Methodenartikel

Cardiale Sferoïden als in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61962

⸱

23 januari 2021

 , 
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is bedoeld om 3D-hartsferoïden (CS'en) te fabriceren door cellen in hangende druppels te co-culturing. Collageen-ingebedde ES's worden behandeld met doxorubicine (DOX, een cardiotoxisch middel) bij fysiologische concentraties om hartfalen te modelleren. In vitro testen met dox-behandelde ES's kunnen worden gebruikt om nieuwe therapieën voor patiënten met hartfalen te identificeren.

Samenvatting

Ondanks verschillende vooruitgang in de cardiale weefsel engineering, een van de belangrijkste uitdagingen te overwinnen blijft de generatie van een volledig functioneel vasculair netwerk bestaande uit verschillende niveaus van complexiteit om zuurstof en voedingsstoffen te leveren in bio-engineered hartweefsels. Ons laboratorium heeft een driedimensionaal in vitro model van het menselijk hart ontwikkeld, bekend als de "cardiale sferoïde" of "CS". Dit presenteert biochemische, fysiologische en farmacologische kenmerken die kenmerkend zijn voor het menselijk hart en wordt gegenereerd door co-culturing zijn drie belangrijke celtypes, zoals cardiale myocyten, endotheelcellen, en fibroblasten. Door menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs of iCMs) worden mede gekweekt met verhoudingen die de in vivo gevonden met menselijke hartfibroblasten (HCF's) en menselijke kransslagader endotheelcellen (HCAECs) gedurende drie tot vier dagen in hangende valcultuurplaten benaderen. De confocale analyse van CSs bevlekt met antilichamen tegen cardiale Troponin T, CD31 en vimentin (markers voor cardiale myocyten, endotheelcellen en fibroblasten, respectievelijk) toont aan dat CSs presenteren een complex endothelial cell netwerk, lijkt op de inheemse gevonden in het menselijk hart. Dit wordt bevestigd door de 3D rendering analyse van deze confocale beelden. CSs ook presenteren extracellulaire matrix (ECM) eiwitten typisch voor het menselijk hart, zoals collageen type IV, laminine en fibronectine. Ten slotte presenteren CS'en een contractielactiviteit die wordt gemeten als syncyle contractiliteit die dichter bij het typische van het menselijk hart ligt in vergelijking met CS'en die alleen iC's bevatten. Wanneer behandeld met een cardiotoxisch anti-kankermiddel, zoals doxorubicine (DOX, gebruikt voor de behandeling van leukemie, lymfoom en borstkanker), wordt de levensvatbaarheid van DOX-behandelde CSs aanzienlijk verminderd bij 10 μM genetische en chemische remming van enotheliale stikstofmonoxide synthase, een downstream doelwit van DOX in HCF's en HCAECs, verminderde de toxiciteit in CSs. Gezien deze unieke kenmerken, worden CS's momenteel gebruikt als in vitro modellen om hartbiochemie, pathofysiologie en farmacologie te bestuderen.

Inleiding

Het menselijk hart heeft een beperkte regeneratieve capaciteit, terwijl hart- en vaatziekten (CVD) blijft de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd, ondanks de recente vooruitgang in weefsel engineering en stamcel technologieën1. De behoefte aan nieuwe therapieën, waaronder moleculaire en cellulaire benaderingen om ofwel een beschadigd hart te herstellen of om te voorkomen dat een hart uitvalt, is een van de belangrijkste huidige klinische behoeften voor patiënten die lijden aan hart- en vaatziekten2,3,4. Het belangrijkste doel van cardiale weefsel engineering is het fabriceren van een driedimensionaal (3D) hartweefsel dat moleculaire, cellulaire en extracellulaire kenmerken die kenmerkend zijn voor een menselijk hart, met inbegrip van de vasculaire netwerk en fysiologische contractiel functie4,5,6presenteert .

