Hier beschrijven we een bioassay met behulp van 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) om eerder gesynthetiseerde spirocyclische oximen te testen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gefunctionaliseerde spirocyclische heterocyclussynthese en cytotoxiciteitstest
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Spirocyclische heterocycli zijn onlangs in de literatuur gemeld als potentiële geneesmiddelen voor kankertherapie. De synthese van deze nieuwe orthogonale ringsystemen is een uitdaging. Een efficiënte methodologie om deze verbindingen te synthetiseren werd onlangs gepubliceerd die de vaste fasesynthese in vier stappen beschreef in plaats van de eerder gerapporteerde vijf stappen. Het voordeel van deze kortere synthese is de eliminatie van het gebruik van toxische reagentia. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-gebaseerde hars bleek cruciaal te zijn in de synthese, omdat hoogbelastende versies de toevoeging van reagentia met omvangrijke fenyl- en aromatische zijketens verhinderden. De colorimetrische 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van micromolaire concentraties van deze nieuwe spirocyclische moleculen in vitro te onderzoeken. MTT is direct in de handel verkrijgbaar en produceert relatief snelle, betrouwbare resultaten, waardoor deze test ideaal is voor deze spirocyclische heterocycli. Orthogonale ringstructuren en furfurylamine (een voorloper in de synthesemethode met een vergelijkbaar 5-lids ringmotief) werden getest.
Inleiding
Van kleinmolecuulremming van de interactie van E3 ubiquitine-ligase muis dubbele minuut 2 homoloog (MDM2) met p53 is bekend dat het p53-gemedieerde inductie van tumorcelapoptoseherstelt 1,2,3. MDM2 is een negatieve regulator van de p53-route en wordt vaak overexpressie in kankercellen 4,5,6,7,8,9. Recente kristallografische en biochemische studies hebben aangetoond dat kleine moleculen die een spirocyclisch raamwerk bevatten, MDM2-p53-interacties effectief kunnen remmen10. Het spirocyclische raamwerk (figuur 1, blauw gearceerd) wordt beschouwd als een geprivilegieerd motief omdat derivatisatie van dit rigide orthogonale ringsysteem heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe therapeutische geneesmiddelen. Toegang tot deze interessante architectuur vormt een uitdaging bij het gebruik van traditionele organische synthesetechnieken. Hoewel de therapeutische effecten van spirocyclische moleculen in biologische systemen zijn onderzocht, is de synthese van deze moleculen nog steeds een omslachtig proces. Ongewenste bijproducten, het gebruik van zware omstandigheden en gevaarlijke overgangsmetalen zijn vaak problematisch.
Het potentiële gebruik van het spirocyclische motief bij de ontwikkeling van geneesmiddelen leidde tot de ontwikkeling van een protocol dat gebruik maakt van vaste-fasesynthese om een bibliotheek van moleculen met het motief te genereren naast andere uitwisselbare functionele groepen11,12. De scheiding van producten en reactanten tussen stappen kan worden bereikt door simpelweg gebruik te maken van een REM-linker bevestigd aan een harskraal en een solid-phase filtervat. Dit zou de stappen verminderen en mogelijk de opbrengsten verhogen. Deze synthetische aanpak zou een groot aantal potentiële kandidaat-geneesmiddelen kunnen opleveren. De effectiviteit van deze moleculen in een biologisch systeem zou echter verder onderzoek vereisen.
Om de cytotoxiciteit van deze spirocyclische verbindingen te bepalen, werd de MTT-assay 13,14 gebruikt. Deze methode meet de levensvatbaarheid van cellen en kan worden gebruikt om indirect de cytotoxiciteit van cellen te bepalen. Verschillende concentraties van de remmers werden toegevoegd aan gekweekte cellen in een 96-well plaat, en het aandeel levende cellen werd gemeten door colorimetrische analyse van de mate van reductie van gele MTT door mitochondriale dehydrogenasen tot de paarse formazanverbinding (figuur 2). De activiteit wordt meestal gerapporteerd als een IC50-waarde - de concentratie waarbij de celgroei met 50% wordt geremd ten opzichte van een onbehandelde controle. Dit artikel beschrijft het protocol voor de MTT-test en de voorlopige resultaten van deze nieuwe spirocyclische moleculen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Verschillende chemicaliën en biologische reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Raadpleeg relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Gebruik geschikte persoonlijke beschermende kleding (door de Occupational Safety and Health Administration goedgekeurde veiligheidsbril, goede handschoenen, laboratoriumjassen, broeken over de volledige lengte en schoenen met gesloten teen) voordat u aan het experiment begint. Hanteer bovendien passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van synthese en het hanteren van giftige chemicaliën en reagentia (zuurkast).
