Methodenartikel

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze steeds ouder wordende samenleving leidt tot een groeiende incidentie van neurodegeneratieve ziekten. Tot nu toe zijn de pathologische mechanismen onvoldoende begrepen, waardoor de vaststelling van gedefinieerde behandelingen wordt belemmerd. Celgebaseerde additieve gentherapieën voor de verhoogde expressie van een beschermende factor worden beschouwd als een veelbelovende optie om neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), te mediteren. We hebben een methode ontwikkeld voor de stabiele expressie van het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), die wordt gekenmerkt als een neuroprotectief en anti-angiogeen eiwit in het zenuwstelsel, in het genoom van primaire menselijke pigmentepitheelcellen (PE) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Primaire PE-cellen werden geïsoleerd uit menselijke donorogen en in cultuur gehouden. Na het bereiken van confluence werden 1 x 104 cellen gesuspendeerd in 11 μL resuspensiebuffer en gecombineerd met 2 μL van een gezuiverde oplossing met 30 ng hyperactief SB (SB100X) transposaseplasmide en 470 ng PEDF transposonplasmide. Genetische modificatie werd uitgevoerd met een capillair elektroporatiesysteem met behulp van de volgende parameters: twee pulsen met een spanning van 1.100 V en een breedte van 20 ms. Getransfecteerde cellen werden overgebracht in kweekplaten met medium aangevuld met foetaal runderserum; antibiotica en antimycotica werden toegevoegd met de eerste medium uitwisseling. Succesvolle transfectie werd aangetoond in onafhankelijk uitgevoerde experimenten. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) toonde de verhoogde expressie van het PEDF-transgen . PEDF-secretie was significant verhoogd en bleef stabiel, zoals geëvalueerd door immunoblotting en gekwantificeerd door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-gemedieerde overdracht zorgde voor een stabiele PEDF-genintegratie in het genoom van PE-cellen en zorgde voor de continue afscheiding van PEDF, wat van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van een celgebaseerde gentoevoegingstherapie voor de behandeling van AMD of andere retinale degeneratieve ziekten. Bovendien wees analyse van het integratieprofiel van het PEDF-transposon in menselijke PE-cellen op een bijna willekeurige genomische verdeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gevorderde leeftijd wordt beschreven als het belangrijkste risico voor neurodegeneratieve ziekten. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene ziekte die leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen bij patiënten ouder dan 60 jaar, behoort tot de vier meest voorkomende oorzaken van blindheid en slechtziendheid1 en zal naar verwachting toenemen tot 288 miljoen mensen in 20402. Disfuncties van het retinale pigmentepitheel (RPE), een enkele laag dicht opeengepakte cellen tussen de choriocapillaris en de retinale fotoreceptoren, dragen bij aan de pathogenese van AMD. De RPE vervult meerdere taken die essentieel zijn voor een normale retinale functie3 en scheidt een verscheidenheid aan groeifactoren en factoren af die essentieel zijn om de structurele integriteit van het netvlies en de choriocapillaris te behouden, waardoor de overleving van de fotoreceptor wordt ondersteund en een basis wordt gelegd voor de circulatie en de toevoer van voedingsstoffen.

In gezonde ogen is pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) verantwoordelijk voor het balanceren van de effecten van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) en beschermt neuronen tegen apoptose, voorkomt proliferatie van endotheelcellen en stabiliseert het capillaire endotheel. Een verschoven VEGF-pedf-verhouding is gerelateerd aan oculaire neovascularisatie, die werd waargenomen in diermodellen 4,5 en in monsters van patiënten met choroïdale neovascularisatie (CNV) als gevolg van AMD en proliferatieve diabetische retinopathie 6,7,8,9,10 . De verhoogde VEGF-concentratie is het doel voor de huidige standaardbehandeling. De anti-VEGF-geneesmiddelen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept en, meest recent, brolucizumab verbeteren de gezichtsscherpte bij ongeveer een derde van de CNV-patiënten of stabiliseren het gezichtsvermogen in 90% van de gevallen 11,12,13. De frequente, vaak maandelijkse, intravitreale injecties dragen echter het risico op bijwerkingen14, tasten de therapietrouw van de patiënt aan en vormen een aanzienlijke economische last voor de gezondheidszorgstelsels15. Bovendien reageert een bepaald percentage van de patiënten (2%-20%) niet of slechts slecht op de anti-VEGF-therapie 16,17,18,19. Deze negatieve gelijktijdige factoren vereisen de ontwikkeling van alternatieve behandelingen, bijvoorbeeld intraoculaire implantaten, cel- en/of gentherapeutische benaderingen.

