Method Article

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

DOI:

10.3791/61993

⸱

February 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Golden Gate-kloonmethode maakt een snelle assemblage van meerdere genen in elke door de gebruiker gedefinieerde opstelling mogelijk. Het maakt gebruik van type IIS beperking enzymen die snijden buiten hun herkenning sites en creëren een korte overhang. Dit modulaire kloonsysteem (MoClo) maakt gebruik van een hiërarchische workflow waarin verschillende DNA-onderdelen, zoals promotors, coderingssequenties (CDS) en terminators, eerst worden gekloond tot een invoervector. Meerdere invoervectoren worden vervolgens samengevoegd tot transcriptie-eenheden. Verschillende transcriptie-eenheden verbinden vervolgens met een multi-gen plasmide. De Golden Gate-kloonstrategie is van enorm voordeel omdat het littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk maakt. De hiërarchische workflow maakt het meestal mogelijk om een grote verscheidenheid aan multi-genconstructies te klonen zonder dat er een sequencing nodig is die verder gaat dan invoervectoren. Het gebruik van fluorescerende eiwituitval maakt een eenvoudige visuele screening mogelijk. Dit werk biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de gist modulair klonen (MoClo) kit. We tonen optimale en suboptimale resultaten van multi-gen plasmide assemblage en bieden een gids voor screening op kolonies. Deze kloonstrategie is zeer toepasbaar voor gist metabole engineering en andere situaties waarin multi-gen plasmide klonen vereist is.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthetische biologie is gericht op het ontwikkelen van biologische systemen met nieuwe functionaliteiten die nuttig zijn voor de farmaceutische, agrarische en chemische industrie. Het assembleren van grote aantallen DNA-fragmenten op een high-throughput manier is een fundamentele technologie in de synthetische biologie. Een dergelijk ingewikkeld proces kan worden opgesplitst in meerdere niveaus met afnemende complexiteit , een concept dat is ontleend aan fundamentele ingenieurswetenschappen1,2. In de synthetische biologie assembleren DNA-fragmenten meestal hiërarchisch op basis van functionaliteit: (i) Deelniveau: "delen" verwijst naar DNA-fragmenten met een specifieke functie, zoals een promotor, een coderingssequentie, een terminator, een oorsprong van replicatie; ii) Transcriptie-eenheden (TU)-niveau: een TU bestaat uit een promotor, een coderingssequentie en een terminator die in staat is een enkel gen te transcriberen; iii) Multigenniveau: een multigen plasmide bevat meerdere TU's die vaak bestaan uit een volledige metabolische route. Deze hiërarchische assemblage die door de BioBrick-gemeenschap wordt geïntroduceerd, is het basisconcept voor de assemblage van grote sets DSA's in synthetische biologie3.

In het afgelopen decennium4,5,6,7, heeft de Golden Gate-kloontechniek de hiërarchische DNA-assemblage aanzienlijk vergemakkelijkt2. Veel andere meerdelige kloonmethoden, zoals Gibson klonen8, ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC)9, uracil excisie-gebaseerd klonen (USER)10, de ligase cycling reaction (LCR)11, en in vivo recombinatie (DNA Assembler)12,13, zijn ook ontwikkeld tot nu toe. Maar Golden Gate klonen is een ideale DNA-assemblagemethode omdat het onafhankelijk is van genspecifieke sequenties, waardoor littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk is. Golden Gate klonen maakt gebruik van type IIS restrictie enzymen die een niet-palindromische sequentie herkennen om verspringende uitsteeksels buiten de herkenningsplaats te creëren2. Een ligase voegt zich vervolgens bij de gegloeide DNA-fragmenten om een meerdelige assemblage te verkrijgen. Het toepassen van deze kloonstrategie op het modulaire kloonsysteem (MoClo) heeft het mogelijk gemaakt om maximaal 10 DNA-fragmenten samen te stellen met meer dan 90% transformanten gescreend met de correct geassembleerde constructie4.