Om een functioneel menselijk hartweefsel te bio-engineeren en te fabriceren dat het menselijk hart nabootst voor in vitro en in vivo toepassingen, zijn verschillende benaderingen onderzocht, waaronder gemanipuleerde hartweefsels (EHT's), celbladen en sferoïde culturen7,8. Deze weefsels slagen er echter niet in om de optimale 3D-micro-omgeving die kenmerkend is voor het menselijk hart samen te vatten en het potentiële gebruik ervan voor CVD-patiënten kan niet direct vertalen van de bank naar het bed7. Dit komt omdat ze niet recapituleren de complexe biologie, morfologie, en fysiologie van in vivo hartweefsels9. Een van de grootste uitdagingen in de hartweefseltechniek omvat de ontwikkeling van een hiërarchisch vasculair netwerk binnen het bio-engineered cardiale weefsel, omdat elk weefsel dat groter is dan 200 μm in diameter celdood ontwikkelt in het middenvan 2,10. Een goed gevormd vasculair netwerk in een menselijk hartweefsel speelt een belangrijke rol voor de toevoer van bloed, zuurstof en voedingsstoffen naar hartcellen11. Tijdens de embryonale ontwikkeling vormen zich coronaire haarvaten en slagaders via vasculogenese (de novo-bloedvatvorming) en angiogenese (generatie van bloedvaten uit reeds bestaande) uit endotheelverercellen8,12. Cardiale fibroblasten spelen ook een belangrijke rol in een goede vasculaire netwerkvorming door het verstrekken van de optimale extracellulaire matrix (ECM) en groeisamenstelling13,14.

Het 3D vasculaire netwerk van bio-engineered hartweefsels regelt de overleving en functie van cellen door zuurstof- en voedingsgradiënten en paracrinesignalering te creëren, zoals homotypische celinteractie, heteropische celinteractie, interactie van cellen via uitgescheiden oplosbare eiwitten en cel-naar-ECM-interacties3,10,15,16,17,18. Dit voorkomt celdood in het midden van het weefsel en bevordert de levensvatbaarheid van de cel en de fysiologische functie in bio-engineered hartweefsels16,18,19.

Sferoïde culturen uit stamcellen zijn onlangs onderzocht als in vitro modellen van het menselijk hart20. Om de cardiale micro-omgeving in vitro verder te verbeteren, hebben ze het gebruik van alle belangrijkste celtypen in het menselijk hart opgenomen, zoals hartpatocyten, endotheelcellen en fibroblasten. Sferoïde culturen presenteren de vereiste 3D structurele ondersteuning voor cellen om te groeien en te functioneren en kan worden gebruikt om een vasculair netwerk te bio-engineeren14,20,21,22. In deze context heeft ons laboratorium menselijke cardiale sferoïden (CS'en) ontwikkeld door hart myocyten, endotheelcellen en fibroblasten bij ratio's gevonden in het menselijk hart14te co-culturing. Dit model is een uitbreiding van de rat ventriculaire hartcellen sferoïde model, gegenereerd door co-culturing hartcellen in opknoping druppel culturen, gebruikt om cardiale fibrosemodel 21. Menselijke ES's kunnen worden gebruikt als toxiciteitstesten door ze doxorubicine te behandelen (DOX, een anti-kankermiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van leukemie, lymfoom en borstkanker), waarvan bekend is dat ze hartfibrose en hartfalen (HF) veroorzaken, zelfs 17 jaar na het somministration14.

In dit manuscript beschrijven we hoe menselijke CS'en te genereren door menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs of iCMs), menselijke hartfiblasten (HCF's) en menselijke kransslagader endootheliale cellen (HCAECs) in opknoping drop culturen. Om CS'en te gebruiken en te beelden voor in vitro testen, zijn ze ingebed in een collageengel. De confocale analyse van CS'en bevlekt met antilichamen tegen CD31, een marker voor endotheelcellen, toonde aan dat deze cellen een netwerk vormen dat vergelijkbaar is met het in vivo waargenomen netwerk. Om HF te induceren en mogelijk nieuwe agentia te testen die het kunnen behandelen of te voorkomen, werden CS'en behandeld met 10 μM DOX (een concentratie gevonden in de bloedbaan van kankerpatiënten die het medicijn kregen). Wanneer bevlekt met calcein-AM en ethidium homodimeer (kleuring van levende en dode cellen, respectievelijk), DOX-behandelde ED's presenteren een aanzienlijke afname van de levensvatbaarheid in vergelijking met CS'en die niet ontvangen van het geneesmiddel. CS'en presenteren ook een homogene contractielactiviteit wanneer deze wordt gebruikt door middel van veldpotentieelstimulatie tussen 1 en 3 Hz.

Protocol

LET OP: hiPSC-CMs die voor dit protocol worden gebruikt, zijn commercieel beschikbaar. Gelieve de goedkeuring van de instellingscommissie voor de menselijke ethiek te vragen voordat u dit werk begint indien nodig.

