Beeldvorming van levende dieren en celsorteermethoden voor het onderzoeken van neurodegeneratie in een C. elegans excitotoxisch necrosemodel

Samenvatting

In een C. elegans excitotoxiciteitsmodel maakt dit protocol gebruik van in vivo beeldvorming om de regulatie van necrotische neurodegeneratie, het effect van genen die coderen voor kandidaat-mediatoren en de betrokkenheid van mitochondriën te analyseren. Celdissociatie en sortering wordt gebruikt om specifiek risiconeuronen te verkrijgen voor celspecifieke transcriptomische analyse van neurodegeneratie en neuroprotectiemechanismen.

Samenvatting

Excitotoxische necrose is een belangrijke vorm van neurodegeneratie. Dit proces van gereguleerde necrose wordt veroorzaakt door de synaptische accumulatie van de neurotransmitter glutamaat en de overmatige stimulatie van de postsynaptische receptoren. Informatie over de daaropvolgende moleculaire gebeurtenissen die culmineren in de duidelijke neuronale zwellingsmorfologie van dit type neurodegeneratie ontbreekt echter. Andere aspecten, zoals veranderingen in specifieke subcellulaire compartimenten, of de basis voor de differentiële cellulaire kwetsbaarheid van verschillende neuronale subtypes, blijven onderbelicht. Bovendien kan een reeks factoren die een rol spelen in onderzoeken waarbij in vitro of ex vivo preparaten worden gebruikt, de natuurlijke progressie van deze vorm van neurodegeneratie wijzigen en verstoren. Het is daarom belangrijk om excitotoxische necrose bij levende dieren te bestuderen door de effecten te monitoren van interventies die de mate van neuronale necrose reguleren in het genetisch vatbare en transparante modelsysteem van de nematode Caenorhabditis elegans. Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van excitotoxische necrose in C. elegans-neuronen , waarbij optische, genetische en moleculaire analyse worden gecombineerd. Om excitotoxische aandoeningen in C. elegans te induceren, wordt een knock-out van een glutamaattransportergen (glt-3) gecombineerd met een neuronale sensibiliserende genetische achtergrond (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) om glutamaatreceptorhyperstimulatie en neurodegeneratie te produceren. Nomarski differentieel interferentiecontrast (DIC), fluorescerende en confocale microscopie bij levende dieren zijn methoden die worden gebruikt om neurodegeneratie te kwantificeren, subcellulaire lokalisatie van fluorescerend gelabelde eiwitten te volgen en mitochondriale morfologie in de degenererende neuronen te kwantificeren. Neuronale fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) wordt gebruikt om risiconeuronen duidelijk te sorteren voor celtypespecifieke transcriptomische analyse van neurodegeneratie. Een combinatie van live beeldvorming en FACS-methoden, evenals de voordelen van het C. elegans-modelorganisme , stellen onderzoekers in staat om dit systeem te gebruiken om reproduceerbare gegevens te verkrijgen met een grote steekproefomvang. Inzichten uit deze testen kunnen zich vertalen in nieuwe doelwitten voor therapeutische interventie bij neurodegeneratieve ziekten.

Inleiding

Excitotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van neuronale dood bij hersenischemie en een bijdragende factor bij meerdere neurodegeneratieve ziekten 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Verstoring van de zuurstofrijke bloedtoevoer naar de hersenen (bijvoorbeeld als gevolg van een bloedstolsel) resulteert in het niet goed functioneren van glutamaattransporters, wat leidt tot ophoping van glutamaat in de synaps. Deze overmaat aan glutamaat overactiveert postsynaptische glutamaatreceptoren (GluR's), wat leidt tot een overmatige (katalytische, niet-stoichiometrische) instroom van Ca²⁺ in neuronen (Figuur 1A). Deze schadelijke instroom leidt tot progressieve postsynaptische neurodegeneratie die morfologisch en mechanistisch varieert van apoptose tot gereguleerde necrose 10,11,12. Hoewel ze gebaseerd waren op succesvolle interventies in diermodellen, hebben meerdere klinische onderzoeken met GluR-antagonisten die tot doel hadden de toegang tot Ca²⁺ te blokkeren en de levensvatbaarheid van cellen te bevorderen, gefaald in de klinische setting 13,14,15,16. Een waarschijnlijke kritische bijdrage aan deze mislukkingen is het feit dat (in tegenstelling tot de diermodellen) de behandeling in de klinische setting uren na het begin van de beroerte wordt toegediend, waardoor de interventie laatwerkende neuroprotectieve mechanismen blokkeert, terwijl de degeneratieve signalering stroomafwaarts van GluRs 14,16,17 niet wordt onderbroken. Een alternatieve benadering, die gebaseerd is op trombolyse, kan alleen worden toegediend binnen een zeer beperkt tijdsbestek, waardoor veel patiënten (die thuis een beroerte krijgen met een slecht identificeerbaar tijdstip van aanvang) er niet van kunnen profiteren¹⁷. Deze tegenslagen benadrukken de noodzaak om excitotoxiciteitsonderzoek te richten op de studie van gebeurtenissen die optreden na GluR-hyperstimulatie en om daaropvolgende degeneratieve cascades te onderscheiden van gelijktijdige neuroprotectieve processen. Deze aanpak kan helpen celbeschadiging te voorkomen en efficiënte medicijndoelen te identificeren die later na het begin van de schade kunnen worden toegediend.