Het MoClo-systeem biedt enorme voordelen die de ontwerp-bouw-testcyclus van synthetische biologie hebben versneld. Ten eerste stellen de verwisselbare onderdelen combinatorisch klonen in staat om een grote ruimte van parameters snel te testen. Bijvoorbeeld, het optimaliseren van een metabolische route vereist meestal fietsen door vele promotors voor elk gen om de route flux in evenwicht te brengen. Het MoClo-systeem kan dergelijke veeleisende kloontaken gemakkelijk aan. Ten tweede moet men het deel plasmide sequencen, maar meestal niet de TU of de multi-gen plasmiden. In de meeste gevallen is screening op kolonie-PCR of restrictievertering voldoende voor verificatie op TU- en multi-gen plasmideniveau. Dit komt omdat het klonen van het onderdeel plasmide de enige stap is die PCR vereist, die vaak mutaties introduceert. Ten derde is het MoClo-systeem ideaal voor het bouwen van multi-gen complexe metabolische routes. Ten slotte kan het deel plasmiden vanwege de universele uitsteeksels worden hergebruikt en gedeeld met de hele bio-engineeringgemeenschap. Momenteel zijn MoClo kits beschikbaar voor planten14,15,5,16,17,schimmels6,18,19,20,21,22,bacteriën7,23,24,25,26,27en dieren28,29. Een multi-koninkrijk MoClo platform is onlangs ook geïntroduceerd30.

Voor Saccharomyces cerevisiaehebben Lee et al.6 een veelzijdige MoClo toolkit ontwikkeld, een uitstekende bron voor de gist synthetische biologie gemeenschap. Deze kit wordt geleverd in een handig 96-well-formaat en definieert acht soorten verwisselbare DNA-onderdelen met een gevarieerde verzameling goed gekarakteriseerde promotors, fluorescerende eiwitten, terminators, peptidetags, selectiemarkers, oorsprong van replicatie en genoombewerkingstools. Deze toolkit maakt de assemblage van maximaal vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide mogelijk. Deze kenmerken zijn waardevol voor gist metabolische engineering, waarin gedeeltelijke of volledige paden worden over-uitgedrukt om gerichte chemicaliën te produceren. Met behulp van deze kit hebben onderzoekers de productie van geraniol, linalool31,penicilline32,muconic acid33,indigo34en betalain35 in gist geoptimaliseerd.

Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol om het gebruik van de MoClo-toolkit te begeleiden om multigen-paden te genereren voor episomale of genomische expressie. Door uitgebreid gebruik van deze kit hebben we ontdekt dat het nauwkeurig meten van DNA-concentraties de sleutel is tot het waarborgen van de equimolar verdeling van elk onderdeel in de Golden Gate-reactie. We raden ook de T4 DNA-ligase over de T7 DNA-ligase aan omdat de eerste beter werkt met grotere aantallen uitsteeksels36. Ten slotte moeten alle interne herkenningslocaties van BsmBI en BsaI vóór de montage worden verwijderd of gedomesticeerd. Als alternatief kan men overwegen om onderdelen te synthetiseren om meerdere interne sites te verwijderen en om gelijktijdige codonoptimalisatie te bereiken. We laten zien hoe we deze toolkit kunnen gebruiken door een vijf-gen traject uit te drukken voor β-caroteen en lycopeen productie in S. cerevisiae. We laten verder zien hoe je de ADE2-locus kunt uitschakelen met behulp van de genoombewerkingstools uit deze kit. Deze op kleuren gebaseerde experimenten werden geselecteerd voor eenvoudige visualisatie. We laten ook zien hoe je fusie-eiwitten kunt genereren en aminozuurmutaties kunt maken met behulp van Golden Gate-klonen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het hiërarchische kloonprotocol dat in deze toolkit wordt aangeboden, kan worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: 1. Het klonen van deelplasmiden; 2. Klonen van transcriptie-eenheden (TUs); 3. Klonen van multi-gen plasmiden (Figuur 1). Dit protocol begint bij het primerontwerp en eindigt met toepassingen van de gekloonde multi-gen plasmide.

