubator bij 37 °C gedurende 1 uur om de collageenbioinks met elkaar te verbinden.
2. Voltooiing van het fabricageproces en onderhoud van de hypoxische kanker-op-een-chip
   1. Na voltooiing van alle 3D-celprintprocessen van de hypoxische kanker-op-een-chip, wrijft u de afdekglazen voorzichtig over de gasdoorlatende barrières met de celschraper voor een strakke hechting(figuur 4A,B).
      OPMERKING: Het afdekglas en de gasdoorlatende barrière worden geassembleerd via hydrofobe hechting zonder chemische lijmen, waarbij het verlijmde deel tussen het afdekglas en de PDMS-barrière eenvoudig wordt geschraapt.
   2. Introduceer 1,5 ml endotheelcelgroeimedium in elke chip. Om loslating van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u celkweekmedium aan de ene kant van de chip. Kantel de chip zodat de celkweekmedia kunnen stromen met behulp van een pipet.
   3. Ververs de celkweekmedia een week lang elke dag. Gebruik een pipet om het celkweekmedium te aspireren; gebruik geen drukpomp.

7. Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen na het afdrukken

1. Bereiding van monsters en behandeling met calceïne AM en EthD-1 oplossing
   1. Verwarm 1x PBS in een waterbad bij 37 °C.
   2. Bereid de testoplossing voor door 0,75 μL calceïneacetoxymethyl (calceïne AM) en 3 μL ethidium homodimeer (EthD-1) toe te voegen aan 1,5 ml voorverwarmd PBS.
   3. Aspireer voorzichtig alle media van de chip met behulp van een pipet.
   4. Was de kankerconstructie met voorverwarmde PBS. Vul 1,5 ml PBS in de chip met behulp van een pipet en laat deze 10 minuten staan bij kamertemperatuur. Om vervorming van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u 1x PBS aan één kant van de chips en kantelt u de chips om 1x PBS te laten stromen.
   5. Aspireer de PBS uit de chip; behandel de 1,5 ml testoplossing en incubeer de chip gedurende 20 minuten bij 37 °C met behulp van een folie ter bescherming tegen licht. Gebruik een pipet om 1x PBS te aspireren; gebruik geen zuigpomp.
2. Beeldvorming van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een fluorescentiemicroscoop
   1. Bekijk en leg de gelabelde cellen vast met behulp van een fluorescentiemicroscoop (figuur 4C).
      OPMERKING: Calceïne AM markeert levende cellen met groene fluorescentie (golflengte ~488 nm). EthD-1 vertegenwoordigt het signaal van dode cellen met rode fluorescentie (golflengte ~594 nm).
   2. Tel het aantal levende en dode cellen met behulp van imaging-software, een open-source beeldverwerkingsprogramma, en bereken de levensvatbaarheid met de getallen .