1. Vaste fasesynthese van spirocyclische heterocycli 6 en 7
OPMERKING: Synthese was gebaseerd op eerder gepubliceerd werk 11,12. Het bijgewerkte protocol onthult dat de tetrabutylammoniumfluoride-gekatalyseerde ringopening van de tricyclische heterocyclus niet nodig was, en dus verkort de eliminatie ervan de synthetische procedure.
- Voer Michael toevoeging van furfurylamine aan de REM-linker uit (duur: 25 minuten setup + 24 h reactietijd).
- Voeg 1 g (1 equivalenten [equiv.]) REM-hars, 20 ml (20 equiv.) dimethylformamide (DMF) en 2,4 ml furfurylamine toe aan een 25 ml vastefasereactievat. Roer het reactievat bij kamertemperatuur gedurende 24 uur na de start van de reactie.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging, zodat de hars niet op de bodem van het vat zit. - Was de hars met DMF 1x nadat de reactie is voltooid. Was vervolgens 4x, afwisselend dichloormethaan (DCM) en methanol. Droog de hars grondig in het reactievat na het wassen.
- Voeg 1 g (1 equivalenten [equiv.]) REM-hars, 20 ml (20 equiv.) dimethylformamide (DMF) en 2,4 ml furfurylamine toe aan een 25 ml vastefasereactievat. Roer het reactievat bij kamertemperatuur gedurende 24 uur na de start van de reactie.
- Voer tandem Michael additie/1,3-dipolaire cycloadditie uit (duur: 25 min setup + 48 h reactietijd).
- Voeg aan de droge hars 1,48 ml (5 equiv.) triethylamine (THEE), 0,637 g (2 equiv.) nitro-olefine en 10 ml droog tolueen toe aan het reactievat.
- Voeg vervolgens 1,085 ml (4 equiv.) trimethylsilylchloride (TMSCl) toe aan het reactievat in een goed geventileerde zuurkast.
OPMERKING: Aangezien deze reactie HCl-gas produceert, moet u het reactievat niet afdekken totdat het gas onder een zuurkast is vrijgegeven. - Sluit het reactievat stevig af en roer gedurende 48 uur op kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van de hars met de reagentia. - Gebruik 5 ml methanol om de reactie te doven.
- Giet het vat af om de oplossing te verwijderen en was vervolgens 4x, afwisselend DCM en methanol. Droog de hars grondig in het reactievat na het wassen.
- Voer N-alkylering van de harsgebonden heterocyclus uit om het quaternaire amine te vormen (duur: 10 minuten setup + 24 uur reactietijd).
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 5 ml DMF en 10 equiv. alkylhalogenide toe en roer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg voor een grondige menging van de reagentia met de hars. - Was de hars met DMF 1x nadat de reactie is voltooid. Gebruik vervolgens afwisselend DCM en methanol om 4x te wassen. Droog de hars in het reactievat na het wassen.
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 5 ml DMF en 10 equiv. alkylhalogenide toe en roer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
- Voer β-eliminatie van het quaternaire amine uit voor splitsing van de polymeerondersteuning (duur: 15 minuten setup + 24 uur reactietijd).
- Voeg aan de droge hars in het reactievat 3 ml DCM en 1,49 ml (5 equiv.) TEA toe om de heterocyclus van de polymeerondersteuning te splitsen.
- Roer het reactiemengsel gedurende 24 uur om een grondige menging van de hars met de oplossing te garanderen. Was 4x, afwisselend DCM en methanol. Verzamel de elutie van alle wasbeurten en concentreer je via rotatieverdamping.
- Trituraat met methanol om het spirocyclische oxime te zuiveren. Droog de hars grondig in het reactievat na wasbeurten voor hergebruik in toekomstige experimenten.
2. Cytotoxiciteitstest met MTT 14
- Bereid 20 ml van een MTT-oplossing van 5 mg/ml met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl in water) als verdunningsmiddel. Filtreer en bewaar bij -20 °C. Bereid vervolgens een 1:1 verdunning van de MTT-oplossing uit stap 2.1 in serumvrij celkweekmedium (DMEM).