Gentherapie is geëvolueerd als veelbelovende behandeling voor erfelijke en niet-erfelijke ziekten en is bedoeld om niet-functionele gensequenties te herstellen of slecht functionerende te onderdrukken. Voor polygene ziekten, waarbij identificatie en vervanging van de oorzakelijke factoren nauwelijks mogelijk is, streven strategieën naar de continue levering van een beschermende factor. In het geval van AMD zijn verschillende additieve therapieën ontwikkeld, zoals de stabiele expressie van endostatine en angiostatine20, de VEGF-antagonist oplosbare fms-achtige tyrosinekinase-1 (sFLT-1)21,22, het complementregulerende eiwitcluster van differentiatie 59 (CD59)23 of PEDF24,25 . Het oog, en vooral het netvlies, is een uitstekend doelwit voor een op genen gebaseerd medicijn vanwege de gesloten structuur, goede toegankelijkheid, kleine omvang en immuunprivilege, waardoor een gelokaliseerde levering van lage therapeutische doses mogelijk is en transplantaties minder vatbaar zijn voor afstoting. Bovendien maakt het oog niet-invasieve monitoring mogelijk en kan het netvlies worden onderzocht met verschillende beeldvormingstechnieken.

Virale vectoren zijn, vanwege hun hoge transductie-efficiëntie, het belangrijkste voertuig om therapeutische genen in doelcellen af te leveren. Afhankelijk van de gebruikte virale vector zijn echter verschillende bijwerkingen beschreven, zoals immuun- en ontstekingsreacties26, mutagene en oncogene effecten27,28 of verspreiding in andere weefsels29. Praktische beperkingen zijn onder meer een beperkte verpakkingsgrootte30 en moeilijkheden en kosten in verband met de productie van partijen31,32 van klinische kwaliteit. Deze nadelen hebben de verdere ontwikkeling bevorderd van niet-virale, op plasmide gebaseerde vectoren die worden overgedragen via lipo-/polyplexen, echografie of elektroporatie. Genomische integratie van het transgen in het gastheergenoom wordt echter meestal niet bevorderd met plasmidevectoren, wat resulteert in een voorbijgaande expressie.

Transposons zijn natuurlijk voorkomende DNA-fragmenten die hun positie in het genoom veranderen, een kenmerk dat is aangenomen voor gentherapie. Dankzij een actief integratiemechanisme zorgen transposon-gebaseerde vectorsystemen voor een continue en constante expressie van het ingebrachte transgen. Het Sleeping Beauty (SB) transposon, gereconstitueerd uit een oud Tc1/mariner-type transposon gevonden in vis33 en verder verbeterd door moleculaire evolutie resulterend in de hyperactieve variant SB100X34, maakte efficiënte transpositie in verschillende primaire cellen mogelijk en werd gebruikt voor de fenotypische correctie in verschillende ziektemodellen35. Op dit moment zijn 13 klinische onderzoeken gestart met behulp van het SB transposon systeem. Het SB100X transposon systeem bestaat uit twee componenten: het transposon, dat bestaat uit het gen van belang geflankeerd door terminale inverted repeats (TIRs), en het transposase, dat het transposon mobiliseert. Na plasmide-DNA-levering aan de cellen bindt het transposase de TIRs en katalyseert het de excisie en integratie van het transposon in het genoom van de cel.