1. Primer ontwerp voor het klonen van het onderdeel plasmide (pYTK001):

  1. Ontwerp de voorwaartse en omgekeerde primers met flankerende nucleotiden TTT aan het 5'-uiteinde, een BsmBI-herkenningssite met een extra nucleotide (CGTCTCN), een 4-nucleotiden (nt) overhang (TCGG) complementair aan die van de ingangsvector, een BsaI-herkenningssite met een extra nucleotide (GGTCTCN) en een 4-nt deelspecifieke overhang,naast de sjabloon- GoldenBraid 4.037 en GoldenMutagenesis38 zijn enkele van de online software die kan worden gebruikt voor Golden Gate specifiek primerontwerp.
  2. Als BsaI- of BsmBI-herkenningssites in enig deel aanwezig zijn, gebruikt u een domesticatiestap om deze sites te muteren voordat Golden Gate-assemblage39. Voor integratieve plasmiden (zie stap 4) domesticeert u elke NotI-herkenningssite. Om een deel te domesticeren met één ongewenste herkenningsplaats, verdeelt u het deel in twee subdelen in de buurt van de ongewenste plaats (Figuur 2A):
    1. Ontwerp de voorwaartse primer van het eerste subdeel op dezelfde manier als in stap 1.1. maar ontwerp de omgekeerde primer met alleen de BsmBI-site en een 4-nt genspecifieke overhang.
    2. Ontwerp de tweede sub-part forward primer met de BsmBI site en de 4-nt gen-specifieke overhang alleen die overlapt met de omgekeerde primer van het eerste deel. Ontwerp de omgekeerde primer van het tweede deel op dezelfde manier als in stap 1.1.
    3. Introduceer de gewenste mutatie(s) in de omgekeerde (voor stap 1.2.1) of voorwaartse primer (stap 1.2.2) in het genspecifieke gebied van de primer.
      OPMERKING: Als alternatief kan een BsmBI- en BsaI-vrij en codon-geoptimaliseerd onderdeel commercieel worden gesynthetiseerd. Voor coderingssequenties (CDS) kan een synonieme mutatie gemakkelijk worden opgenomen bij de derde nucleotide van een aminozuurcodon. Voor promotors en terminators wordt het echter aanbevolen om de gemuteerde promotor- of terminatoractiviteit te controleren met behulp van een reporter-test39. Als er een ongewenste beperkingsplaats is tegen het einde van de reeks, kan deze worden gemuteerd met behulp van een langere omgekeerde primer. Als er meerdere ongewenste sites aanwezig zijn, kan site-gerichte mutagenese die het muteren van meerdere sites toestaat, worden uitgevoerd40.
  3. Af en toe is het wenselijk om twee eiwitten als één onderdeel te combineren met een linker ertussen (figuur 2A). De linker draagt bij tot de structurele integriteit van de twee afzonderlijke eiwitten41.
    1. De voorwaartse primer voor het eerste gen is hetzelfde als in stap 1.1. Neem in de omgekeerde primer een BsmBI-site, een 4-nt genspecifieke overhang en een linkersequentie op. De 4-nt overhang kan de eerste paar nucleotiden van het linker- of tweede gen zijn.
    2. Ontwerp voor het tweede gen de voorwaartse primer zodanig dat deze een BsmBI-herkenningsplaats heeft en een 4-nt overhang die complementair is aan die van de omgekeerde primer van het eerste gen. Ontwerp de omgekeerde primer van het tweede gen zoals in stap 1.1.
  4. Om de onderdelen te versterken door polymerasekettingreactie (PCR)42,gebruikt u een high-fidelity DNA-polymerase om de delen te versterken uit een genomisch DNA, een cDNA of een plasmide. Controleer het PCR-product op een 1% agarosegel gevolgd door gelzuivering. Het gebruik van gezuiverd DNA wordt sterk aanbevolen, als gelzuivering arbeidsintensief is, gebruik dan ten minste een spinkolom om het PCR-product te zuiveren.