1. Menselijke cardiale fibroblast en endotheelcelcultuur beplating en groei

  1. Dooi cryovials met HCFs en HCAECs in een waterbad bij 37 °C gedurende een minuut.
  2. Beweeg cryovials onder een steriele laminaire stroom bioveiligheid kast klasse 2.
  3. Verzamel 1 mL celsuspensie uit de cryovials met behulp van een 1000 μL pipettip en voeg toe in een 15 mL buis met 7 mL Human Cardiac Fibroblast Medium voor HCFs en 7 mL Human Meso Endo Growth Medium voor HCAECs.
    OPMERKING: Om de meerderheid van de cellen uit elke cryovial te verzamelen, spoel ze twee keer met 1 mL cultuurmedium uit dezelfde 15 mL buis.
  4. Meng voorzichtig celsuspensies.
  5. Breng celsuspensies over om T75-kweekkolven te scheiden met behulp van een serologische pipet van 10 mL.
  6. Incubeercellen bij 37 °C met 5% CO2.
  7. Na 18 uur, aspirate het medium uit beide kweekkolven en spoel ze een keer met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om bevriezing medium en dode cellen te verwijderen.
  8. Vervang PBS door 7 mL van geschikt kweekmedium aan elke cultuurkolf en incubate bij 37 °C.
  9. Onderzoek cellulaire expansie en levensvatbaarheid regelmatig en vervang media om de andere dag totdat cellen bereiken 80-90% samenvloeiing.

2. iCM cultuurbeplating en groei

  1. Precoat twee T25-kweekkolven met 2 mL PBS met 40 μg/mL fibronectin (FN) en incubate bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 4 uur.
  2. Verzamel na 4 uur een cryovial met iCM's en plaats deze gedurende 4 minuten in een waterbad bij 37 °C.
  3. Verplaats de cryovial onder een steriele laminaire stroom bioveiligheid kast klasse 2.
  4. Breng de iCMs voorzichtig over van de cryovial naar een steriele 50 mL centrifugebuis met behulp van een 1 mL pipetpunt.
  5. Spoel de lege iCMs cryovial met 1 mL kamertemperatuur beplating medium om eventuele resterende cellen terug te vorderen. Breng de 1 mL beplating medium spoeling van de cryoviale druppel-wijs meer dan 90 sec naar de 50 mL centrifuge buis met de iCM cel suspensie.
    OPMERKING: Draai de buis voorzichtig terwijl u het medium toevoegt om de oplossing volledig te mengen en de osmotische schok op de ontdooide cellen te verminderen.
  6. Voeg langzaam 8 mL kamertemperatuur Plating Medium toe aan de 50 mL centrifugebuis. Voeg de eerste 1 mL dropwise toe boven de 30 - 60 s. Voeg vervolgens het resterende volume toe in de volgende 30 s. Draai de centrifugebuis voorzichtig aan terwijl u het beplatingsmedium toevoegt. Meng voorzichtig de inhoud van de 50 mL centrifugebuis door 2 - 3 keer om te keren (het vermijden van krachtig schudden of vortexen).
  7. Voer onmiddellijk het tellen van de cel uit met behulp van een hemocytometer en bepaal de levensvatbare celdichtheid (in cellen/mL).
  8. Neem de FN-voorgecoate T25 kolven en aspirate de FN-PBS oplossing zonder de kolven te laten drogen. Voeg hierbij het zaaivolume van iCMs toe (1,6 x10 6 levensvatbare iCMs in 8 mL kamertemperatuur beplatingsmedium).
  9. Cultuur iCMs in de incubator voor 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  10. Ontdooi het Onderhoudsmedium 's nachts bij 4 °C een dag voor gebruik.
  11. Equilibrate het Onderhoudsmedium in een 37 °C waterbad en gebruik onmiddellijk.
  12. Verplaats na 2 dagen de iCM's T25-kolven onder de bioveiligheidskast.
  13. Spoel dode cellen en puin voorzichtig af door het Plating Medium 5 keer op en neer te pipetten.
  14. Aspirate de Plating Medium en vervangen door de 8 mL van voorverwarmd Onderhoudsmedium. Plaats de T25 kolven terug in de couveuse. Vervang het Onderhoudsmedium om de andere dag en bekijk de samenvloeiing regelmatig.