Een benadering om latere gebeurtenissen in excitotoxiciteit te identificeren, is het bestuderen van de celdoodsignaleringsmechanismen stroomafwaarts van GluR-hyperstimulatie, zoals die welke leiden tot mitochondriale collaps. Drastische storing van de mitochondriale fysiologie en dynamiek is een kenmerk van neurodegeneratie, zoals te zien is in excitotoxiciteit 18,19,20. Hoewel alle cellen afhankelijk zijn van de mitochondriale functie en beschikbaarheid voor overleving, activiteit en cellulair onderhoud, zijn neuronen in het bijzonder afhankelijk van de mitochondriale energieproductie om de signaaloverdracht en voortplanting te ondersteunen. In het bijzonder besteden neuronen ~50% van hun signaalgerelateerde energieverbruik aan het herstellen van het rustmembraanpotentieel na de activering van postsynaptische receptoren/kanalen²¹, met een hoge afhankelijkheid van zuurstof en glucose. De verminderde beschikbaarheid van glucose en zuurstof die bij een beroerte wordt waargenomen, leidt tot ernstige mitochondriale veranderingen, waardoor de ATP-productie verder wordt verminderd 19,22,23,24. Studies om de opeenvolging van gebeurtenissen te identificeren die leiden tot mitochondriale collaps leverden echter controversiële resultaten op en ontbraken consensus. Het analyseren van mitochondriale morfologie kan helpen bij het begrijpen van deze gebeurtenissen die leiden tot mitochondriale pathologie, aangezien het een goede indicator is van de neuronale gezondheid 25,26,27,28,29. Filamenteuze mitochondriën zijn representatief voor een gezond neuron, terwijl gefragmenteerde mitochondriën aanzienlijke neuronale schade vertonen die kan leiden tot celdood. Het analyseren van mitochondriale morfologie bij levende dieren onder verschillende genetische omstandigheden kan helpen focussen op specifieke genen en routes die betrokken zijn bij mitochondriale-afhankelijke neurodegeneratie bij excitotoxiciteit.

Een andere benadering voor het identificeren van latere gebeurtenissen die de mate van excitotoxische neurodegeneratie zouden kunnen reguleren, is het bestuderen van de transcriptionele neuroprotectieve mechanismen die sommige effecten van excitotoxiciteit verzachten^14,16. Het gebrek aan specificiteit van de belangrijkste neuroprotectieve transcriptiefactoren en de divergentie van experimentele opstellingen belemmeren echter het succes van de inspanningen om de belangrijkste neuroprotectieve programma's duidelijk te identificeren (vooral bij gereguleerde necrose).

Daarom stuitten zowel de studie van stroomafwaartse doodssignaleringsroutes als de studie van transcriptionele neuroprotectie bij excitotoxiciteit op grote moeilijkheden en meningsverschillen over waargenomen resultaten. Een groot deel van deze controverse zal waarschijnlijk voortkomen uit het gebruik van ex vivo of in vitro modellen van excitotoxiciteit en de variabiliteit die wordt geïntroduceerd door de specificiteit van verschillende experimentele opstellingen. Het is daarom zeer nuttig om je te concentreren op het identificeren van kernmechanismen die sterk geconserveerd zijn, en deze in vivo te bestuderen. Het eenvoudige modelsysteem van de nematode C. elegans biedt een bijzonder effectieve optie, vanwege de krachtige combinatie van bijzonder krachtige en gediversifieerde onderzoeksinstrumenten, het behoud van kernceldoodroutes en de rijke informatie over de structuur en connectiviteit van het zenuwstelsel 30,31,32,33. Het baanbrekende werk van het Driscoll-lab over de genetische analyse van necrotische neurodegeneratie in mechanosensorische neuronen is inderdaad een uitstekende demonstratie van de kracht van deze benadering³⁴. Belangrijk voor de analyse van excitotoxiciteit is dat het behoud van signaalroutes in de nematode alle belangrijke componenten van glutamaterge neurotransmissie omvat^35,36.

Het excitotoxiciteitsmodel voor nematoden bouwt voort op deze baanbrekende studies, waardoor de onderzoeker biochemische processen kan bestuderen die verwant zijn aan die welke optreden bij beroertes en andere neurodegeneratieve ziekten die worden beïnvloed door glutamaatafhankelijke neurotoxiciteit. Om excitotoxische aandoeningen in C. elegans te induceren, maakt deze experimentele benadering gebruik van een excitotoxiciteitsstam die de combinatie is van een knock-out van een glutamaattransportergen (glt-3) en neuronale sensibiliserende genetische achtergrond (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) om GluR-hyperstimulatie en neurodegeneratie³⁷ te produceren. Deze excitotoxiciteitsstam legt 30 specifieke neuronen bloot (glr-1-expressie) die postsynaptisch tot glutamaterge verbindingen zijn met excitotoxische neurodegeneratie. Van deze 30 risiconeuronen ondergaan individuele neuronen necrose naarmate het dier vordert in de ontwikkeling (met gemengde stochasticiteit en gedeeltelijke voorkeur voor bepaalde specifieke neuronen³⁸), terwijl tegelijkertijd ook geleidelijk cellichamen worden verwijderd. In combinatie met de toegankelijkheid van veel mutante stammen, maakt deze benadering het mogelijk om meerdere routes te bestuderen die neurodegeneratie en neuroprotectie beïnvloeden. Deze benaderingen zijn al gebruikt om enkele van de stroomafwaartse doodssignaleringscascades te analyseren³⁹ en transcriptionele regulatoren van excitotoxische neurodegeneratie bij excitotoxiciteit^38,40. Net als andere gevallen van necrotische neurodegeneratie in de worm⁴¹, is er bij de excitotoxische neurodegeneratie van de nematode geen sprake van klassieke apoptose⁴⁰.