8. Immunofluorescentie om de vorming van centrale hypoxie en het effect ervan op de maligniteit van kanker te valideren

1. Fixatie, permeabilisatie en blokkering van de kankerconstructie
   1. Bereid 1x PBS, 4% paraformaldehyde (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 en 2% (w/v) runderserumalbumine (BSA) bij kamertemperatuur.
   2. Aspireer voorzichtig alle media van de chip met behulp van een pipet en spoel de chip drie keer af met 1x PBS. Om vervorming van de kankerconstructie te voorkomen, introduceert u 1x PBS aan één kant van de chips en kantelt u de chips om 1x PBS te laten stromen. Laat de chip tussen elke wasstap 5 minuten staan met 1x PBS om restoplossingen te verwijderen.
      OPMERKING: 1x PBS werd aangezogen met behulp van een pipet, niet met een drukpomp.
   3. Voeg 500 μL 4% PFA toe aan de kankerconstructie op de chip met behulp van een pipet; laat het 15 minuten staan en was drie keer met 1x PBS om de cellen in de kankerconstructie te fixeren.
   4. Behandel kankerconstructie met 500 μL van 0,1% Triton X-100 met behulp van een pipet op kamertemperatuur gedurende 5 minuten en was driemaal met 1x PBS om het celmembraan te solubiliseren en te permeabiliseren.
   5. Behandel kankerconstructie met 500 μL 2% BSA met behulp van een pipet bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om reactieve epitopen te blokkeren.
      OPMERKING: Bedek de chip met paraffinefilm om verdamping te voorkomen.
   6. Was de chip na 1 uur driemaal met 1x PBS.
2. Behandeling met primair antilichaam, secundair antilichaam en DAPI en beeldvorming van de structuur met behulp van een confocale microscoop.
   1. Bereid isotypecontroleantistoffen en de cocktail van primaire antilichamen voor door de antilichamen in 1x PBS te verdunnen tot elke gewenste werkconcentratie.
      OPMERKING: De specifieke details van de antilichamen zijn opgenomen in de tabel met materialen. Dezelfde werkconcentraties van isotypecontroleantistoffen als de primaire antilichamen moeten worden gebruikt.
   2. Aspireer voorzichtig alle 1x PBS van de chip met behulp van een pipet en behandel de chip 's nachts met 200 μL primaire antilichaamoplossing bij 4 °C. Bedek de chips met paraffinefolie om verdamping te voorkomen.
   3. Aspireer de primaire antilichaamoplossing en was de chip drie keer met 1x PBS.
   4. Verdun secundaire antilichamen en DAPI in 1x PBS tot de gewenste werkconcentratie.
      OPMERKING: In dit geval wordt een groen fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam gebruikt in een verhouding van 1:200. DAPI werd gebruikt in een verhouding van 1:1000.
   5. Aspireer voorzichtig alle 1x PBS van de chip met behulp van een pipet en behandel de chip met 200 μL secundaire antilichaam-DAPI oplossing bij 4 °C gedurende 3 uur. Bedek de chip met paraffinefolie om verdamping te voorkomen en wikkel deze vervolgens in met aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.
   6. Aspireer de secundaire antilichaam-DAPI-oplossing en was de chip driemaal met 1x PBS.
   7. Nadat u de kleuringstap hebt voltooid, breng u de kankerconstructie over in een confocale schaal door voorzichtig vast te pakken met een tang.
   8. Visualiseer en leg de gelabelde cellen vast met behulp van een confocale microscoop (Figuur 5).
      OPMERKING: De golflengte van de confocale microscoop werd aangepast, afhankelijk van het type fluorescerende markers. De specifieke details van de antilichamen zijn opgenomen in de tabel met materialen. Om de celpositie efficiënt te detecteren, is het beter om eerst de DAPI-bevlekte kernen van de constructie te observeren. De detectie-excitatie/emissiegolflengten van de fluorescerende signalen waren 358/461 nm (DAPI, Blauw), 494/517 nm (Groen) en 590/617 nm (Rood). De vergrotingen waren 4x, 10x en 20x, aangepast van de laagste naar de hoogste.

9. Statistische analyse

1. Celtelling met beeldverwerkingsprogramma
   1. Voer een beeldverwerkingsprogramma uit om het aantal levende en dode cellen te tellen.
   2. Open de fluorescerende afbeeldingsbestanden. Klik op Bestand | Open en importeer de TIFF-afbeeldingen.
   3. Converteer de afbeeldingen naar 16-bits grijswaardenafbeeldingen. Klik op Afbeelding | Type | 16-bits grijswaarden.
   4. Pas de drempel aan door op Afbeelding | te klikken | aanpassen Drempel en selecteer vervolgens de kleur van de cellen die zwart moeten zijn.
   5. Knip samengevoegde cellen uit elkaar door te klikken op Proces | Binaire | Waterscheiding voor nauwkeurig celtelling.
   6. Tel het aantal cellen door drie keer op Analyseren en vervolgens op Deeltjes analyseren te klikken; bereken het gemiddelde en presenteer de gegevens als de gemiddelde ± standaardfout.
      OPMERKING: Immunofluorescentiemarkers werden geanalyseerd door de fluorescentie-intensiteit te vergelijken.

Resultaten

De hypoxische kanker-op-een-chip is ontwikkeld met behulp van computerondersteunde 3D-celprinttechnologie om hypoxie en kankergerelateerde pathologie samen te vatten (figuur 1). Zuurstoftransport en -verbruik werden gesimuleerd met behulp van het 3D-geometriemodel. De chip is ontworpen in de vorm van concentrische ringen om de radiale zuurstofdiffusie en uitputting in kankerweefsels na te bootsen (figuur 2A). Na het definiëren va...