We hebben een niet-virale celgebaseerde additieve therapie ontwikkeld voor de behandeling van neovasculaire LMD. De aanpak omvat de op elektroporatie gebaseerde insertie van het PEDF-gen in primaire pigmentepitheelcellen (PE) door middel van het SB100X transposonsysteem 36,37,38. De genetische informatie van de transposase en PEDF wordt verstrekt op afzonderlijke plasmiden, waardoor de ideale SB100X-PEDF-transposonverhouding kan worden aangepast. Elektroporatie wordt uitgevoerd met behulp van een op pipet gebaseerd capillair transfectiesysteem dat wordt gekenmerkt door een maximale spleetgrootte tussen de elektroden terwijl hun oppervlak wordt geminimaliseerd. Het apparaat bleek uitstekende transfectiesnelheden te bereiken in een breed scala van zoogdiercellen 39,40,41. Het kleine elektrodeoppervlak zorgt voor een uniform elektrisch veld en vermindert de verschillende bijwerkingen van elektrolyse42.

De anti-angiogene functionaliteit van PEDF uitgescheiden door getransfecteerde pigmentepitheelcellen werd aangetoond in verschillende in vitro experimenten die het kiemen, migreren en apoptose van menselijke navelstrenga-endotheelcellen analyseerden43. Bovendien vertoonde transplantatie van PEDF-getransfecteerde cellen in een konijnenmodel van cornea-neovascularisatie44 en een rattenmodel van CNV 43,45,46 een afname van neovascularisatie.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de stabiele insertie van het PEDF-gen in primaire menselijke RPE-cellen via het SB100X-transposonsysteem met behulp van een capillair transfectiesysteem. De getransfecteerde cellen werden gedurende 21 dagen in cultuur gehouden en vervolgens geanalyseerd in termen van PEDF-genexpressie door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en in termen van PEDF-eiwitsecretie door immunoblotting en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA, figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke donorogen werden verkregen van de Aachen Cornea Bank van de afdeling Oogheelkunde (Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Protocollen van de Verklaring van Helsinki. Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke monsters zijn goedgekeurd door de institutionele ethische commissie.

1. Isolatie van primaire menselijke RPE-cellen

  1. Leg steriele beschermende kleding en handschoenen neer. Plaats een steriele drape onder een laminaire stroming.
  2. Plaats steriele bereidingsinstrumenten en andere noodzakelijke steriele apparatuur onder de laminaire stroom.
  3. Noteer de ontvangst van de oogbollen, het begin van de voorbereiding en mogelijke afwijkingen. Registreer de leeftijd van de donor, het geslacht, de doodsoorzaak en de periode tussen het moment van overlijden en het verwijderen van de ogen.
  4. Plaats de oogbol in een steriel gaaskompres en houd deze in één hand.
  5. Scheid het voorste segment van het achterste segment door een omtreksnede ongeveer 3,5 mm achter de limbus met behulp van een scalpel en een extra fijne puntige oogschaar.
  6. Nadat u het achterste segment naar beneden hebt gekanteld, verwijdert u voorzichtig het glasvocht en het netvlies met behulp van een colibri-tang.
  7. Herschik discreet het ingeklapte RPE/choroidea-complex met behulp van een rechte iristang en houd het vervolgens op zijn plaats met een gebogen iristang.
  8. Vul de achterste oogschelp met 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 U / ml penicilline en 80 μg / ml streptomycine (pen / streptop) en 2,5 μg / ml amfotericine B (AmphoB).
    OPMERKING: In tegenstelling tot de isolatie van primaire RPE-cellen uit varkens- of runderogen 36,37, hoeft de achterste oogschelp niet te worden gevuld en geïncubeerd met trypsine.
  9. Oogst de RPE-cellen door het retinale pigmentepitheel voorzichtig van de oogzenuw naar de limbus te borstelen met een vuurgepolijste gebogen glazen Pasteur-pipet, terwijl het RPE / choroidea-complex aan de limbus wordt bevestigd met behulp van een colibri-tang. Breng de celsuspensie over in een petrischaaltje.
  10. Herhaal de stappen 1.8 en 1.9 en verzamel alle cellen in de petrischaal. Resuspendeer de celsuspensie zorgvuldig door op en neer te pipetteren met een eenkanaals pipet (100-1.000 μL).
  11. Zaai de RPE-celsuspensie van elke oogbol in drie putten van een celkweekplaat met 24 putten en vul ze tot 1 ml met DMEM / F12 aangevuld met FBS, Pen / Strep en AmphoB.
  12. Houd de RPE-celculturen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 totdat de samenvloeiing is bereikt. Verander het celkweekmedium twee keer per week.

2. Elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen

  1. Bereiding van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel
    1. Zuiver de SB100X transposase en PEDF transposon plasmide DNA met behulp van gebruikelijke plasmide zuiveringskits, die geschikt zijn voor gebruik in toepassingen zoals transfectie, volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Kwantificeer de plasmide-DNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer en stel deze in op een concentratie van 250 ng/μL met 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Meng een portie van 250 ng/μL SB100X transposase plasmide DNA (bijv. 2,5 μL) met 16 porties van 250 ng/μL PEDF transposon plasmide DNA (bijv. 40 μL). Restplasmidemengsel kan worden bewaard bij -20 °C.
      OPMERKING: Meerdere herhaalde vries- en ontdooicycli van het plasmidemengsel moeten worden vermeden.
    4. Breng 2 μL van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel, dat 29,4 ng SB100X transposase plasmide en 470,6 ng PEDF transposon plasmide bevat, in een steriele 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuis. Houd op ijs tot het gemengd is met cellen.
  2. Opstelling van het capillaire transfectiesysteem
    OPMERKING: Elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen is uitgevoerd via een capillair transfectiesysteem met behulp van de 10 μL-kit volgens het protocol van de fabrikant. Het systeem bestaat uit het transfectieapparaat, de transfectiepipet en het pipetstation. De kit bevat 10 μL transfectietips, bufferbuizen, elektrolytische buffer E (buffer E) en resuspensiebuffer R (buffer R).
    1. Sluit het pipetstation aan op het transfectieapparaat.
    2. Vul een bufferbuis met 3 ml buffer E en steek deze in het pipetstation totdat er een klikgeluid wordt gehoord.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de zijelektrode van de bufferbuis is aangesloten op de zijkogelzuiger van het pipetstation.
    3. Stel voor de elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen de volgende pulsomstandigheden in op het transfectieapparaat: 1.100 V (pulsspanning), 20 ms (pulsbreedte), twee pulsen (pulsnummer).
  3. Bereiding van de gecultiveerde primaire menselijke RPE-cellen
    1. Documentvorm en morfologie van de primaire RPE-celculturen via fasecontrastmicroscopie. Neem micrografieën met een lage vergroting om de groei van de RPE-cellen tot een confluente en geïntegreerde monolaag aan te tonen, evenals microfoto's met een hogere vergroting om de typische kasseimorfologie van de RPE-cellen aan te wijzen.
    2. Aspirateer het celkweekmedium en was de cellen tweemaal met 1 ml gebufferde fosfaatzoutoplossing (PBS, pH 7,4).
    3. Trypsinize primaire menselijke RPE-cellen met 0,5 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 7-15 min (maximaal). Controleer het loslating van de cel microscopisch.
    4. Stop trypsinisatie met 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS. Neem een aliquot van 20 μL voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de RPE-celsuspensie bij 106 x g gedurende 10 minuten.
    5. Meng de 20 μL aliquot met 20 μL trypan blauwe oplossing. Pipetteer 10 μL in elke helft van de hemocytometer en tel de cellen onder een fasecontrastmicroscoop.
    6. Na centrifugatie resuspenseert u de RPE-celpellet in 1 ml PBS.
    7. Neem 10.000-100.000 RPE-cellen per transfectiereactie en centrifugeer ze bij 106 x g gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Naast de transfectiereacties met elektrische veldtoepassing en toevoeging van plasmide-DNA, omvat elke benadering ook twee verschillende controleculturen: (1) zonder elektrische veldtoepassing en zonder plasmide-DNA; (2) met elektrische veldtoepassing, maar zonder plasmide-DNA.
    8. Resuspendeer de celpellet in 11 μL buffer R en combineer deze met 2 μL van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel (zie stap 2.1.4).
      OPMERKING: Na resuspensie in buffer R moeten de cellen binnen 15 minuten worden verwerkt om een vermindering van de levensvatbaarheid van de cel en de efficiëntie van de transfectie te voorkomen.
    9. Steek de kop van de transfectiepipet in de transfectiepunt van 10 μL totdat de klem de montagesteel van de zuiger volledig oppakt. Trek de cel/plasmide-oplossing op in de transfectiepunt.
      OPMERKING: Vermijd het genereren van luchtbellen en hun aspiratie in de transfectiepunt.
    10. Zorg voor 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS, maar zonder pen/strep en zonder amphob, in het vereiste aantal putten van een celkweekplaat met 24 putten.
  4. Elektroporatieproces
    1. Steek de transfectiepipet in de bufferbuis in het pipetstation (zie stap 2.2.2) totdat een klikgeluid wordt gehoord.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de metalen kop van de transfectiepipet is aangesloten op de kogelzuiger in het pipetstation en op de bufferbuis.
    2. Druk op Start op het touchscreen van het transfectieapparaat. Voordat de elektrische puls wordt aangebracht, controleert het apparaat automatisch of de bufferbuis en de transfectiepipet correct zijn ingebracht. Na levering van de elektrische pulsen wordt Complete weergegeven op het touchscreen.
    3. Verwijder de transfectiepipet voorzichtig uit het pipetstation en laat de geëlektroporated cellen onmiddellijk los uit de transfectiepunt van 10 μL door de cel/plasmide-oplossing in de voorbereide putten van de celkweekplaat te pipetteren (zie stap 2.3.10).
    4. Behoud getransfecteerde RPE-celculturen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2. Voeg Pen/Strep en AmphoB toe met de eerste medium uitwisseling 3 dagen na elektroporatie.