Dit methodendocument beschrijft het basissysteem voor het induceren, kwantificeren en manipuleren van excitotoxische necrotische neurodegeneratie in C. elegans. Bovendien worden twee belangrijke protocollen geschetst die momenteel worden gebruikt om studies naar specifieke aspecten van excitotoxiciteit van nematoden te stroomlijnen. Door gebruik te maken van fluorescerende reporters en live in vivo beeldvorming kan de onderzoeker de mitochondriale betrokkenheid en dynamiek in het nematodenmodel van excitotoxische neurodegeneratie bestuderen. Om het effect van specifieke neuroprotectieve transcriptiefactoren te bepalen, kan de onderzoeker celtypespecifieke expressie van fluorescerende markers, dissociatie van dieren in afzonderlijke cellen en FACS gebruiken om specifieke neuronen te isoleren die het risico lopen op necrose door excitotoxiciteit. Deze celtype-specifieke geïsoleerde neuronen kunnen vervolgens worden gebruikt voor RNA-sequencing in stammen die mutaties in belangrijke transcriptiefactoren herbergen. Samen kunnen deze methoden onderzoekers in staat stellen om de moleculaire onderbouwing van excitotoxische neurodegeneratie en neuroprotectie in vivo met grote duidelijkheid en precisie te achterhalen.

Protocol

1. Stammen die worden gebruikt om excitotoxische neurodegeneratie en neuroprotectie te onderzoeken

1. Gebruik de excitotoxiciteitsstam ZB1102 voor nematoden als referentiepunt voor standaard excitotoxische neurodegeneratie.
   OPMERKING: Glutamaatafhankelijke excitotoxiciteit in C. elegans wordt geproduceerd in stam ZB1102 door een knock-out (ko) van een glutamaattransporter te combineren met een transgen dat neuronen bij deze dieren gevoelig maakt voor neurotoxiciteit en tot expressie komt in een subset van neuronen postsynaptisch naar glutamaterge verbindingen³⁷. Deze genetische combinatie wordt de excitotoxiciteitsstam van nematoden genoemd en is gratis verkrijgbaar bij het Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
2. Om het effect te bestuderen van genen die coderen voor kandidaat-regulatoren van excitotoxische necrose, combineert u een mutatie in dergelijke genen (bijv. dapk-1 of crh-1) met de excitotoxiciteitsstam van nematoden.
3. Voer genetische kruisingen uit volgens de standaard C. elegans-methoden ³⁰, zoals beschreven in wormbook.org^42,43.
4. Aangezien de moleculaire basis van de mutatie doorgaans gedocumenteerd is, moet u het kruisende nageslacht volgen door de specifieke locus te genotyperen met behulp van PCR. Onderscheid WT versus mutant op basis van fragmentgrootte (voor deleties) of sequencing (voor puntmutaties).
   OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van stammen die werden gebruikt om verschillende routes van neurodegeneratie en neuroprotectie te bestuderen, specifiek voor dit protocol.
5. Leid alle kritische stammen af aan twee onafhankelijke lijnen en test ze afzonderlijk om de validiteit van het waargenomen fenotype te bevestigen.

2. Groeimedia en veeteelt

1. Kweek wormen bij 16-25 °C op standaard NGM-platen 30,37,42 of MYOB-platen ^38,44 gezaaid met OP50 E.coli volgens de standaardmethoden.
   OPMERKING: MYOB-platen geven identieke resultaten als NGM-platen, maar zijn iets gemakkelijker te bereiden.
2. Zorg ervoor dat de experimentele soorten constant goed gevoed worden.
   OPMERKING: Uithongering kan neurodegeneratie beïnvloeden en het aantal stervende hoofdneuronen verminderen. Als wormen slecht gevoed of uitgehongerd zijn, leg ze dan op verse borden en wacht een paar generaties voordat je verder gaat met experimenten. Het transgenerationele effect van uithongering zal na enkele generaties afnemen.