2. Delen klonen in de invoervector (pYTK001) om deelplasmiden te maken (Figuur 2B)

  1. Om de Golden Gate-reactiemix in te stellen, voegt u 20 fmol van elk PCR-product en de entryvector (pYTK001), 1 μL 10X T4-ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I (een zeer efficiënt isoschizomer van BsmBI) en 0,5 μL T4-ligase toe. Voeg ddH2O toe om het totale volume op 10 μL te brengen.
  2. Om de kloonreactie in te stellen, voert u het volgende programma uit in een thermocycler: 25-35 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten (spijsvertering) en 16 °C gedurende 5 minuten (ligatie), gevolgd door een eindvertering bij 50 °C gedurende 10 minuten en enzyminactivatie bij 80 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: 35 cycli van spijsvertering/ligatie worden aanbevolen bij het gelijktijdig klonen van meerdere DNA-stukken in de ingangsvector, bijvoorbeeld tijdens het klonen van fusiegenen of het domesticeren van een gen.
  3. Transformeer de gehele reactiemix in de DH5α stam of gelijkwaardige Escherichia coli chemisch competente cellen door hitteschok. Het wordt aanbevolen het volledige gekloonde product van 10 μL om te zetten in 35 μL chemisch competente E. coli-cellen (2 X10 5 kve/ml, cfu wordt berekend door 5 ng pYTK001 om te zetten in 100 μL van de competente cellen). Verspreid over een lysogene bouillonplaat (LB) met 35 μg/ml chlooramfenicol (cm). Incubeer 's nachts bij 37 °C.
  4. Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator en houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de supermap groen fluorescerend eiwit (sfGFP) te laten ontwikkelen voor een intensere groene kleur.
  5. Voor een eenvoudigere screening plaatst u de plaat op een ultraviolette (UV) of een blauwlichttransilluminator. De sfGFP die kolonies bevat, fluoresceert onder het UV-licht.
  6. De groene kolonies zijn negatief omdat ze de ongesneden pYTK001 bevatten. De witte kolonies zijn waarschijnlijk positief. Het klonen is meestal succesvol als er ~30-100% witte kolonies zijn. Voer verdere screening van een paar witte kolonies uit door kolonie PCR of beperkingsverteringen (voorgesteld enzym: BsaI-HFv2).
  7. Zuiver plasmiden uit een paar van de potentieel correcte kolonies en bevestig de sequenties door Sanger-sequencing.

3. Het assembleren van deelplasmiden in "cassette" plasmiden

OPMERKING: Een cassetteplasmide bevat een door de gebruiker gedefinieerde transcriptie-eenheid (TU) bestaande uit een promotor, een CDS en een terminator. Een cassette plasmide maakt de expressie van een enkel gen mogelijk. Als de cassetteplasmiden worden samengevoegd tot een multi-gen plasmide, dan is de eerste stap het bepalen van het aantal en de volgorde van TUs in de multi-gen plasmide. Deze bepalen welke connectoren in de cassetteplasmiden moeten worden gebruikt, omdat connectoren TUs in de multi-gen plasmide koppelen. De linkerconnector van de eerste TU moet ConLS zijn en de rechterconnector van de laatste TU moet ConRE zijn. Ze zullen overlappen met ConLS' en ConRE' van multi-gen plasmiden. De rest van de connectoren moeten in de toenemende numerieke volgorde zijn. Als de multi-gen plasmide bijvoorbeeld vier TUs bevat, zijn de connectorcombinaties ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 en ConL3-TU4-ConRE (figuur 1).

