Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61957

⸱

11 december 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Samenvatting

Oxidatieve stress speelt een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een pathologie die wereldwijd ~ 30 miljoen patiënten treft. Het leidt tot een afname van retinale pigmentepitheel (RPE) - gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, bijvoorbeeld pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), gevolgd door het verlies van RPE-cellen, en uiteindelijk fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood. We veronderstellen dat de reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpresseren, het potentieel heeft om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontsteking te remmen en celoverleving te ondersteunen. Met behulp van het Doornroosje transposonsysteem(SB100X)zijn menselijke RPE-cellen getransfecteerd met de PEDF- en GM-CSF-genen en hebben ze stabiele genintegratie, genexpressie op lange termijn en eiwitsecretie aangetoond met behulp van qPCR, western blot, ELISA en immunofluorescentie. Om de functionaliteit en de potentie van de PEDF en GM-CSF uitgescheiden door de getransfecteerde RPE-cellen te bevestigen, hebben we een in vitro assay ontwikkeld om de reductie van H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress op RPE-cellen in cultuur te kwantificeren. Celbescherming werd geëvalueerd door celmorfologie, dichtheid, intracellulair niveau van glutathion, UCP2-genexpressie en levensvatbaarheid van cellen te analyseren. Zowel getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en/of GM-CSF overexpressie geven als cellen die niet-getransfecteerd zijn maar voorbehandeld met PEDF en/of GM-CSF (in de handel verkrijgbaar of gezuiverd uit getransfecteerde cellen) vertoonden een significante antioxidant celbescherming in vergelijking met niet-behandelde controles. Het huidige H2O2-model is een eenvoudige en effectieve benadering om het antioxiderende effect te evalueren van factoren die effectief kunnen zijn om AMD of vergelijkbare neurodegeneratieve ziekten te behandelen.

Inleiding

Het hier beschreven model biedt een nuttige benadering om de efficiëntie van biofarmaceutische middelen te evalueren voor het verminderen van oxidatieve stress in cellen. We hebben het model gebruikt om de beschermende effecten van PEDF en GM-CSF op de H2O2-gemedieerde oxidatieve stress op retinale pigmentepitheelcellen te onderzoeken, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van O2en zichtbaar licht, en de fagocytose van fotoreceptor buitenste segmentmembranen, die aanzienlijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren1, 2. Ze worden beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van avasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (aAMD)3,4,5,6,7,8. Bovendien is er een afname van RPE-gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, met name de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), insuline-achtige groeifactoren (IGF's) en granulocyt macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) die leidt tot de disfunctie en het verlies van RPE-cellen, gevolgd door fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood3,4,5 . AMD is een complexe ziekte die het gevolg is van de interactie tussen metabole, functionele, genetische en omgevingsfactoren4. Het gebrek aan behandelingen voor aAMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij patiënten ouder dan 60 jaar in geïndustrialiseerde landen9,10. De reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van genetisch gemodificeerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpressie geven, heeft het potentieel om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontstekingen te remmen en celoverleving te ondersteunen11,12,13,14,15,16 . Hoewel er verschillende methodologieën zijn om genen aan cellen te leveren, hebben we gekozen voor het niet-virale hyperactieve Doornroosje transposonsysteem om de PEDF- en GM-CSF-genen aan RPE-cellen te leveren vanwege het veiligheidsprofiel, de integratie van de genen in het genoom van de gastheercellen en de neiging om de afgeleverde genen te integreren in niet-transcriptioneel actieve sites zoals we eerder hebben aangetoond17, 18,19.