- Bereid 1 ml elk van de stamoplossingen in 1,5 ml microcentrifugebuizen van 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM en 0,01 μM testverbindingen in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaren bij -20 °C. Bereid 200 μL per dosis van de werkoplossingen van teststoffen door de voorraadconcentraties 1:1000 in serumvrij medium in buizen van 1,5 ml te verdunnen.
- In de weefselkweekkap, zaad COS-7 cellen (Afrikaanse groene aap niercellen, Cercopithecus aethiops nier) in volledig medium [DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS)] op platbodem, weefselkweek behandelde 96-well platen in een concentratie van 4 × 103 cellen/200 μL per put met behulp van een meerkanaals pipettor. COS-7-cellen werden gekozen omdat (1) dit veelgebruikte cellen zijn voor cytotoxiciteitstests en (2) deze al beschikbaar waren in de instelling.
- Incubeer COS-7-cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer die 5% CO2 bevat.
- Adem het supernatant uit de putten met behulp van een glazen Pasteur-pipet die aan een vacuümpomp is bevestigd. Doseer de cellen in drievoud met de teststoffen met behulp van de in stap 2.2 bereide werkoplossingen (zie tabel 1). Incubeer cellen zoals beschreven in stap 2.4.
- Haal het supernatant uit de putten. Voeg 200 μL MTT-oplossing toe aan elk putje. Incubeer bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Haal het supernatant voorzichtig uit de putten zonder de paarse formazankristallen te verstoren. Voeg 200 μL DMSO toe aan elk putje om de paarse formazankristallen op te lossen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Meet de absorptie bij 590 nm14 of 600 nm voor elke put met behulp van een 96-well plaatlezer. Gebruik putten zonder cellen als achtergrond en gemiddelde de absorptiewaarde. Trek de gemiddelde absorptieachtergrondwaarde af van de absorptiewaarde van elke behandelde put. Normaliseer de gegevens als een percentage van de gemiddelde nuldoseringswaarde (gemiddeld de drie nuldosiswaarden). Plotgegevens op de y-as: lineair (% relatieve levensvatbaarheid van de cel); x-as: log (concentratie). Plot elke reeks als een individuele curve (bijvoorbeeld drievoudsgegevens moeten 3 curven hebben)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Spirocyclische oximen 6 en 7 werden gesynthetiseerd met behulp van een aangepast protocol (figuur 1). Michael toevoeging van furfurylamine aan een REM linker 1b biedt polymeergebonden hars 2. De voortgang van de reactie werd gevolgd door infrarood (IR) spectroscopie door het detecteren van het verdwijnen van de α,β-onverzadigde ester bij 1722 cm-1 (figuur 3). Spirocyclisch gebonden hars 4 werd gevormd uit 2 via een transiënt tussenproduct 3. Methanoli...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De synthese van de spirocyclische verbindingen was gebaseerd op eerder onderzoek van dit laboratorium, maar met enkele wijzigingen (figuur 1)11,12. De voortgang van elke reactiestap werd gevolgd door IR-spectroscopie. Michael toevoeging van de REM linker 1 met furfurylamine voorzien van polymeer gebonden 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Uit het vori...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Faculty Research Council aan K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. en J.F.M. zijn ontvangers van de Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. en B.M.R. zijn ontvangers van de STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). We zijn Dr. Matthew Berezuk en Dr. Philip Cox dankbaar voor hun begeleiding bij de bioassays.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CELLEN | |||
| COS-7 cellen (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | Afrikaanse groene aapniercellen |
| CHEMICALIËN | |||
| 1-Bromooctaan | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxiciteitscontrole |
| Dichloormethaan (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, hoge glucose, met L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Celcultuurmedia |
| FBS (Fetal bovien serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Celcultuurmedia |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagens |
| Jodomethaan | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagens |
| Fosfaat-gebufferd zout oplossing (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Celcultuurmedia |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymeer ondersteuning; 0.500 mmol/g lading |
| trans-β-nitrostyreen | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagens |
| Tolueen | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagens voor bèta-eliminatie |
| Trimethylsilychloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagens; LET OP - zeer vluchtig; creëert HCl gas |
| GLASWERK/INSTRUMENTEN | |||
| 25 mL solide-fase reactievat | Chemglass | CG-1861-02 | Glaswerk met filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Oplosmiddelen: CDCl3 en CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
Referenties
- Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
- Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
- Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
- Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
- Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
- Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
- Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
- Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
- Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
- Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
- Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
- Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
- MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