  1. Alvorens transcriptie-eenheden te assembleren, wordt aanbevolen een tussenvector te assembleren met de volgende zes delen: de linkerconnector, de sfGFP-dropout (pYTK047), de rechterconnector, een gistselectiemarker, een gistoorsprong van replicatie en het deel plasmide met een mRFP1, een E. coli-oorsprong en het ampicillineresistente gen (pYTK083) (figuur 3).
    1. Zuiver de bovenstaande zes plasmiden. Registreer hun concentraties met behulp van een UV-Vis spectrofotometer of een fluorescentie-gebaseerde test en verdun elke plasmide met ddH2O, zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft. Bereken de DNA-molaire concentratie met behulp van een online calculator.
      OPMERKING: Het is erg belangrijk om de DNA-concentraties nauwkeurig te meten en precies te pipeten om de assemblage te laten werken, vooral voor assemblages met vijf- tot zevendelige plasmiden. Kleine fouten in de DNA-concentratie van elke plasmide kunnen een aanzienlijke afname van de kloonefficiëntie veroorzaken.
    2. Voeg 1 μL van elke plasmide, 1 μL 10X T4 ligase buffer, 0,5 μL BsaI-HFv2 (een zeer efficiënte versie van BsaI) en 0,5 μL T4 ligase toe. Maak het volume op tot 10 μL door ddH2O toe te voegen.
    3. Om de kloonreactie in te stellen, voert u het volgende programma uit in de thermocycler: 25-35 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten (spijsvertering) en 16 °C gedurende 5 minuten (ligatie). Laat de laatste spijsverterings- en warmte-inactiveringsstappen weg, omdat de BsaI-locaties in de tussenvector moeten worden bewaard (figuur 3).
    4. Transformeer de gehele reactiemix in de DH5α stam of andere E. coli competente cellen. Verspreid over een LB-plaat met 50 μg/ml carbenicilline (Cb) of ampicilline. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
      OPMERKING: Carbenicilline is een stabiele analoog van ampicilline.
    5. Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator. De plaat bevat zowel lichtrode als lichtgroene kolonies (figuren 6C en 6D). Houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de mRFP1 en sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of een blauwlichttransilluminator om de groene kolonies te identificeren, die de potentieel correcte tussenvector bevatten.
    6. Streep de groene kolonies uit op een LB + Cb-plaat en incubeer 's nachts bij 37 °C. De volgende dag weer op een LB + Cm plaat en 's nachts bij 37 °C incuberen. De kolonies die groeien op LB + Cm platen bevatten verkeerd gemonteerde plasmiden omdat Cm resistente deelvectoren behouden blijven.
    7. Kies de kolonies die niet groeien op de LB + Cm plaat en voer restrictieverteringen uit (voorgestelde enzymen: BsaI-HFv2, Esp3I) om de correct geassembleerde plasmide te bevestigen. U kunt ook kolonie PCR gebruiken voor screening.
  2. Zodra de tussenliggende vector met succes is geassembleerd, is de volgende stap het assembleren van transcriptie-eenheden. Dit is een 4-delige assemblage met de volgende onderdelen: de tussenvector, een promotor, een CDS en een terminator.
    1. Zuiver de vierdelige plasmiden. Noteer hun concentraties en verdun elk plasmide zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft.
    2. Volg stap 3.1.2 om de reactiemix in te stellen.
    3. Volg stap 2.2 om de kloonreactie in te stellen.
    4. Transformeer de gehele kloonreactiemix in de DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen en plaat op LB + Cb. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
    5. Haal na 16-18 uur de plaat uit de incubator. Witte en lichtgroene kolonies verschijnen (figuren 6E en 6F). Houd de plaat ongeveer 5 uur op 4 °C om de sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de niet-fluorescerende witte kolonies te identificeren. Deze bevatten de mogelijk correcte transcriptie-eenheden.
    6. Streep uit en kweek 8-10 witte kolonies en voer een kolonie PCR uit. Zuiver plasmiden uit de kolonies die positief testen van kolonie PCR. Voer een restrictievertering uit (voorgesteld enzym: Esp3I) om de assemblage verder te bevestigen.
      OPMERKING: Sequencing transcriptie-eenheden is meestal niet nodig omdat het klonen alleen beperking van de spijsvertering en ligatie omvat. Alle sequenties van belang zijn bevestigd op het deel plasmide niveau.

4. Het assembleren van cassetteplasmiden in "multi-gen" plasmiden:

OPMERKING: Multi-gen plasmiden maken de expressie van meer dan één gen mogelijk. Afhankelijk van de downstream-toepassing kunnen multi-gen plasmiden repliceerbaar of integratief zijn. Replicerende plasmiden hebben de gistoorsprong van replicatie; daarom kan het stabiel worden gehandhaafd wanneer gistcel zich verdeelt. Integratieve plasmiden hebben niet de gistoorsprong van replicatie. In plaats daarvan hebben ze 5' en 3' homologiearmen die de integratie van meerdere genen in specifieke loci van het genoom mogelijk maken door homologe recombinatie.