Cellulaire oxidatieve stress kan worden geïnduceerd in cellen die in vitro zijn gekweekt door verschillende oxidatieve middelen, waaronder waterstofperoxide (H2O2),4-hydroynonenaal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), hoge zuurstofspanningen en zichtbaar licht (volledig spectrum of UV-straling)20,21. Hoge zuurstofspanningen en licht vereisen speciale apparatuur en omstandigheden, die de overdraagbaarheid naar andere systemen beperken. Middelen zoals H 2 O2,HNE en tBH induceren overlappende oxidatieve stress moleculaire en cellulaire veranderingen. We kozen H2O2 om de antioxiderende activiteit van PEDF en GM-CSF te testen omdat het handig en biologisch relevant is omdat het wordt geproduceerd door RPE-cellen als een reactief zuurstoftussenproduct tijdens fotoreceptor buitenste segment fagocytose22 en het wordt gevonden in oculaire weefsels in vivo23. Aangezien de oxidatie van glutathion gedeeltelijk verantwoordelijk kan zijn voor de productie van H2O2 in het oog, hebben we de niveaus van GSH / glutathion in onze studies geanalyseerd, die verband houden met H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress en het regeneratieve vermogen van cellen21,22. De analyse van glutathionspiegels is vooral relevant omdat het deelneemt aan de anti-oxidatieve beschermingsmechanismen in het oog24. Blootstelling aan H2O2 wordt vaak gebruikt als een model om de oxidatieve stressgevoeligheid en antioxiderende activiteit van RPE-cellen1,25,26,27,28,29,30te onderzoeken en bovendien vertoont het overeenkomsten met door licht geïnduceerde oxidatieve stressschade, een "fysiologische" bron van oxidatieve stress21.

Om de functionaliteit en de effectiviteit van neuroprotectieve factoren te evalueren, hebben we een in vitro model ontwikkeld dat de analyse mogelijk maakt om het anti-oxidatieve effect van groeifactoren uitgedrukt door cellen die genetisch gemodificeerd zijn om PEDF en GM-CSF te overexpressie te kwantificeren. Hier laten we zien dat RPE-cellen getransfecteerd met de genen voor PEDF en GM-CSF beter bestand zijn tegen de schadelijke effecten van H2O2 dan niet-getransfecteerde controlecellen, zoals blijkt uit celmorfologie, dichtheid, levensvatbaarheid, intracellulair niveau van glutathion en expressie van het UCP2-gen, dat codeert voor het mitochondriale ontkoppelingseiwit 2 waarvan is aangetoond dat het reactieve zuurstofsoorten (ROS) vermindert31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke ogen werden goedgekeurd door de Kantonnale Ethische Commissie voor Onderzoek (nr. 2016-01726).

1. Celisolatie en kweekomstandigheden

  1. Menselijke ARPE-19 cellijn
    1. Kweek 5 x 105 ARPE-19 cellen, een menselijke RPE-cellijn, in Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 U/ml penicilline, 80 μg/ml streptomycine en 2,5 μg/ml amfotericine B (volledig medium) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht in een T75-kolf (voor andere celdichtheden zie tabel 1).
    2. Verander het medium drie keer per week.
    3. Zodra de cellen zijn gegroeid tot ongeveer 90% confluentie (kwalitatief geëvalueerd), zuigt u het medium op en wast u de cellen met steriele 1x PBS.
    4. Incubeer de cellen met een 5% Trypsine-2% EDTA-oplossing gedurende 7-10 min bij 37 °C (voor volumes zie tabel 1). Monitor onthechting visueel.
    5. Stop de trypsinisatie door toevoeging van een volledig medium met 10% FBS (voor volumes zie tabel 1).
    6. Transfecteer de cellen (zie stap 2. van het protocol), subkweek de cellen in een verhouding van 1:10 (eenmaal per week), of zaad in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stappen 3.3 en 3.4 van het protocol).
Medium (ml)
Oppervlakte (cm²)Zaaidichtheid voor ARPE-19 cellen (cellen/put)ToepassingVoor celkweekOm trypsine te stoppenVolume trypsine (ml)
Kolf T75755,00,000ARPE-19 celgroei1073
6 Put plaat9.61,00,000Zaaien van getransfecteerde ARPE-19 cellen310.5
24 Put plaat250,000Zaaien van getransfecteerde hRPE-cellen10.80.2
96 Put plaat0.325.000 voor oxidatieve stressexperimenten met getransfecteerde cellen (fig. 1)Oxidatieve stress experimenten0.2
3.000 voor oxidatieve stressexperimenten met niet-getransfecteerde cellen plus eiwitten (fig. 1)

Tabel 1: Celkweekvolumes. Aanbevolen mediavolumes voor celkweekplaten en -kolven voor de kweek van ARPE-19 en primaire menselijke RPE-cellen.