3. Analyses van getransfecteerde primaire menselijke RPE-cellen

  1. Monstervoorbereiding
    1. Na een teelttijd van 3 weken incubeer je uiteindelijk de RPE-celculturen in een gedefinieerd volume van 1,0 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS, Pen/Strep en AmphoB gedurende een bepaalde tijd van 24 uur.
    2. Neem de celkweeksupernatanten en bewaar ze bij -20 °C tot verdere verwerking nabij of bij -80 °C voor thermisch onstabiele monsters en langdurige opslag.
    3. Trypsinize getransfecteerde RPE-celculturen met 0,5 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 10 minuten.
    4. Stop trypsinisatie met 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS. Neem kleine aliquots voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer (zie stap 2.3.5). Centrifugeer de RPE-celsuspensies bij 106 x g gedurende 10 minuten.
    5. Bewaar de RPE-celpellets bij -80 °C tot verdere verwerking.
  2. Evaluatie van PEDF-secretie door western blotting
    OPMERKING: Voor een kwalitatieve beoordeling worden celkweeksupernatanten (zie stap 3.1.2) geanalyseerd via natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE) en daaropvolgende western blotting. Afhankelijk van de PEDF transposon plasmide DNA gebruikt, de supernatanten moeten anders worden verwerkt.
    1. Zuivering van his-tagged PEDF-fusie-eiwitten uit celkweeksupernatanten
      1. Neem 30 μL nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) slurry per monster met behulp van een afgeschuinde punt en pelleteer de Ni-NTA hars door centrifugatie (2.660 x g gedurende 30 s).
      2. Resuspendeer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 200 μL 1x incubatiebuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0) en pelleteer het door centrifugatie (2.660 x g gedurende 30 s).
      3. Herhaal de vorige stap.
      4. Resuspendeer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 40 μL 4x incubatiebuffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazool, pH 8,0) per monster.
      5. Meng 900 μL celkweeksupernatant met 260 μL 4x incubatiebuffer en 55 μL voorbehandelde Ni-NTA-slurry (zie stap 3.2.1.4).
      6. Incubeer het mengsel op een schommelende shaker op kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
      7. Pellet de Ni-NTA hars door centrifugatie (2660 x g gedurende 60 s).
      8. Resuspendeer de Ni-NTA hars zorgvuldig met 175 μL 1x incubatiebuffer en pellethars door centrifugatie (2.660 x g gedurende 60 s).
      9. Herhaal de vorige stap.
      10. Resuspenseer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 30 μL el elutibuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8,0) en incubeer het mengsel op een schommelschudder bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
      11. Pellet de Ni-NTA hars door centrifugeren (2.660 x g gedurende 30 s).
      12. Neem het supernatant voorzichtig in en meng het met 2x SDS monsterbuffer47.
      13. Verwarm het mengsel op 95 °C gedurende 5 minuten en scheid de Ni-NTA gezuiverde eiwitten op een 10% SDS-polyacrylamide gel.