3. Kwantificering van degenererende hoofdneuronen door Nomarski differentieel interferentiecontrast (DIC) en scoren

1. Gebruik de excitotoxiciteitsstam voor nematoden (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) als experimentele controle voor kwantificering, die normale excitotoxiciteitsniveaus vertegenwoordigt. Het protocol volgt hetzelfde dier niet door verschillende ontwikkelingsstadia. In plaats daarvan geeft het een momentopname van een populatie dieren in gemengde fasen, zodat men in totaal informatie van verschillende dieren verzamelt om alle ontwikkelingsstadia weer te geven.
   OPMERKING: Het nuls5-transgen [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]⁴⁵ (dat een geactiveerde Gαs en GFP tot expressie brengt in neuronen postsynaptisch naar glutamaterge verbindingen) produceert een achtergrond-GluR-onafhankelijk necrotisch neurodegeneratieniveau van ~1 stervend hoofdneuron/dier (op elk moment tijdens de ontwikkeling). De toevoeging van glt-3 (ko) verhoogt de necrotische neurodegeneratie van de neuronen die postsynaptische nuIs5 tot expressie brengen op een GluR-afhankelijke manier, tot 4-5 stervende hoofdneuronen/dier in het derde larvale stadium (L3)³⁷.
2. Gebruik voor de teststammen dieren van een recent voltooide genetische kruising, of ontdooi interessante stammen vanaf diepgevroren bouillon bij -80 °C, bereid uit verse kruisingen. Wacht een paar generaties (≥4) voordat je een fenotype en neurodegeneratie scoort.
3. Snijd en verwijder een klein stukje agar van een plaat van een populatie van goed gevoede dieren in gemengde fasen, en monteer het op een dekglaasje door het agarstuk om te draaien, zodat de dieren die op het oppervlak van de agar kropen nu naar het dekglaasje kijken.
   OPMERKING: Dieren kunnen nog steeds bewegen, maar zijn nu enigszins terughoudend en kunnen zonder verdoving worden waargenomen. Zo'n stuk kan ~1 uur worden gebruikt voordat je het vervangt door een nieuwe.
4. Met behulp van een omgekeerde DIC-richtkijker met x10 oculair en x40 of x63 objectief, scant u dieren willekeurig door het dekglaasje handmatig te verschuiven. Terwijl andere beeldvormingsstappen die hieronder worden beschreven, kunnen worden uitgevoerd op omgekeerde of rechtopstaande microscopen, vereist het onderzoek naar wormen in het agarblok een omgekeerde scoop.
5. Identificeer het ontwikkelingsstadium van elk dier aan de vorm van de baarmoeder (zie de baarmoederdiagrammen in wormbook.org).
6. Noteer voor elk dier zijn ontwikkelingsstadium en het aantal stervende (d.w.z. gevacuoliseerde) neuronen. Tel en registreer het totale aantal stervende neuronen in het hoofd, het aantal stervende neuronen in het retrovesiculaire ganglion (wat een gemakkelijke identificatie van specifieke cellen geeft) en het aantal stervende neuronen in de staart (die niet wordt beïnvloed door glutamaat en dient als interne controle, wat bevestigt dat het sensibiliserende transgen nuIs5 volledig actief is).
7. Noteer deze gegevens in een tabel waarin dieren van een bepaalde stam zijn gegroepeerd per categorie van ontwikkelingsfase.
8. Verzamel in elke sessie willekeurig gegevens van wormen van verschillende ontwikkelingsstadia; Voer verschillende scoresessies uit over meerdere dagen om voldoende gegevens te verzamelen voor statistische analyse. Registreer neurodegeneratieniveaus in meerdere stadia en construeer een staafdiagram vergelijkbaar met Figuur 1C.
   OPMERKING: Met deze methode kan worden bepaald of een bepaalde behandeling of mutatie de neurodegeneratieniveaus in alle stadia verhoogt/verlaagt (het verschuiven van de verdeling omhoog/omlaag) of de piek in neurodegeneratie verschuift naar een eerder of later ontwikkelingsstadium (het verschuiven van de verdeling naar links/rechts).
9. Voer gegevensverzameling uit terwijl u blind bent voor de identiteit van het genotype. Bevestig in twee onafhankelijke isolaten van de genetische lijn (om het gevaar van onbedoelde effecten van andere/onverwachte genetische verschillen tussen isolaten te minimaliseren) en verzamel gegevens voor analyse.
10. Bereken bij elke stam het gemiddelde en de SEM van het aantal degenererende neuronen in het hoofd (inclusief het retrovesiculaire ganglion) in elke ontwikkelingsfase (Figuur 1D). Voer indien nodig een vergelijkbare analyse uit van stervende retrovesiculaire ganglion- en staartneuronen.

4. Identificatie van specifieke degenererende hoofdneuronen

1. Monteer individuele (of kleine groepen) dieren op een agarkussen⁴⁶ en verlam de worm met tetramisol (zie hieronder, rubriek 5).
2. Met een gecombineerde fluorescentie- en DIC-scoop (rechtop of omgekeerd) lokaliseer je specifieke gevacuoliseerde neuronen.
3. Bepaal de specifieke neuronidentiteit van het gevacuoliseerde neuron door de GFP-gelabelde processen te volgen en de locatie van het cellichaam en de vorm van de processen te vergelijken met die van de neuronen waarvan bekend is dat ze glr-1 tot expressie brengen met behulp van WormAtlas⁴⁷.
   OPMERKING: Als alternatief kan identificatie worden ondersteund door nieuwe methoden om snel neuronen te identificeren door middel van meerkleurige labeling die binnenkort uit het Hobert-lab^{komen 48}.

5. Live beeldvorming van neuronale mitochondriale morfologie door fluorescerende microscopie van reporterstammen

1. Voor beeldvorming van mitochondriale veranderingen in degenererende postsynaptische neuronen (die zijn gelabeld met cytoplasmatische GFP in de oorspronkelijke excitotoxiciteitsstam) onderzoekt u mito-mCherry-fluorescentie.
2. Kruis de excitotoxiciteitsstam van de test met stammen die mitochondriën van postsynaptische neuronen labelen met rode fluorescentie (door een fusie tot expressie te brengen tussen het fluorescerende eiwit en het N-uiteinde van TOM-20 onder glr-1-promotor ; voor details over constructies en stammen, zie⁴⁹). Dieren kunnen nu worden afgebeeld met een gewone epifluorescentiemicroscoop (rechtop of omgekeerd) of een confocale microscoop.
3. Om de worm te verlammen zonder de neuronale overleving te beïnvloeden, pipettert u 5 μL 10 mM tetramisol op een vers bereid agarosepad. Zie Arnold et ^al.46 voor een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van pads.
4. Plaats de dieren in het midden van de tetramidondruppel en monteer ze met een dekglaasje.
5. Sluit de zijkanten van het dekglaasje af met nagellak en laat de nagellak drogen.
6. Binnen 20 minuten na behandeling met tetramisol en met behulp van een scoop met DIC en fluorescentiebeeldvorming, lokaliseert u wormen met behulp van een 20x objectieflens.
7. Zodra de kop van de worm is gelokaliseerd (of neuronen van belang), ga je naar een 100x oliedoel en concentreer je je op de fluorescentie-etikettering van de mitochondriën in de soma.
8. Leg Z-stack-afbeeldingen vast met behulp van DIC-, GFP- en TxRed-filterinstellingen.