3. Celisolatie en -telling

  1. Begin met het verzamelen van eerste HCAECs en HCF's, en vervolgens iCMs door het volgen van stap 3.2-3.12.
  2. Bereid cs-kweekmedium voor door 10 mL iCMs Maintenance Medium, 5 mL Human Cardiac Fibroblast Medium en 5 mL meso Endo Growth Medium te mengen.
  3. Verwijder kweekmedium uit elke weefselkolf met HCF's en HCAECs en spoel één keer af met 5 mL PBS voor T75-kolven. Verwijder PBS.
  4. Voeg 5 mL van 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe aan elke T75-kolf en incubbate gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
  5. Zodra cellen loskomen, neutraliseer onmiddellijk de trypsine EDTA-oplossing met 5 mL cultuurmedium.
  6. Breng celsuspensies over naar een buis van 15 mL en centrifugecellen op 300 x g gedurende 4 minuten.
  7. Verwijder de supernatant voorzichtig uit elke buis. Voeg 1 mL CS medium toe aan elke celpellet en maak ze opnieuw op. Houd de buis op ijs en tel cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer.
  8. Verwijder Maintenance Medium uit weefselkolven met iCM's en spoel één keer af met 3 mL PBS.
  9. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe aan elke T75-kolf en incubeer bij 37 °C, 5% CO2. Controleer cellen elke minuut tot los.
  10. Zodra cellen loskomen, neutraliseer onmiddellijk de trypsine EDTA-oplossing met 4 mL cultuurmedium.
  11. Breng celsuspensies over naar een buis van 15 mL en vercentrifugeer ze op 300 x g gedurende 5 minuten.
  12. Verwijder de supernatant voorzichtig uit elke buis. Voeg 1 mL kweekmedium toe aan de celpellet en verhoog het opnieuw. Houd de buis op ijs en tel cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer.

4.CS generatie en groei

  1. Mix iCMs, HCFS en HCAECs in 2:1:1 ratio door 10.000 iCMs, 5.000 HCF's en 5.000 HCAECs per hanging drop cultuur met 20 μL CS medium te beplating. Pas aan het uiteindelijke volume voor het totale aantal CS'en.
  2. Pipette 20 μL celsuspensie in elke put van de 384 put HDC plaat handmatig of met behulp van een robotische multichannel pipet voor geautomatiseerde vloeistofbehandeling.
  3. Pipette 1,5 mL steriele PBS aan weerszijden van het kanaal rond de Hanging Drop Plate om uitdroging van CS'en te voorkomen. Incubate HDC-plaat bij 37 °C.
  4. Bestudeer de vorming van IG's op een dagelijkse basis totdat een volledig gevormde sferoïde wordt waargenomen in de meerderheid van de putten. Voeg om de dag 7,5 μL CS-medium toe aan elke put totdat een CS wordt gevormd.

5.CS inbedding in collageengels

  1. Verzamel CS'en met een pipettip van 1 mL.
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om de punt van pipet ongeveer 0,2 cm van de rand te snijden voordat het wordt gebruikt met een steriel scherp oppervlak (ofwel een scalpel of een schaar) om schade te voorkomen gel ingebed sferoïden tijdens hun collectie.
  2. Verzamel de CS-suspensie in een buis van 50 mL op ijs.
  3. Centrifuge de buis op 300 x g gedurende 5 minuten.
    LET OP: de verkregen pellet moet tot het gebruik op ijs worden gehouden.
  4. Bereid een collageengeloplossing (100 μL/put voor 30 putten van 96 putplaat) op ijs met behulp van rat staart collageen en CS medium in een 3:7 verhouding.
  5. Verwijder de supernatant uit de buis met CS'en.
  6. Meng de pelleted CS'en in de collageengeloplossing.
  7. Voeg 1 μL/mL natriumhydroxide van 5 mM toe aan de CS-collageen gel suspensie en meng voorzichtig.
  8. Breng 100 μL CS-collageengel over naar een heldere platte bodem 96 goed zwarte polystyreenmicroplaat en incubaat bij 37 °C gedurende 30 minuten.