  1. Voor multi-gen plasmiden, assembleer eerst een tussenvector.
    1. Om replicerende tussenvectoren(figuur 4A)te assembleren, monteert u de volgende zes delen: de linkerconnector (ConLS'-pYTK008), de sfGFP-uitval (pYTK047), de rechterconnector (ConRE'-pYTK072), een gistselectiemarker, een gistoorsprong van replicatie en het deel plasmide met mRFP1, een E. coli-oorsprong van replicatie en het kanamycineresistente gen (pYK).
      1. Volg voor montage de stappen van 3.1.1 tot 3.1.3.
      2. Transformeer de gehele kloonreactiemix in DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen, en plaat op LB plus 50 μg/ml kanamycine (Km). Incubeer 's nachts bij 37 °C.
      3. Voor rood/groene kleurgebaseerde screening volgt u stap 3.1.5.
      4. Voor het screenen van misassemblies, strepen en groeien van de groene kolonies op een LB + Km plaat. Volg vervolgens stap 3.1.6.
    2. Bepaal voor integratieve multigenvectoren (figuur 4B) eerst de genomische locus van belang en ontwerp vervolgens ongeveer 500 basisparen van 5' en 3' homologiearmen voor integratie in die locus.
      1. Kloon de 5' en 3' homologie armen van gist genomisch DNA in de entry vector-pYTK001. Volg stap 1 en 2.
      2. Monteer de volgende zeven plasmiden: de linkerconnector (ConLS'-pYTK008), de sfGFP dropout (pYTK047), de rechter connector (ConRE'-pYTK072), een gistselectiemarker, de 3' homologie arm, het deel plasmide met mRFP1, E. coli oorsprong van replicatie, en het kanamycine-resistente gen (pYTK090), en de 5' homologie arm.
      3. Voor montage en screening volgt u stap 4.1.1.
  2. Assemblage van de multi-gen plasmide
    1. Zuiver plasmiden van de tussenvector verkregen in stap 4.1 en de cassetteplasmiden vanaf stap 3. Registreer hun concentraties met behulp van een UV-Vis spectrofotometer of een fluorescentie-gebaseerde test. Verdun elk in ddH2O zodat 1 μL 20 fmol DNA heeft.
    2. Voeg 1 μL tussenvector, 1 μL van elke transcriptie-eenheid, 1 μL 10x T4 ligase buffer, 0,5 μL Esp3I en 0,5 μL T4 ligase toe. Breng het volume op 10 μL met ddH2O.
    3. Volg stap 2.2 om de kloonreactie in te stellen.
    4. Transformeer de gehele kloonreactiemix in DH5α of gelijkwaardige E. coli competente cellen en plaat op LB + Km. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
    5. Voer de groen/witte screening uit zoals in stap 3.2.5.
    6. Zuiver plasmiden uit een paar witte kolonies en voer beperkingsverteringen uit. Het gebruik van het NotI-HF-enzym wordt aanbevolen omdat er twee NotI-locaties zijn op respectievelijk de E. coli-oorsprong en het Km-selectiemarkergedeelte (figuur 4B). Als de geassembleerde plasmide erg groot is, kan een andere beperkingsplaats worden gekozen voor verdere bevestiging. U kunt ook screenen met kolonie PCR voordat u doorgaat met het beperken van de spijsvertering.

5. Het toepassen van multi-gen plasmiden voor chromosomale of plasmide-gebaseerde genexpressie

  1. Integratie van multi-gen plasmide in het gistgenoom voor chromosomale genexpressie (Figuur 5)
    1. Ontwerp een guide RNA (gRNA) voor de gewenste locus. Het gebruik van meerdere online bronnen, zoals Benchling, CRISPRdirect43en CHOPCHOP44,wordt aanbevolen om de maximale specificiteit op het doel te bepalen.
    2. Kloon de gesynthetiseerde 20-nt gRNA in de pCASplasmide 45 door Gibson klonen. Lineariseer de pCAS plasmide door PCR met behulp van een omgekeerd primerpaar dat zich bindt aan respectievelijk de 3' van het HDV ribozyme en de 5' van het tracrRNA (Figuur 5). U kunt ook de gRNA klonen in de sgRNA dropout plasmide (pYTK050) en de dropout plasmide assembleren tot een cassette plasmide met linkers. Monteer vervolgens de Cas9 TU met het Cas9 deel plasmide (pYTK036). Monteer ten slotte de Cas9 TU en de sgRNA TU tot een replicative multi-gene plasmide.
    3. Lineariseer 5-15 μg integratieve multi-gen plasmide met 1 μL NotI-HF enzym 's nachts. Transformeer 1 μg pCAS-gRNA en de lineaire integratieve multigen plasmide in S. cerevisiae. Bereid competente cellen voor met behulp van een in de handel verkrijgbaar gisttransformatiekit of volgens het protocol van Geitz en Schiestl, 200746.
      OPMERKING: Het is niet nodig om de lineaire multi-gen plasmide na de NotI-spijsvertering te zuiveren.
    4. Pellet de cellen na herstel, gooi het supernatant weg, was met een gelijk volume water. Plaatgistcellen op de volledige synthetische medium (CSM) dropout plaat of het gistextract pepton dextrose medium (YPD) plaat met antibiotica, afhankelijk van de gist selectieve marker. Incubeer bij 37 °C gedurende twee dagen om kolonies te vormen. Als er geen kolonie wordt waargenomen, incubeer dan nog eens één tot twee dagen bij 30°C.
    5. Screen gistkolonies voor integratie door kolonie PCR47.
    6. Om de pCAS te genezen, streept u de kolonie uit met de juiste integratie op een niet-selectieve YPD-plaat. Groei 's nachts bij 30 °C. Streep een kolonie van de YPD-plaat op een verse YPD-plaat. Nogmaals, groei 's nachts bij 30 °C. Streep een kolonie van de tweede YPD-plaat naar een YPD plus 100 μg/ml nourseothricine, de selectiemarker van pCAS. Succesvolle uitharding treedt op wanneer gistcellen niet groeien op de selectieve plaat.
      OPMERKING: Als de pCAS plasmide niet wordt genezen in twee rondes van niet-selectieve YPD, streep dan opnieuw op een verse YPD voor nog eens 1-2 ronden.
  2. Het transformeren van replicerende multi-gen plasmide voor plasmide-gebaseerde genexpressie
    1. Transformeer 100 ng-1 μg zuivere multi-gen plasmide in S. cerevisiae competente cellen.
    2. Plaatgistcellen onmiddellijk na transformatie op de CSM-uitvalplaat of YPD plus antibioticumplaat, afhankelijk van de gebruikte gistselectiemarker. Incubeer bij 30°C gedurende 2-3 dagen om kolonies te vormen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier de resultaten van vier replicerende multi-gen plasmiden voor β-caroteen (geel) en lycopeen (rood) productie. Een integratieve multi-gen plasmide voor het verstoren van de ADE2 locus werd gebouwd, waarvan de kolonies rood zijn.