6. Neuronale mitochondriën morfologie scoren en kwantificeren

1. Analyseer de mitochondriale morfologie tijdens live beeldvorming van de worm of na beeldacquisitie met behulp van ImageJ of andere beeldvormingssoftware.
2. Voor gemakkelijke identificatie en herhaalde analyse van specifieke neuronen, identificeert u de drie neuronen in het retrovesiculaire ganglion, RIGL/R en AVG (in sommige gevallen zijn er slechts twee aanwezig als gevolg van het opruimen van cellichamen bij excitotoxiciteit).
3. Categoriseer mitochondriën in drie hoofdgroepen: filamenteus, gemiddeld en gefragmenteerd 50,51,52.
   OPMERKING: Filamenteuze mitochondriën verschijnen als continue dunne structuren in de soma van neuronen, meestal rond de kern. Intermediaire mitochondriën verschijnen als een combinatie van ten minste één schijnbaar filamenteus netwerk, zij het met onderbrekingen, en enige fragmentatie in de soma. Gefragmenteerde mitochondriën vertonen volledige breuken in het mitochondriale netwerk, zien er gezwollen uit en zijn verspreid over de soma (Figuur 2A).
4. Scoor voor elke worm het percentage neuronen met filamenteuze, tussenliggende of gefragmenteerde mitochondriën voor een totaal van ten minste 30 wormen.
5. Voer statistische analyse uit met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door post hoc Tukey's test voor elke mitochondriale morfologie tussen stammen⁵³.

7. Buffer- en reagenspreparaat voor wormdissociatie voor FACS van neuronen met een risico op neurodegeneratie

1. Bereid de M9-buffer als volgt voor: 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, H₂O tot 1 L. Steriliseer door autoclaveren. Voeg 1 ml gefilterd gesteriliseerd 1 M MgSO₄ toe. Bewaren bij kamertemperatuur.
2. Bereid de eibuffer als volgt voor: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ ; autoclaaf om te steriliseren. Voeg 2 M HEPES pH 7,3 stockoplossing (eerder gefilterd met een flessendopfilter van 0,2 μm) toe aan een uiteindelijke concentratie van 25 mM. Stel de pH in op 7,3 met 1 N NaOH (niet meer dan 10 ml). Gebruik een osmometer om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke osmolariteit tussen 335 -345 mOsm ligt. Filter steriliseer de eibuffer met filters met een flessendop van 0,2 μm. Bewaren bij 4 °C.
   OPMERKING: De zouten lossen gemakkelijker op bij gebruik van MgCl₂ ·6H₂O en CaCl₂·2H₂O om respectievelijk MgCl₂ en CaCl₂ stockoplossingen te maken. Je kunt ook een bouillon van 10x eierbuffer maken en deze indien nodig verdunnen in steriel gedeïoniseerd water.
3. Bereid SDS-DTT als volgt: 20 mM HEPES pH 8,0, 0,25% SDS, 200 mM DTT, 3% sucrose. Steriliseer SDS-DTT in een weefselkweekkap met een spuitfilter van 0,2 μm. Bewaar 300 μL aliquots bij -20 °C afgedekt met folie ter bescherming tegen licht.
4. Bereid de pronase-oplossing als volgt: bereid de dag van de dissociatie 15 mg/ml pronase in eibuffer. Bewaar op ijs.

8. Leeftijdssynchronisatie voor neuronspecifieke FACS

1. Gebruik dieren die het excitotoxiciteitsgenotype (en andere mutaties, indien gewenst) combineren met transgene expressie van een sterke fluorescerende marker die gemakkelijk kan worden gebruikt voor sortering (bijv. FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)⁵⁴. Kweek dieren op twee of drie 100 mm NGM/MYOB-platen bij 20 °C totdat de plaat vol zit met overwegend zwangere wormen.
2. Was wormen van de platen met behulp van M9-buffer. Breng de wormen over in conische buisjes van 50 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml.
3. Centrifugeer 2,5 min bij kamertemperatuur bij 250x g en verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de wormpellet in 10 ml bleekoplossing (2% 10 N NaOH en 5% vers huishoudbleekmiddel in steriel gedeïoniseerd water).
5. Plaats de buizen horizontaal op een schudder, schommel op lage snelheid. Zorg ervoor dat de wormen zich niet op de bodem van de buis nestelen. Het bleekmiddel breekt de nagelriem van de worm open, maar heeft geen invloed op embryo's, die worden beschermd door de eierschaal.
   1. Deze bleekstap duurt ongeveer 5 minuten, maar dit varieert. Om ervoor te zorgen dat overbleken niet optreedt, moet u het proces in de gaten houden door elke minuut een monster te nemen: pipetteer voorzichtig 10 μL uit elk buisje op een glazen microscoopglaasje en onderzoek de wormen met een ontleedmicroscoop.
6. Zodra de meeste zwangere wormen zijn opengebarsten maar niet volledig zijn opgelost, stopt u de bleekstap door de conische buisjes te vullen met eibuffer.
7. Om de eieren/embryo's op te halen, centrifugeert u de buisjes 2,5 minuut op 250x g , verwijdert u het bovenstaande en spoelt u opnieuw met eierbuffer.
8. Herhaal nog vier wasbeurten.
9. Resuspendeer de eieren door de pellet voorzichtig te pipetteren en uit te spreiden over vier 100 mm gezaaide NGM/MYOB-platen. Laat embryo's uitkomen en groeien bij 20 °C gedurende 3 dagen.
   OPMERKING: De platen moeten nu vol zitten met overwegend zwangere wormen.
10. Herhaal de leeftijdssynchronisatie door dit bleekmiddel/leeftijdssynchronisatieprotocol te herhalen.
11. Pipetteer de eieren op acht 100 mm NGM/MYOB platen. Laat het dier uitkomen en groeien bij 20 °C tot het gewenste larvale stadium.