6. Levensvatbaarheids- en toxiciteitsmetingen van met DOX behandelde ED's

  1. Na 30 min verzamel je de 96 putplaat uit de couveuse
  2. Bereid een 10 μM DOX voor (gebaseerd op eerder vastgesteld protocol voor celdood in CSs14).
    OPMERKING: Om mogelijk andere agenten te testen die zich kunnen beschermen tegen HF in CS's, genereert u oplossingen die DOX + Agent A, B, enz.
  3. Voeg 100 μL aan oplossingen toe die DOX en/of andere middelen bevatten aan elke put. Controleculturen bevatten media zonder DOX.
  4. Incubate plaat voor 18 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  5. Op de volgende dag, het verzamelen van de Live / Dead kleuring reagens voorraad oplossingen en laat ze ontdooien op ijs in het donker in een biosafety kabinet.
  6. Bereid een oplossing voor met Hoechst-vlek, 4 μM ethidiumhodimer en 2 μM calcein-AM.
  7. Voeg 100 μL Hoechst-vlek, calcein-AM/ethidium homodimeeroplossing toe aan elke put.
  8. Meet de fluorescentie in elke put op 645 nm voor ethidium homodimeer en op 530 nm voor calcein-AM, respectievelijk met behulp van multimode microplate reader.
  9. Breng fluorescentiemetingen over naar Graphpad PRISM (of een gelijkwaardige software voor statistische analyse).
  10. Gebruik GraphPad Prism-software voor gegevensanalyse en statistieken.
  11. Controleer voor kwaliteitscontrole onder een epifluorescentiemicroscoop naar de nuclei-kleuring, samen met calcein-AM en ethidiumhomodimer.

7.CS contractielfunctieevaluatie

  1. Verzamel de microplaat zoals voorbereid in stap 5.8.
  2. Schakel de computer met de IonOptix-software in voor een videogebaseerde randdetectie, de Fluorescentie assistance interface en de MyoPacer Field Stimulator.
  3. Plaats een nieuwe afdeksel op het weefselhouderplatform en monteer het waterbad met elektroden.
  4. Verzamel voorzichtig 1S'en van collageengels met behulp van een 1 mL pipetpunt die 0,5 mm van de rand wordt gesneden en breng ze over naar een valkenbuis. Voeg media toe aan CS om het drogen van CS'en te voorkomen. Transfer CS (één voor één) met een paar μL media op het stadium van het IonOptix-systeem.
  5. Selecteer de CS die moet worden geanalyseerd via het instellen van pieken aan de linker- en rechterkant van CS met behulp van de IonOptix-software.
  6. Gebruik de computergebaseerde bewegingsanalyseer om de beweging van CS-randen bij te houden.
    OPMERKING: Normaal gesproken wordt contractiliteit gemeten in % celverkorting of % fractionele verkorting. In dit geval hebben we gemeten % sferoïde verkorting.
  7. Stabiliseer zowel de pieken die drempel- als randopties van de computer aanpassen.
  8. Stel CS's bloot aan verschillende frequenties (0,3, 0,6, 1, 2 en 3 Hz) en spanningen (1, 2, 3 en 5 V) met behulp van de Myopacer Field Stimulator.
  9. Record sferoïde verkorting als CS lengte veranderingen van DOX-behandelde en onbehandelde CS's. Analyseer gegevens met behulp van de Soft-Edge software en gemiddeld voor elke CS.

8. Microscopie van CS'en: fixatie en immunolabeling

  1. Verzamel de 96 put plaat na 30 min (zoals voorbereid in stap 5.8) en fix CSs in 4% paraformaldehyde (PFA) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder PFA en spoel drie keer met PBS met 0,01% natriumazaide (PBSA).
  3. Verwijder PBSA.
  4. Voeg 200 μL PBSA met 0,02% Triton-X-100 toe aan elke put gedurende 30 minuten op een shaker.
    LET OP: Deze stap permeabiliseert CS'en voor een betere antilichaaminfiltratie.
  5. Voeg 200 μL van 3% runderserum albumine toe in PBSA-oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
    LET OP: Deze stap blokkeert niet-specifieke antilichaambinding in CS'en.
  6. Bereid een oplossing voor die 10 μg/mL primaire muisanti-menselijke antilichamen bevat tegen CD31 verdund in blokkeringsoplossing.
  7. Voeg 100 μL primaire antilichaamoplossing toe aan elke put en broed 's nachts bij 4 °C op een shaker.
  8. Spoel de plaat drie keer af met PBSA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een schommelplaat.
  9. Bereid een oplossing voor die Hoechst DNA-vlek en 10 μg/mL cy3-geconjugeerd secundaire ezelantimuisantilichaam bevat verdund in blokkeringsoplossing.
  10. Voeg 100 μL secundaire antilichaamoplossing met Hoechst-vlek toe aan elke put en broed 's nachts bij 4 °C op een shaker.
    LET OP: Bedek de plaat vanaf dit punt met aluminiumfolie.
  11. Spoel de plaat drie keer gedurende 20 minuten met PBSA op kamertemperatuur op een schommelplaat.
  12. Voeg 100 μL Vectashield montagemedium toe aan elke put.
  13. Beeld CSs onder een laser scanning confocale microscoop. Voer optische secties uit langs de Z-as en vouw beelden samen tot één brandpuntsvlak met ImageJ-software.