      14. Voer western blotting uit met behulp van anti-Penta-His antilichamen (muis monoklonaal, 1:500) en mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde antimuisantistoffen (konijn polyklonaal, 1:1.000) zoals eerder beschreven36,37.
    2. Directe analyse van niet-gelabelde PEDF-eiwitten
      1. Neem 15 μL celkweek supernatant en meng dit met 2x SDS monster buffer47.
      2. Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten op 95 °C en scheid de eiwitten op een 10% SDS-polyacrylamidegel.
      3. Voer western blotting uit met behulp van anti-humane PEDF-antilichamen (konijnenpolyklonaal, 1:4.000) en HRP-geconjugeerde antikonijnantistoffen (geitenpolyklonaal, 1:2.000) zoals eerder beschreven38.
    3. Kwantificering van PEDF-secretie door ELISA
      1. Analyseer celkweeksupernatanten (zie stap 3.1.2) met behulp van een menselijke PEDF ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
      2. Relateer de hoeveelheid uitgescheiden PEDF aan de tijd en het celnummer dat voor elke transfectiereactie is bepaald (zie stap 3.1.4).
    4. Analyse van PEDF-genexpressie in getransfecteerde RPE-cellen
      1. Isoleer totaal RNA uit de RPE-celpellets (zie stap 3.1.5) met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.
      2. Kwantificeer RNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer.
      3. Voer reverse transcriptie uit op 0,1 μg RNA met behulp van een reverse transcriptiesysteem volgens het protocol van de fabrikant.
      4. Voer real-time qPCR uit zoals eerder beschreven38.
    5. Analyse van transgene insertieplaatsen in getransfecteerde RPE-cellen
      1. Isoleer genomisch DNA uit de RPE-celpellets (zie stap 3.1.5) met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.
      2. Kwantificeer DNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer.
      3. Genereer insertieplaatsbibliotheken met behulp van een computerondersteund hemi-specifiek PCR-schema zoals eerder beschreven38.
      4. Voer computationele analyse uit zoals eerder beschreven38.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teelt en elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen
We hebben aangetoond dat het zaaien van een voldoende aantal primaire RPE-cellen van dierlijke oorsprong de teelt en groei mogelijk maakt tot een geïntegreerde monolaag van gepigmenteerde, zeshoekig gevormde cellen 36,37,48. Hun vermogen om tight junctions te vormen, fagocytische activiteit te vertonen en specifieke ma...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ons project streven we naar de niet-virale productie van genetisch gemodificeerde primaire menselijke RPE-cellen die voortdurend overexpressie en afscheiding van een effectieve factor om de getransfecteerde cellen te gebruiken als langetermijntherapeutisch middel voor het creëren en onderhouden van een beschermende omgeving. We hebben de introductie vastgesteld van het gen dat codeert voor PEDF, een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multifunctioneel eiwit met anti-angiogene en neuroprotectieve functies. Het hier...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoltán Ivics en Zsuzsanna Izsvák zijn uitvinders van verschillende patenten op SB transposon technologie