9. Dissociatie van hele wormcellen voor FACS

1. Kweek gesynchroniseerde wormen tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Was de platen van 100 mm voorzichtig af met M9-buffer en glazen serologische pipetten en breng ze over in conische buisjes van 50 ml.
2. Voeg koude M9 toe tot 45 ml. Plaats de buizen 30 minuten op ijs om de wormen door de zwaartekracht op de bodem te laten nestelen, terwijl eventueel achtergebleven bacterieel resten van de platen in het supernatant zullen drijven.
3. Verwijder het bovenstaande middel en was de wormen met verse M9.
4. Herhaal de 30 minuten durende zwaartekracht die zich op ijs nestelt.
5. Verwijder de supernatant, voeg M9 toe tot 45 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 250 x g .
6. Breng de pellet over in een microcentrifugebuis en voeg M9 toe tot 1 ml.
7. Draai gedurende 1 minuut met 14.000 tpm op een tafelcentrifuge en verwijder supernatant.
8. Om de cuticula te verstoren, suspendeert u de wormpellet opnieuw met SDS-DTT met (ongeveer) tweemaal het volume van de pellet en incubeert u gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur voor L2-volwassen stadia.
   OPMERKING: Overschrijd de incubatietijd van 4 minuten in SDS-DTT niet, omdat het fluorescerende eiwitsignaal drastisch zal afnemen bij langere SDS-DTT-behandeling. Aangezien de SDS-DTT lichtgevoelig is, mag deze niet ouder zijn dan 3 maanden, omdat de oplossing in de loop van de tijd aan kracht kan hebben ingeboet; Dissociaties werken het beste met een recent voorbereide SDS-DTT-oplossing.
9. Voeg 1x eibuffer (pH 7,3, 335-345 mOsm) toe tot 1 ml om de SDS-DTT-behandeling te stoppen.
10. Draai gedurende 1 minuut met 14.000 tpm op een tafelcentrifuge en verwijder het supernatant.
11. Om de cuticula verder te verstoren en de cellen van de dieren te dissociëren, resuspendeert u de pellet met een pronaseoplossing op kamertemperatuur, waarbij u driemaal het volume van de pellet gebruikt.
12. Incubeer 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
13. Pipet, 40 keer per 5 minuten, op en neer met een P-200 of P-1000 pipet, waarbij u de bodem van de buis aanraakt met de pipetpunt.
    OPMERKING: De druk die wordt gecreëerd doordat de punt de bodem van de buis raakt, vergemakkelijkt de ontkoppeling van de worm. Gebruik een filtertip zodat de wormen niet per ongeluk in de pipetschacht terechtkomen tijdens het snel pipetteren.
14. Controleer na 15 minuten de voortgang van de wormdissociatie door voorzichtig 5μL op een glasplaatje te pipetteren en de voortgang te observeren onder een dissectiemicroscoop. Wanneer de meeste (~90%) van de intacte wormen zijn gebarsten, is het proces voltooid.
    OPMERKING: De incubatie van de pronase kan worden verlengd als veel wormen intact blijven.
15. Voeg in een celkweekkap 1x eibuffer tot 1,5 ml toe om de pronasebehandeling te stoppen.
16. Breng over naar FACS-buisjes, voeg 5 ml eierbuffer toe en draai 5 minuten op 800 x g .
17. Verwijder het bovenstaande middel en resuspendeer in 3 ml eibuffer.
18. Plaats een celzeefdop van 70 μm op nieuwe FACS-buisjes, pipetteercelsuspensie op de zeef en draai gedurende 1 minuut op 800 x g . Vang de effluxcelsuspensie op.
19. Plaats een celzeefdop van 5 μm op nieuwe FACS-buisjes, pipetteercelsuspensie op de zeef en draai gedurende 1 minuut op 800 x g .
20. Voeg DAPI toe voor een eindconcentratie van 0,5 μg/ml in eierbuffer, plaats op ijs met een deksel/deksel ter bescherming tegen licht.
21. Voer FACS zo snel mogelijk uit. Het fluorescerende eiwitsignaal neemt af met de tijd en de blootstelling aan licht, daarom is het belangrijk om het dissociatieprotocol zo snel mogelijk uit te voeren en FACS uit te voeren onmiddellijk nadat de dissociatie is voltooid.
    OPMERKING: Het protocol voor wormdissociatie is aangepast van protocollen van het Miller-lab ^55,56,57, het Murphy-lab⁵⁸ en het Shaham-lab⁵⁹.