Discussie

In deze studie beschrijven we het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie. De vorming van de hypoxische gradiënt in de ontworpen chip werd voorspeld door middel van computersimulaties. De omgeving die een heterogene hypoxische gradiënt kan veroorzaken, werd gereproduceerd via een eenvoudige strategie die de 3D-geprinte gasdoorlatende barrière en de glazen afdekking combineert. De hypoxie-gerelateerde pathologische kenmerken van glioblastoom, waaronder pseudopalisade en ee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cellen
Human umbilical vein endothelial cells	Promocell	C-12200
U-87 MG cells	ATCC	ATCC HTB-14
Voorraden
0.2 μm spuitfilter	Sartorius	16534-K
10 mL wegwerpspuit	Jung Rim	10ml 21G32
10 mL glazen flacon	Hubena	A0039
10 mL serologische pipettip	SPL lifescience	91010
15 mL conische buis	SPL lifescience	50015
18G plastic naald	Musashi engineering	PN-18G-B
20G plastic conische afgiftepunt	Musashi engineering	TPND-20G-U
22x50 glazen dekglas	MARIENFIELD	0101142
25 mL serologische pipettip	SPL lifescience	90125
3 mL wegwerpspuiten	HENKE-JET	4020-X00V0
40 µm celzeef	Falcon	352360
5 mL serologische pipettip	SPL lifescience	91005
50 mL conische buis	SPL lifescience	50050
50 mL serologische pipettip	SPL lifescience	90150
50N precisiemondstuk	Musashi engineering	HN-0.5ND
Aluminiumfolie	SINKWANG
Capillaire punten	Gilson	CP1000
Cell-schraper	SPL lifescience	90030
Confocal schaal	SPL lifescience	200350
Parafilm	Bemis	PM996
Voorgecoate histologieslide	MATSUNAMI	MAS-11
Reservoir	SPL lifescience	23050
T-75 celcultuurkolf	SPL lifescience	70075
Apparatuur
3DX printer	T&R Biofab
Autoclaaf	JEIOTECH	AC-12
Centrifuge	Cyrozen	1580MGR
Confocal lasermicroscopie	Olympus Life Science	FV 1000
Fluorescentiemicroscoop	FISHER SCEINTIFIC	O221S366
Pincet	Korea Ace Scientific	HC.203-30
Handtellingteller	KTRIO
Hemocytometers	MARIENFIELD	0650030
Incubator	Panasonic	MCO-170AIC
Laminare stromingkast	DAECHUNG SCIENCE	CB-BMMS C-001
Metalen spuit	IWASHITA engineering	SUS BARREL 10CC
Operatie-schaar	Hirose	HC.13-122
Oven	JEIOTECH	OF-12, H070023
Positieve verplaatsing pipet	GILSON	NJ05652
Koelkast	SAMSUNG	CRFD-1141
Voltex Mixer	DAIHAN scientific	VM-10
Waterbad	DAIHAN SCIENTIFIC	WB-11
Waterzuiveringsinstallatie	WASSER LAB	DI-GR
Materialen
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
10x PBS	Intron	IBS-BP007a
4% Paraformaldehyd	Biosesang
70% Ethanol	Daejung	4018-4410
Anti-CD31 antilichaam	Abcam	ab28364
Anti-HIF-1 alpha antilichaam	Abcam	ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antilichaam	Abcam	ab88664
Anti-SOX2 antilichaam	Abcam	ab75485
Bovien Serum Albumine	Thermo scientific	J10857-22
Collageen uit varkenshuid	Dalim tissen	PC-001-1g
DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher	D1306
Endotheelcelgroeimedium-2	Promocell	C22011
Fetaal bovien serum	Gibco	12483-020
Geit anti-Muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488	Theromofisher	A-11001
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 594	Theromofisher	A-11012
Hoge-glucose Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium(DMEM)	Hyclone	SH30243-0
Zoutzuur	Sigma-Aldrich	311413-100ML
Live/dead assay kit	Invitrogen	L3224
Muis IgG1, kappa monoklonaal [15-6E10A7] - Isotype Control	Abcam	ab170190
Penicilline/streptomycine	Gibco	15140-122
Fenolrode oplossing	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Poly(ethyleen-vinylacetaat)	Poly science	06108-500
Polydimethylsiloxaan	Dowhitech	sylgard 184
Konijn IgG, polyklonaal - Isotype Control	Abcam	ab37415
Natriumhydroxide oplossing	Samchun	S0610
Triton X-100	Biosesang	TRI020-500-50
Trypan Blauw	Sigma-Aldrich	T8154
Software