Resultaten

Het in dit manuscript beschreven protocol vertegenwoordigt een alternatieve benadering om complexe cardiale endotheelcelnetwerk te ontwikkelen binnen een bio-engineered cardiale weefsel met verbeterde cel levensvatbaarheid en functie in vergelijking met bestaande modellen (Figuur 1). De recapitulatie van de 3D in vivo hartmicro-omgeving binnen CS's bevorderde hun reactie op DOX bij de concentratie in de bloedbaan van kankerpatiënten (tussen 5 en 10 μM, figuur 2). DOX behandelde BESTURINGSSYSTEMen presenteerden een statistisch significante vermindering van de levensvatbaarheid van de cel in vergelijking met controle (geen DOX) CS'en binnen 24 uur(figuur 2), een toxisch effect dat wordt waargenomen bij menselijke kankerpatiënten zelfs 17 jaar na hun behandeling met het medicijn.

figure-results-1
Figuur 1. CS-vorming en vasculaire analyse. a) Protocol met de stappen voor de vorming van een CS uit de co-cultuur van iCM's, HCAECs en HCF's in hangende druppels. Brightfield beelden aan de rechterkant tonen de progressieve sferoïde vorming van enkele cellen in opknoping druppels. (B) Ingestorte Z-stapels confocale beelden van een CS bevlekt met antilichamen tegen cardiale Troponin T (cTNT), PECAM en vimentine, vlekken op hart myocyten, endotheelcellen en fibroblasten, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Levensvatbaarheid en toxiciteit in CS'en. Statistische analyses van calceine-AM (A) en ethidium homodimer(B)fluorescentie van CS'en die alleen in aanwezigheid van beide media (DOX 0 μM) of doxorubicine (10 μM) worden behandeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Ontwikkelingselke, juiste vasculaire netwerkvorming is van cruciaal belang voor de generatie van functionele weefsels, waaronder het menselijk hart10,12,23,24,25,26. Aandacht voor de juiste vascularisatie van 3D-weefsels maakt de uitwisseling van zuurstof, groeifactoren, signaalmoleculen en voedingsstoffen mogelijk, waardoor de ontwikkeling van celnecrose in een weefsel dat dikker is dan 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Momenteel beschikbaar in vitro 3D hart modellen die een vasculair netwerk presenteren zijn voornamelijk presenteren capillaire-sized, ongeorganiseerde vasculaire netwerken en het ontbreken van de hiërarchische complexe vertakking vascularisatie waargenomen in vivo6,8,29. De alternatieve aanpak voor de ontwikkeling van een complex cardiale endotheelcelnetwerk zoals beschreven in dit manuscript presenteert een verbeterde levensvatbaarheid en functie van cellen in vergelijking met bestaande modellen (figuur 1)14,22. 3D in vitro CSs model het menselijk hart door zijn in vivo micro-omgeving beter samen te vatten, inclusief de moleculaire, cellulaire en extracellulaire componenten14,22. CS generatie van stamcel-afgeleide cellen in de opknoping druppels kunnen hun culturen in bepaalde omstandigheden (bijvoorbeeld, celtypes en verhouding, juiste weefselvorming). Co-culturen van iCMs samen met HCFs en HCAECs binnen CS's definiëren de moleculaire en cellulaire crosstalk die de hartpathologie reguleert, inclusief de contractiele functie en de reactie op geneesmiddelen bij concentraties gevonden in de bloedbaan van de patiënt14. Vanwege deze unieke kenmerken, zijn CS's gebruikt om cardiale fibrose model, een ernstig gevolg van hartinfarct en hartfalen21. Onze eerdere studies toonden aan hoe de aanwezigheid van zowel endotheelcellen als fibroblasten van cruciaal belang is voor de recapitulatie van de vasculaire micro-omgeving in het menselijk hart, waardoor de optimale afzetting van fibroblast-afgeleide ECM-eiwitten mogelijk is, zoals laminine, fiectine en collageen type IV, gelokaliseerd in de nabijheid van een zich ontwikkelend endothelial cell network14,21.