10. Aanpassingen in de werking van de FACS-machine voor de identificatie van C. elegans-neuronen

1. Gebruik 4 liter gekoelde (4 °C) eierbuffer in plaats van standaard omhulselvloeistof bij het sorteren van C. elegans-neuronen .
   OPMERKING: De osmolariteit van C. elegans-cellen is veel hoger dan die van zoogdiercellen en standaard omhulselvloeistof zal de neuronen doen barsten. Alle machine-instellingen en kalibraties worden uitgevoerd nadat de eibuffer is toegevoegd, omdat de viscositeit van de eibuffer anders is dan die van standaard omhulselvloeistof. De sorteertechnicus zal de diagnostische kralen door de machine halen om er zeker van te zijn dat de lasers goed werken.
2. Wanneer gesorteerde neuronen moeten worden gebruikt in volgende transcriptomics-onderzoeken, sorteer dan minimaal 100.000 GFP+-cellen rechtstreeks in 800 μL Trizol-LS + 10 μL RNase-remmer.
3. Keer de cellen 15 keer om in Trizol om te mengen.
4. Vries snel in in een droogijs-/ethanolbad en bewaar bij -80 °C tot het klaar is om RNA uit alle monsters te extraheren voor één RNA-sequencing-experiment.
   OPMERKING: Hoewel de meeste gesorteerde cellen rechtstreeks in Trizol worden verzameld voor transcriptoomanalyse, moet u ervoor zorgen dat u een klein monster van GFP+ gesorteerde cellen (van elke stam) ophaalt die in de eierbuffer zijn verzameld, voor microscopievalidatie van de efficiëntie van het sorteren.

11. FACS poortstrategie

1. Gebruik voor het identificeren van een positief GFP-signaal de 488 nm-laser met het 530/30-filter en 502 long pass (LP).
2. Gebruik voor het identificeren van DAPI-positieve en -negatieve cellen de 405 nm-laser met het 450/50-filter.
3. Voor het identificeren van autofluorescerende cellen die kunnen worden aangezien voor GFP-positieve cellen, gebruikt u de 488 nm-laser met het 610/20-filter en 595 LP (persoonlijke communicatie, Stanka Semova, Operations Manager, Flow Cytometry Resource Center, Rockefeller University).
4. Voer een standaard poortstrategie uit en verwijder gebeurtenissen met een groot zijverstrooiingsgebied (SSC-A) en een klein voorwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A), die waarschijnlijk klompen cellen en puin vertegenwoordigen.
5. Isoleer voorwoord scatter singlets en vervolgens zijwaartse scatter singlets.
6. Isoleer cellen met een hoog GFP-signaal en een laag autofluorescentiesignaal.
   OPMERKING: Cellen met een hoge mate van autofluorescentie en een lagere waarde in de GFP zijn geen echte GFP-positieve cellen.
7. De drempel voor de GFP+-poort wordt bepaald door GFP-cellen (d.w.z. N2) te vergelijken met GFP+-cellen^55,56.
8. Verwijder alle dode cellen met een levende/dode poort, op basis van de selectieve permeabiliteit van DAPI voor dode cellen: De drempel voor levende dode poort wordt bepaald door ongekleurde cellen te vergelijken met met DAPI-gekleurde cellen.
   NOTITIE: Wanneer u meerdere monsters sorteert, spoelt u de stroom tussen de monsters door om er zeker van te zijn dat er geen kruisbesmetting is.

12. Microscopie van gesorteerde neuronen om de efficiëntie van de FACS-poortstrategie te valideren

1. Teken een cirkel op een glazen microscoopglaasje met een vloeistofafstotende pen.
2. Pipetteer 10 μL gesorteerde cellensuspensie in eibuffer in de cirkel. Plaats een dekglaasje over het monster en sluit af met nagellak rond de omtrek van het dekglaasje.
3. Nadat de nagellak is opgedroogd, controleer je onder een rechtopstaande/omgekeerde fluorescentiemicroscoop of de gesorteerde cellen inderdaad voornamelijk GFP+ cellen zijn.
   OPMERKING: Voer deze controle na elke sorteersessie uit om de FACS-poortstrategie⁵⁷ te valideren.

13. RNA-extractie en kwantificering van de RNA-kwaliteit op een geautomatiseerd elektroforesesysteem voor kwaliteitscontrole

OPMERKING: Al het RNA-werk moet met uiterste zorg worden uitgevoerd om besmetting met RNase te voorkomen (inclusief zorgvuldige voorbereiding van reagentia, verbruiksartikelen en de beste RNase-veilige praktijken).

OPMERKING: Voer alle stappen uit waarbij monsters fenol en/of chloroform bevatten in een zuurkast.

1. Ontdooi flesjes met cellen in Trizol bij kamertemperatuur.
2. Gebruik een filtertip P200 pipetpunt en pipetteer meerdere keren op en neer om het monster te homogeniseren.
3. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg 0,2 ml chloroform toe per 1 ml Trizol-reagens dat voor de lysis wordt gebruikt en sluit de buis vervolgens goed af.
5. Keer de buizen 15 keer om en incubeer (bij 20-25 °C) gedurende 2-3 minuten.
6. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 g × g bij 4 °C. Het mengsel valt uiteen in een onderste rode fenol-chloroform, een interfase en een kleurloze bovenste waterige fase.
7. Verzamel uitsluitend de bovenste waterige fase die het RNA bevat en breng deze over naar een nieuwe buis met een laag DNA/RNA-bindingsgehalte van 1,5 ml.
   OPMERKING: In sommige gevallen, als de verhouding van cellen in de eibuffer die uit de celsorteerder in Trizol zijn gevallen groter is dan een 1:3 monster:Trizol-LS-verhouding, kan het hoge zoutgehalte van de eibuffer ervoor zorgen dat de lagen worden omgekeerd; als dit gebeurt, voeg dan meer Trizol-LS toe en herhaal de inversie en centrifugatie. Dit kan ook worden vermeden als u na het sorteren rekening houdt met de toename van het monstervolume; als de verhouding van 1:3 niet wordt aangehouden, voeg dan voldoende trizol toe voordat u met de RNA-extractie begint.
8. Om het RNA verder te zuiveren, wordt de chemie van de RNA-extractiekolom gebruikt.
9. Gebruik het geautomatiseerde elektroforesesysteem voor kwaliteitscontrole om het RNA-integriteitsnummer (RIN) te meten en RNA-RIN van 8,0 of hoger te bevestigen voor invoer in volgende RNA-sequencing-experimenten.