  1. Primaire menselijke RPE-cellen
    1. Isoleer primaire menselijke RPE-cellen zoals beschreven door Thumann et al.17, en kweekcellen in volledig medium aangevuld met 20% FBS.
    2. Verander het medium twee keer per week. Zodra de cellen confluentie bereiken (visueel gecontroleerd), verlaagt u FBS tot 1% om overgroei te voorkomen.
    3. Transfecteer de cellen (zie stap 2 van het protocol) of zaad in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stappen 3.3 en 3.4 van het protocol).
      OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens werden verzameld uit de kweek van RPE-cellen verkregen uit de ogen van vier menselijke donoren. Tabel 2 geeft de demografie weer van de donoren van de Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). De ogen werden 12,7 ± 5,7 uur (gemiddelde ± SD) post-mortem gegraveerd nadat geïnformeerde toestemming was verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
Neeleeftijdgeslachtdood tot behoud (uren)dood door isolementteeltteeltSymbool in grafiek
(dagen)vóór transfectie (dagen)na transfectie (dagen)
280M20.7814036figure-protocol-1
386F12.888545figure-protocol-2
486F8.5526133figure-protocol-3
883F8.961827figure-protocol-4
bedoelen83.812.76.867.360.3
SD2.95.71.557.049.1

Tabel 2: Demografie van menselijke donoren voor retinale pigmentepitheelcellen.

2. Elektroporatie van ARPE-19 en primaire menselijke RPE-cellen

  1. Trypsinize ARPE-19 cellen of primaire menselijke RPE cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol.
  2. Voer elektroporatie uit met de in de handel verkrijgbare transfectiekit (zie Tabel met materialen).
    1. Voor transfectie van ARPE-19 cellen verwijzen naar Johnen et al.32 en voor primaire hRPE naar Thumann et al.17. Resuspend 1 x 105 ARPE-19 cellen of 5 x 104 primaire hRPE-cellen in 11 μL R-buffer en voeg 2 μL plasmidemengsel toe met 0,03 μg pSB100X transposase33 en 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His of pT2-CMV-GMCSF-His transposon (verhouding transposase:transposon 1:16). Gebruik voor PEDF en GM-CSF dubbel getransfecteerde cellen een verhouding van 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His, en 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Gebruik de volgende elektroporatieparameters: twee pulsen van 1.350 V voor 20 ms (pulsbreedte) voor ARPE-19-cellen; twee pulsen van 1.100 V voor 20 ms voor primaire cellen.
  3. Zaad 1 x 105 getransfecteerde ARPE-19 of 5 x 104 getransfecteerde primaire hRPE-cellen in respectievelijk 6-well en 24-well platen, in medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica of antimycotica. Voeg penicilline (80 E / ml), streptomycine (80 μg / ml) en amfotericine B (2,5 μg / ml) toe met de eerste mediumuitwisseling 3 dagen na transfectie.
  4. Bepaal de celgroei door wekelijkse microscopische monitoring van de cellen. Transfectie-efficiëntie wordt bewaakt door de analyse van genexpressie door RT-PCR en eiwitsecretie door ELISA en WB (methoden uitgelegd in aanvullend materiaal).
    OPMERKING: Transfectie-efficiëntie kan voor de eerste keer worden geëvalueerd zodra de cellen confluentie bereiken, d.w.z. op ~ 7 dagen en 4 weken na transfectie voor respectievelijk ARPE-19-cellen en primaire hRPE-cellen.
  5. Zaadcellen in een 96-putplaat zoals hieronder beschreven (zie stap 3.5 van het protocol).