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het zevende kaderprogramma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie, subsidieovereenkomst nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák werd gefinancierd door de European Research Council, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). De auteurs willen Anna Dobias en Antje Schiefer (afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) bedanken voor uitstekende technische ondersteuning, en de Aachen Cornea Bank (Afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) voor het verstrekken van de menselijke donorogen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Isolatie van primaire humane RPE-cellen
24-Wells CultuurschaalEppendorf, Hamburg, Duitsland0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DuitslandA2942
Colibri PincetGeuder, Heidelberg, DuitslandG-18950
Geboogd Iris PincetGeuder, Heidelberg, DuitslandG-18856
Vuilnismesje (Nr. 11)Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Aangepast Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixtuur (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, DuitslandP04-41150
Extra Fijne Puntige OogschaartjeGeuder, Heidelberg, DuitslandG-19405
Fetaal Runderserum [0,2 µm Sterieel Gefilterd] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, DuitslandP40-37500
Glazen Pasteur PipettenBrand, Wertheim, Duitsland747715
Penicilline [10.000 eenheden/mL] en Streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, DuitslandP0781
Pipettipuntjes (1000 µL)Starlab, Hamburg, Duitsland
Eenkanaals Pipet (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Steriele AfdekdoekLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Duitsland
Steriele GauzekompresFink-Walter, Merchweiler, Duitsland321063
Steriele HandschoenenSempermed, Wien, Oostenrijk
Steriele Petrischaal (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Steriele Chirurgische KledingHalyard Health, Alpharetta, GA
Recht Iris PincetGeuder, Heidelberg, DuitslandG-18855
Elektroporatie van primaire humane RPE-cellen
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
12-Wells CultuurschaalThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-Wells CultuurschaalEppendorf, Hamburg, Duitsland0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DuitslandA2942
Dulbecco’s Aangepast Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixtuur (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, DuitslandP04-41150
Safe-Lock Microcentrifugebuisjes (1,5 mL)Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Fetaal Runderserum [0,2 µm Sterieel Gefilterd] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, DuitslandP40-37500
Omgekeerd MicroscoopLeica Mikrosysteme, Wetzlar, DuitslandLeica DMi8
Microvolume Spectrofotometer (NanoDrop Spectrofotometer)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillaire Transfectie Systeem (Neon Transfectie Systeem)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK5000
Neon Transfectie Systeem 10 µL KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocytometer (Neubauer Kamer)Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Duitsland0640110
PBS Dulbecco zonder Ca2+ zonder Mg2+Biochrom, Berlijn, DuitslandL182-50
Penicilline [10.000 eenheden/mL] en Streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, DuitslandP0781
Pipettipuntjes (10 µL)Starlab, Hamburg, Duitsland
Pipettipuntjes (1000 µL)Starlab, Hamburg, Duitsland
Pipettipuntjes (200 µL)Starlab, Hamburg, Duitsland
Plasmid Maxi KitQiagen, Hilden, Duitsland12163
Eenkanaals Pipet (0,1-10 µL)Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Eenkanaals Pipet (100-1000 µL)Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Eenkanaals Pipet (10-200 µL)Eppendorf, Hamburg, Duitsland
Trypan Blauw OplossingMerck, Darmstadt, DuitslandT8154
Trypsine-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analyses van getransfecteerde primaire humane RPE-cellen
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubatie Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubatie Buffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazool, pH 8,0)
Amersham Protran Ondersteunde 0,2 µm Nitrocellulose Blotting MembraanCytiva, Marlborough, MA10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, DuitslandA2942
Anti-PEDF Antilichamen (Konijn Polyklonaal)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PEDF genexpressiecapillaire elektroporatieplasmid DNA preparatieWestern blot analyseELISA kwantificeringnikkel NTA zuiveringstabiele transgeenintegratie

Gerelateerde artikelen