DOX is een bekend cardiotoxisch medicijn dat hartfalen kan ontwikkelen bij kankerpatiënten, zelfs 17 jaar na hun behandeling30. Toch blijft het een geneesmiddel bij uitstek voor de behandeling van leukemie en lymfoom bij pediatrische patiënten en borstkanker bij vrouwenvan 30. DOX-behandeling in CS'en is vervolgens gebruikt om hartfalen (HF) in vitro te modelleren om zowel de mechanismen te bestuderen die de toxiciteit reguleren in cardiale myocyten, endotheelcellen en fibroblasten14 en om HF-geïnduceerde cardiale fibrose21te modelleren. De levensvatbaarheid van de cellen werd in met DOX behandelde IGS's binnen 24 uur statistisch verminderd bij blootstelling aan het geneesmiddel bij de concentratie die in de bloedbaan van kankerpatiënten werd aangetroffen (tussen 5 en 10 μM)14 (figuur 2). Eerdere studies in ons laboratorium toonden ook de toxische effecten van DOX op zowel cardiale endotheelcellen als fibroblasten via endotheel stikstofmonoxidesynase (eNOS) met behulp van zowel genetische als chemische remmers van dit signaleringstraject14. Het gebruik van genetische (NOS3 shRNA) en chemische (N5-(1-iminoethyl)-L-ornithine, dihydrochloride, of L-NIO) antagonisten van de eNOS signalering traject als een downstream doel van DOX voorkomen dat de toxische effecten in hart-zowel endotheelcellen en fibrolastblasels14.

Contractiele activiteit binnen ED's is ook gemeten dankzij de elektrische koppeling van hartcellen bij blootstelling aan veldpotentieel stimulatie. We ontdekten dat CS's gekweekt met controlemedia (DOX 0 μM) spontaan en homogeen samentrekken met een paksnelheid die kan worden getempodeerd door veldstimulatie binnen 1 en 3 Hz, vergelijkbaar met een gezond menselijk hart. Aan de andere kant volgen met DOX-behandelde IG's de elektrische stimulatie niet omdat ze niet kunnen samentrekken. Samen met de metingen van de levensvatbaarheid van cellen en toxiciteit met behulp van calcein-AM en ethidium homodimer, deze functionele test voor CS contractiel functie kunnen de evaluatie van het complexe scenario typisch voor het menselijk hart in vitro, momenteel niet haalbaar met andere modellen. Vergeleken met contractielactiviteitsmetingen van enkele hartcellen met hetzelfde systeem, zijn we niet in staat om de sarcomere in CS'en te visualiseren en te meten. Daarom zijn we beperkt tot metingen van % sferoïde verkorting in de tijd, een test die we moesten ontwikkelen binnen ons laboratorium. Als we het aantal cellen controleren, co-cultuur we in elk CS en dus de grootte van elk CS, gebruiken we CS's met een vergelijkbare grootte die inderdaad homogene contractiel functie aanwezig. Echter, zelfs in het geval dat we gegenereerdES van verschillende grootte, hun contractiele activiteit niet veranderd.

Het is ook belangrijk om te melden dat de meercellige aard van UMA's maakt ze zwaar genoeg om te lokaliseren aan de onderkant van de coverslip in de Ion-Optix-systeem, zelfs in het geval ze zijn overgemaakt. Op basis van het feit dat CS's alleen in een specifieke positie zitten, hoeven we ze zich niet aan de coverlip te laten houden, integendeel van wat in de meeste laboratoria vaak met enkele hartcellen wordt gedaan.