3. Oxidatieve stress inductie (H2O2 behandeling) en neuroprotectie (PEDF en/of GM-CSF behandeling)

  1. Bereiding van geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19-cellen
    1. Gebruik ARPE-19-cellen getransfecteerd met de genen PEDF, GM-CSF of beide (zie stap 2 van het protocol); kweekcellen gedurende 28 dagen zoals beschreven in stap 1.1 van het protocol.
    2. 28 dagen na de transfectie trypsiniseren cellen (zie stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol), cellen tellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35en zaaien 5 x 105 cellen in T75-kolven in volledig medium zoals beschreven in stap 1.1.1 van het protocol. Wissel het medium uit wanneer de celcultuur ongeveer 80% confluent is (ongeveer na 1 week; kwalitatief geverifieerd). Verzamel het medium na 24 uur.
    3. Bewaar het medium bij -20 °C tot gebruik.
      OPMERKING: De voldoende concentratie van de recombinante PEDF en GM-CSF in het geconditioneerde medium werd geverifieerd door WB en gekwantificeerd door ELISA zoals beschreven in Aanvullend materiaal.
  2. Zuivering van PEDF en GM-CSF uit geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19 cellen
    1. Centrifugeer het verzamelde medium uit stap 3.1.2 bij 10.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    2. Gebruik de Ni-NTA superflow (zie Tabel met materialen) volgens de protocollen van de fabrikant om His-tagged eiwitten te zuiveren zoals hieronder beschreven.
      1. Pipetteer 30 μL Ni-NTA-mengsel in een buis van 1,5 ml en centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg. Was de pellet tweemaal met 200 μL 1x incubatiebuffer.
      2. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg. Voeg 40 μL 4x incubatiebuffer toe en resuspend.
      3. Voeg 900 μL gecentrifugeerd geconditioneerd medium toe en incubeer bij 70 rpm (orbitale shaker) gedurende 1 uur bij RT. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 1 min en de weggooidoorstroom.
      4. Was de pellet tweemaal met 175 μL 1x incubatiebuffer. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s en gooi de doorstroming weg.
      5. Om His-tagged PEDF- en GM-CSF-eiwitten te elueren, voegt u 20 μL elutiebuffer toe en incubeert u gedurende 20 tpm (orbitale shaker) gedurende 20 minuten bij RT. Centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 30 s. Bewaar het supernatant dat recombinant PEDF of GM-CSF bevat.
    3. Kwantificeer het totale eiwit met behulp van de in de handel verkrijgbare BCA-eiwittestkit (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Bewaar de eiwitoplossing bij -20 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Incubatiebuffer (4x) bevat 200 mM NaH2PO4,1,2 M NaCl en 40 mM imidazool; Elutiebuffer bevat 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl en 250 mM Imidazol.
  3. Behandeling van niet-getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met geconditioneerd medium plus H2O2 (Figuur 1A)
    1. Zaad 3.000 niet-getransfecteerde ARPE-19 (vanaf stap 1.1.6 van het protocol) of primaire hRPE (vanaf stap 1.2.3 van het protocol) cellen per put in 96-well plaat en cultuur in 200 μL geconditioneerd medium van getransfecteerde ARPE-19 cellen.
    2. Kweek de cellen gedurende 10 dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Verander het geconditioneerde medium elke dag. Stel de cellen gedurende 24 uur bloot aan 350μMH2 O 2.
    3. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol) en cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 12 dagen. Heldere microwellplaten met platte bodem worden gebruikt om luminescentie en celmorfologie te evalueren. Om tegelijkertijd de cytotoxiciteits- en glutathiontest uit te voeren, moeten twee platen op dezelfde dag met cellen worden gezaaid.
  4. Behandeling van niet-getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met PEDF- en GM-CSF-groeifactoren plus H2O2 (Figuur 1B)
    1. Zaad 3.000 niet-getransfecteerde ARPE-19 (vanaf stap 1.1.6 van het protocol) of primaire hRPE (vanaf stap 1.2.3 van het protocol) cellen per put (96-putplaten met een heldere vlakke bodem) in 200 μL volledig kweekmedium met 500 ng/ml recombinant PEDF en/of 50 ng/ml recombinant GM-CSF, gezuiverd uit het medium van getransfecteerde ARPE-19-cellen of in de handel verkrijgbaar. Kweekcellen gedurende 48 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Vernieuw het medium inclusief PEDF en GM-CSF groeifactoren dagelijks.
      OPMERKING: Voeg de groeifactoren vers toe aan het medium.
    2. Na 48 uur behandeling van de cellen met de groeifactoren, verwijdert u het medium en voegt u het volledige medium toe dat 350 μM H2O2 plus 500 ng / ml PEDF en / of 50 ng / ml GM-CSF bevat.
    3. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol) en cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 3 dagen.
  5. Behandeling van getransfecteerde ARPE-19/primaire hRPE-cellen met H2O2 (Figuur 1C)
    1. Controleer voldoende genexpressie en eiwitsecretie van getransfecteerde cellen door WB en ELISA zoals beschreven in het aanvullend materiaal.
    2. Verwijder het medium uit de putjes met de getransfecteerde cellen (zie stap 2 van het protocol).
    3. Trypsinize cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35.
    4. Zaad 5.000 getransfecteerde cellen/put in 96-well plaat in 200 μL volledig medium. Kweekcellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht. Stel de cellen na 24 uur gedurende 24 uur bloot aan 350μMH2 O 2.
    5. Evalueer oxidatieve stressschade en bepaal het antioxiderende effect van PEDF en GM-CSF door kwantificering van glutathionniveaus (zie stap 4.1 van het protocol), microscopie (zie stap 4.2 van het protocol), cytotoxiciteitstest (zie stap 4.2 van het protocol) en bepaling van UCP2-genexpressie (zie stap 4.3 van het protocol).
      OPMERKING: De duur van het experiment is 2 dagen.