Resultaten

Nematodenmodel van excitotoxiciteit en identificatie van gevacuoliseerde degenererende neuronen
De hier getoonde gegevens zijn overgenomen uit eerdere publicaties^37,38. Om excitotoxische geïnduceerde neurodegeneratie na te bootsen, wordt een knock-out van het glutamaattransportgen (glt-3) gecombineerd met een neuronale sensibiliserende transgene achtergrond (nuls5 ...

Discussie

Hoewel de heersende controverses en mislukkingen suggereren dat excitotoxiciteit een uitzonderlijk moeilijk te ontcijferen proces is, biedt de analyse van excitotoxiciteit in de nematode een bijzonder aantrekkelijke strategie om geconserveerde neuronale celdoodroutes in deze kritieke vorm van neurodegeneratie te verlichten. De onderzoeker kan vertrouwen op de rijke verzameling onderzoeksinstrumenten die in dit systeem beschikbaar zijn, en in het bijzonder op de transparantie van het dier...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	VWR	AAA10752-0E
Bactopepton	VWR	90000-264
BD FACSAriaIII	BD
Bleekmiddel	Elk huishouden
CaCl2	VWR	97062-586
CaCl2·2H2O	BioExpress	0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70um	PluriSelect	43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5um	PluriSelect	43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC	Fisher Sci	75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424	VWR	MP022629891
Chloroform	VWR	97064-680
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
DAPI	Fisher Sci	EN62248
Droge ijs	United City Ice Cube
DTT	VWR	97061-340
E. coli OP50	CGC	OP50
Ethanol (100%)	VWR	EM-EX0276-1S
Ethanol (90%)	VWR	BDH1160-4LP
FACS buizen	USA Sci	1450-2810
Filter tips	USA Sci	1126-7810
Glas 10 mL serologische pipetten	USA Sci	1071-0810
Verwarmingsblok	BioExpress	D-2250
Hepes	VWR	97061-824
Immersieolie - Carl Zeiss Immersol	Fisher Sci	12-624-66A
Isopropanol	VWR	EM-PX1830-4
KCl	VWR	BDH9258-2.5KG
KH2PO4	VWR	BDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL buizen	USA Sci	4043-1021
Metamorph Imaging Software	Molecular Devices
MgCl2	VWR	97063-152
MgCl2·6H2O	BioExpress	0288-500g
MgSO4	VWR	97061-438
Microscoop, confocal, voor fluorescentiebeeldvorming	Zeiss	LSM 880
Microscoop, invers, voor fluorescentiebeeldvorming	Zeiss	Axiovert 200 M
Microscoop  Camera	Q-Imaging	Retiga R1
Microscoop lichtbron voor fluorescentiebeeldvorming	Lumencor	SOLA SE Light Engine
Microscoop, Nomarski DIC	Zeiss	Axiovert Observer A1
Microscoop, Nomarski DIC	Nikon	Eclipse Ti-S
Na2HPO4	VWR	97061-588
NaCl	VWR	BDH9286-2.5KG
NaOH	VWR	97064-476
Petrischalen, 100mm	Fisher Sci	FB0875712
Petrischalen, 60mm	TriTech	T3308
Pipet Controller	TEquipment	P2002
Pipettor P10 Tips	USA Sci	1110-3000
Pipettor P1000 Tips	USA Sci	1111-2020
Pipettor P200 Tips	USA Sci	1110-1000
Pronase	Sigma	P8811-1G
RNAse weg spray	Fisher Sci	7000TS1
RNAse-vrije serologische pipetten	USA Sci	1071-0810
RNAse-vrije 50 mL buizen	USA Sci	5622-7261
RNeasy micro	Qiagen	74004
SDS	VWR	97064-496
Streptomycinesulfaat	Sigma	S6501-100G
Sucrose	VWR	AAJ63662-AP
SUPERase·in RNase-remmer	Fisher Sci	AM2694
Automatisch elektroforesesysteem voor kwaliteitscontrole: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5581
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer	Agilent	5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexer	Agilent/IKA	4674100
Tapestation - IKA vortexeradapter op 2000 rpm	Agilent/IKA	3428000
Tapestation - Laadtips	Agilent	5067- 5152 of 5067- 5153
Tapestation - Optische dop 8x strip	Agilent	401425
Tapestation - Optische buis 8x strip	Agilent	401428
Automatisch elektroforesesysteem voor kwaliteitscontrole: TapeStation 2200	Agilent	G2964AA
Tetramisole	Sigma	L9756-10G
Tris base	Fisher Sci	BP152-500
Tris hydrochloride	Fisher Sci	BP153-500
Trizol-LS	Fisher Sci