De microscopische analyse van CS's besmeurd met antilichamen tegen cardiale troponine T, CD31/PECAM en PECAM (als markers voor iCMs, HCAECs en HCF's, respectievelijk) toonde de vorming van een endotheelcelnetwerk(figuur 1, blauw). Om necrose in het binnenste deel van CS'en volledig uit te sluiten, werd in ons laboratorium ruimtelijke evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen uitgevoerd door confocale analyse van calceine-AM/ethidium homodimeer bevlekte CS'en(niet getoonde gegevens). Het is echter belangrijk om te erkennen dat toekomstige ontwikkelingen op het gebied van biofabricage om andere complexe kenmerken die kenmerkend zijn voor het menselijk hart in vivo, momenteel niet beschikbaar in het bestaande model, beter samen te vatten. Deze omvatten: i) contractiele functie typisch voor volwassen cardiomyocyten; ii) doorbloeding en drukkracht; iii) paracrinesignaling; iv) immuunrespons, die van cruciaal belang zal zijn om deze en andere in vitro cardiale modellen te verbeteren6. Aangezien elk ander model tot doel heeft belangrijke kenmerken van een gezond weefsel of een ziektetoestand samen te vatten, is het protocol voor het genereren en gebruiken van CS dat in dit manuscript wordt beschreven, erop gericht de onderzoeker te helpen bij het aanpakken van specifieke vragen, die mogelijk niet uitputtend zijn met behulp van deze aanpak. Zo zou het potentiële gebruik van patiëntcellen voor het genereren van ES's hulpmiddelen bieden voor gepersonaliseerde geneeskunde, momenteel niet beschikbaar met behulp van algemeen beschikbare high-throughput-testen voor cardiovasculair onderzoek.

Tot slot hebben we een eenvoudige manier aangetoond om de menselijke hartmicro-omgeving beter samen te vatten met behulp van hartcellen. Cardiale sferoïden presenteren een endotheelcelnetwerk dat beter het aanwezige in het menselijk hart samenvat in vergelijking met monolaagculturen van hartcellen. Gezien hun unieke eigenschappen, vertegenwoordigen ze geavanceerde tools voor in vitro testen voor cardiovasculair onderzoek. Toekomstige studies met behulp van patiënt-afgeleide cellen kunnen opties bieden voor gepersonaliseerde geneeskunde en nieuwe therapieën om zowel hart-en vaatziekten te voorkomen als beter te behandelen.

Dankbetuigingen

Een speciale dank aan Nat Johnston voor het opnemen en bewerken van de video.

Poonam Sharma werd ondersteund door de Universiteit van Newcastle met UNIPRS en UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) beurzen. Carmine Gentile werd ondersteund door een UTS Seed Funding, katholiek aartsbisdom van Sydney Grant voor Adult Stem Cell Research en een Sydney Medical School Foundation Cardiothoracal Surgery Research Grant.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA1933
Donkey anti-mouse Secondary AntibodiesJackson Immunological Research Labs, Inc.715-165-150Cyanine Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam
DoxorubicinehydrochlorideSigma-AldrichD1515
FibronectineSigma-AldrichF1141-1MGUit rundplasma
Menselijk cardiale fibroblasten (HCF's)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA306AK-05a5x10^5 cellen (volwassen), medium & subculture reagentia
Menselijk coronaire arteriële endotheelcellen (HCAEC's)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA300K-05a5x10^5 cellen (volwassen), medium & subculture reagentia
Menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iCM's)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF-groeimediumCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA316-500
Menselijk MesoEndo-celgroeimediumCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen, Carlsbad, CA, USAL3224
Onderhoudsmedium (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Muis monoklonaal anti-menselijk CD31/PECAMBD Pharmingen, San Diego, CA, USA566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagens (Hoechst 33342)Invitrogen, Carlsbad, CA, USAR37605
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Fosfaat-gebufferd zoutwaterSigma-AldrichD8537
Beplatingsmedium (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
RattenstaartcollageenSigma-AldrichC3867
NatriumazidSigma-AldrichS2002
Trypsine–EDTA, 0,25%Gibco, Thermofisher Scientific25200072
Trypanblauw-oplossing, 0,4%Gibco, Thermofisher Scientific15250061
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
Weefselkweekkolven (T25)Thermofisher Scientific156367
96-wells vlakke heldere bodem zwarte polystyreen TC-behandelde microplatenCorning, New York, USA3603
384-wells Hanging Drop Plate3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USAHDP1385

Referenties

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848(2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25(2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538(2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079(2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23(2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95(2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154(2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005(2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147(2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210(2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394(2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Menselijk hartmodelco cultuurtechniekhanging drop cultuurconfocale microscopiemeting van contractiele activiteitdoxorubicine toxiciteitsassayendotheelcelnetwerkextracellulaire matrixeiwittenisolatie van cardiomyocyten
Cardiale Sferoïden als in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.