figure-protocol-5
Figuur 1: Tijdlijnen van de H2O2-test in de drie verschillende experimentele benaderingen. 3.000 niet-getransfecteerde cellen behandeld met het geconditioneerde medium / recombinante eiwitten of 5.000 getransfecteerde cellen werden gezaaid in 96-well platen voor behandeling met H2O2. Om het effect van geconditioneerd medium te bepalen, werden cellen gedurende 10 opeenvolgende dagen in 100% gekweekt medium gekweekt, waarbij het medium elke dag werd vervangen. Om het effect van recombinante groeifactoren te bepalen, werden cellen gekweekt door elke dag gedurende 3 opeenvolgende dagen de juiste hoeveelheid groeifactoren toe te voegen. Merk op dat niet-getransfecteerde cellen werden gezaaid met 3.000 cellen per put om overgroei te voorkomen tijdens de langere kweekduur in vergelijking met getransfecteerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Analyse van oxidatieve stressniveaus en antioxidantcapaciteit

  1. Glutathion assay
    1. Meet de glutathion (GSH) niveaus met behulp van de in de handel verkrijgbare kit (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, bereid en geschikt volume van 1x Reagensmengsel (100 μL reagens / put): Luciferin-NT substraat en Glutathion S-Transferase verdund 1:100 in reactiebuffer.
      OPMERKING: Een 96-well plaat vereist 10 ml 1x reagensmengsel, dat wordt bereid door 100 μL Luciferine-NT-substraat en 100 μL glutathion S-Transferase toe te voegen aan 10 ml reactiebuffer. Bereid de 1x Reagensmix direct voor gebruik. Bewaar geen bereide reagensmix voor toekomstig gebruik.
    2. Bereid het Luciferin Detection Reagens voor door één fles Reconstitution buffer over te brengen naar het gelyofiliseerde Luciferin Detection Reagens.
    3. Bereid een standaardcurve voor met een glutathion (GSH) standaardoplossing (5 mM). Verdun 5 mM GSH-oplossing 1:100 met dH2O (voeg 10 μL 5 mM GSH-oplossing toe aan 990 μL dH2O). Voer 7 seriële 1:1 verdunning uit in 500 μL dH2O. Breng 10 μL van elke verdunde standaard over naar een geschikte put in tweevoud.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie glutathion zal variëren van 0,039 μM tot 5 μM.
    4. Bereid de blanco (1x reagensmengsel) en breng 10 μL (duplicaten) over in de juiste putjes.
    5. Verwijder de met H2O2behandelde cellen uit de couveuse.
      OPMERKING: Documenteer de morfologie van de met H2O2behandelde cellen door middel van brightfield-microscopie (40x).
      Wanneer de cellen geoxideerd zijn, zien ze er meer afgerond en minder verspreid uit.
    6. Aspirateer het cultuurmedium zorgvuldig. Voeg 100 μL bereid 1x reagensmengsel toe aan elk putje. Meng de cellen met het reagens gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker.
    7. Incubeer de plaat bij RT gedurende 30 minuten. Voeg 100 μL gereconstitueerd Luciferin Detection Reagens toe aan elke put.
    8. Meng de oplossing gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT.
    9. Bepaal luminescentie met behulp van een plaatlezer met behulp van een vooraf geïnstalleerd programma ADP-Glo.
      OPMERKING: Plaats de plaat in de plaatlezer zonder deksel.
      1. Klik op Lay-out wijzigen en kies de volgende instellingen in Basisparameters:Costar 96-well plaat; top optiek; positioneringsvertraging: 0,1; meetstarttijd: 0,0; meetinterval tijd: 1.0; tijd om de resultaten te normaliseren: 0,0; de versterking wordt automatisch aangepast door het apparaat. Definieer spaties, standaarden en monsters. Klik op Meting starten.
      2. Exporteer de gegevens als een Excel-bestand. Bereken de concentratie van GSH in elk monster door interpolatie van de standaardcurve.
  2. Cytotoxiciteitstest en microscopische analyse
    1. Zuig het medium uit de cellen en voeg 100 μL volledig medium met 1% FBS toe aan elke put. Breng de cellen terug naar de couveuse.
      OPMERKING: 1% FBS wordt gebruikt omdat hogere percentages FBS de meting van de luminescentie kunnen verstoren, daarom wordt in dit geval 1% FBS gebruikt.
    2. Meet de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitstestkit (zie Tabel met materialen)volgens de instructies van de fabrikant. Bereid kort het reagensmengsel voor en voeg de assaybuffer toe aan het gelyofiliseerde substraat. Bereid het Lysis-reagens door 33 μL Digitonin toe te voegen aan 5 ml assaybuffer (voor één 96-well plaat). Meng goed door op en neer te pipetteren om homogeniteit te garanderen.
      OPMERKING: Gebruik voor een optimaal resultaat een vers bereid reagensmengsel. Gebruik binnen 12 uur indien bewaard bij RT. Reagensmengsel kan maximaal 7 dagen bij 4 °C worden bewaard en kan tot 4 maanden bij -70 °C in aliquots voor eenmalig gebruik worden bewaard. Bevriezing en ontdooien moeten worden vermeden. Het Lysis-reagens kan maximaal 7 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    3. Bereid een standaardcurve voor met onbehandelde ARPE-19-cellen.
      1. Trypsiniseren van de cellen zoals beschreven in stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol en tellen de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35. Centrifugeer de cellen bij 120 g gedurende 10 minuten bij RT. Zuig het supernatant op en resuspend de celkorrel in DMEM/Ham's F12 medium met 1% FBS tot een eindconcentratie van 1 x 105 cellen/ml.
      2. Bereid 7 seriële 1:1 verdunningen in een medium van 200 μL met 1% FBS. Breng 100 μL van elke standaard over naar de juiste putten (duplicaten). Voeg 50 μL reagensmengsel toe aan alle putjes.
    4. Meng de cellen met het reagens gedurende 15 s bij 500 rpm op een orbitale shaker. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT. Meet luminescentie met behulp van de plaatlezer zoals beschreven in stap 4.1.9 van het protocol. Voeg 50 μL van het lysisreagens toe en incubeer gedurende 15 minuten. Meet luminescentie met behulp van de plaatlezer zoals beschreven in stap 4.1.9 van het protocol.
    5. Bereken het percentage levensvatbare cellen: (100 - % dode cellen) en het percentage dode cellen = [1e luminescentiemeting ((dode cellen in het monster))) / 2e luminescentiemeting (alle cellen dood na digitoninebehandeling)] x 100.
  3. UCP2-expressieanalyse door RT-qPCR
    1. Trypsinize getransfecteerde cellen zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.3-1.1.5 van het protocol).
    2. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer34,35.
    3. Zaad 5.000 getransfecteerde ARPE-19 cellen/put in 96-well platen.
    4. Behandel na 24 uur cultuur de cellen met 350 μM H2O2 gedurende 24 uur.
    5. Isoleer totaal RNA met behulp van een commerciële kit voor isolatie van RNA uit een laag aantal cellen (zie Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Voer real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) uit zoals beschreven in Aanvullend materiaal. Genereer in het kort cDNA door retrotranscriptie met behulp van een in de handel verkrijgbare mix die een geoptimaliseerd M-MLV Reverse Transcriptase bevat (zie Tabel met materialen).
    7. Gebruik voor qPCR een kant-en-klare reactiecocktail met alle componenten (inclusief SYBR Green) behalve primers (zie tabel S1 van aanvullend materiaal)en DNA-sjabloon. Gebruik de volgende thermocyclische omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 10 minuten, 40 cycli met denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en rek bij 72 °C gedurende 32 s.
    8. Gebruik de 2^(-ΔΔCT)-methode voor analyse36.
  4. Voorbereiding van cellysaat voor SDS-PAGE en WB analyse van pAkt (Ser473)
    1. Zaad 3 x 105 GM-CSF-getransfecteerde ARPE-19 cellen/put in 6-put platen (≥21 dagen na transfectie) om te bepalen of GM-CSF RPE-cellen beschermt tegen schade door H2O2 door de activering van de Akt overlevingsroute15.
    2. Na 24 uur kweek worden cellen gedurende 24 uur blootgesteld aan 350 μM H2O2.
    3. Meng 1 ml RIPA-buffer met 10 μl proteasefosfataseremmercocktail, 10 μl 0,5 M EDTA en 25 μl 8 m ureum (volumes gebruikt voor één put).
    4. Aspirateer het medium zorgvuldig en was de cellen met 1x PBS.
    5. Voeg het volledige volume RIPA-buffermix toe aan de cellen.
    6. Pipet op en neer.
    7. Verzamel het lysaat in buizen van 1,5 ml.
    8. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    9. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    10. Bepaal de niveaus van pAkt in 15 μL onverdund cellysaat door WB zoals beschreven in Aanvullend materiaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Inductie van oxidatieve stress in menselijke retinale pigmentepitheelcellen
ARPE-19 en primaire hRPE-cellen werden behandeld met verschillende concentraties van H2O2 gedurende 24 uur en het intracellulaire niveau van de antioxidant glutathion werd gekwantificeerd (Figuur 2A,B). H2O2 bij 50 μM en 100 μM had geen invloed op de glutathionproductie, terwijl er bij 350 μM een signific...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol biedt een benadering om de anti-oxidatieve en beschermende functie van PEDF en GM-CSF geproduceerd door getransfecteerde cellen te analyseren, die kunnen worden toegepast op cellen die zijn getransfecteerd met elk vermeend gunstig gen. In gentherapeutische strategieën die tot doel hebben eiwitten aan weefsel te leveren door genetisch gemodificeerde cellen te transplanteren, is het van cruciaal belang om informatie te verkrijgen over het niveau van eiwitexpressie, de levensduur van express...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Gregg Sealy en Alain Conti bedanken voor hun uitstekende technische assistentie en Prof. Zsuzsanna Izsvák van het Max-Delbrück Center in Berlijn voor het leveren van de pSB100X en pT2-CAGGS-Venus plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Sciences Foundation en de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma. Z.I werd gefinancierd door european research council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well platesCorning353047
6-well platesGreiner7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom Costar3610Staat toe om de cellen te controleren voor het meten van de luminescentie (GSH-Glo Assay)
96-well platesCorning 353072
Acrylamid 40%Biorad161-0144
Amphotericin BAMIMED4-05F00-H
Antibody anti-GMCSFThermoFisher ScientificPA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM AgilentP0260
Antibody anti-PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
Antibody anti-penta-His Qiagen34660
Antibody anti-phospho-AktCell Signaling Technology9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRPAbcamab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
ARPE-19 cell lineATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
chamber culture glass slidesCorning354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham`s F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set ELISA kitR&D Systems DY215-05
EDTAThermoFisher Scientific78440
ELISAquant kitBioProducts MDPED613-10-Human
Eyes (human)Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS BrunschwigP40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting MediumSigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0)GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione AssayPromegaV6912
hydrogen peroxide (H2O2)Merck107209
ImageJ software (image processing program)W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol AxonlabA1378.0010
Leica DMI4000B microscope Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 softwareRoche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
Neon Transfection System ThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System 10 µL KitThermoFisher ScientificMPK1096
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Ni-NTA superflow Qiagen30410
Nitrocellulose VWR732-3197
Omega Lum G Gel Imaging SystemAplegen Life Science
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23227
Primers Invitrogen Zie Tabel 1 in Aanvullende Materialen
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Verstrekt door Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Geconstrueerd met behulp van het bestaande pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid gerapporteerd in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Geconstrueerd met behulp van het bestaande pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid gerapporteerd in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51304
recombinant hGM-CSF Peprotech100-11
recombinant hPEDF  BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep SystemPromegaZ6011
RIPA bufferThermoFisher Scientific89901
RNase-free DNase SetQIAGEN79254
RNeasy Mini KitQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
Semi-dry transfer system for WB Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
Tris-buffered saline (TBS) ThermoFisher Scientific15504020
Triton X-100AppliChemA4975
Trypsin/EDTA

Referenties

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

WaterstofperoxidemodelPEDF GM CSF transfectieglutathionmetingUCP2 genexpressieWestern blot analysecelviabiliteitsassaybereiding van geconditioneerd medium
Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.