CDSs klonen in de invoervector (pYTK001)
ERG20 werd versterkt uit het gistgenoom en de drie carotenoïde genen crtE, crtYB, crtI van de ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De moclo gebaseerde kloonkit ontwikkeld door Lee et al. biedt een uitstekende bron voor snelle assemblage van één tot vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide voor replicatie of integratie in het gistgenoom. Het gebruik van deze kit elimineert het tijdrovende kloonknelpunt dat vaak bestaat voor het uitdrukken van meerdere genen in gist.

We hebben vijf verschillende condities getest voor de spijsvertering/ligatie cycli van Golden Gate klonen met T4 DNA ligase. We ontdekten dat 30 cy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Research Foundation for the State University of New York (Award #: 71272) en de IMPACT Award of University at Buffalo (Award #: 000077).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm Glass beadsRPI research products9831Voor het lyseren van gistcellen
Bacto AgarBD & Company214010Component van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
Bacto PeptoneBD& Company211677Component van het gistextract pepton dextrose-medium (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Seen zeer efficiënte versie van BsaI restrictie-enzym
CarbenicillineFisher Bioreagents4800-94-6Antibioticum voor screening op transcriptie-eenheidsniveau
ChloramfenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibioticum voor screening op entry vector-niveau
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Aminozuursupplement van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Koolstofbron van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
Difco Giststikstofbasis zonder aminozurenBD & Company291940Stikstofbron van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
dNTP-mixPromegaU1515dNTP's voor PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Seen zeer efficiënte isoschizomer van BsmBI
Frozen-EZ Gist Transformatie II KitZymo ResearchT2001Voor gisttransformatie
HexanenFisher ChemicalH302-1Voor carotenoïde-extractie uit gistcellen
KanamycineFisher Bioreagents25389-94-0Antibioticum voor screening op multigen-plasmide-niveau
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lysogeen agarmedium voor E. coli-kweek
LB Bouillon, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lysogeen vloeibaar medium voor E. coli-kweek
LycopeenCayman chemicalsNC1142173Voor lycopeen-kwantificering
MoClo YTKAddgene1000000061Depositerend Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LVoor plasmide-zuivering uit E.coli
Nanodrop SpectrofotometerThermo ScientificND2000cVoor het meten van nauwkeurige DNA-concentraties
NotI-HFNew England BiolabsR3189SRestrictie-enzym voor lineaire lineaire plasmidelinearisatie
Nourseothricin SulfaatGoldbioN-500-100Antibioticum Selectiemarker voor de pCAS-plasmide gebruikt in deze studie
Phusion HF-reactiebuffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer voor PCR met behulp van Phusion-polymerase
Phusion High Fidelity DNA-polymeraseNew England BiolabsM0530SHoge-fideliteitspolymerase voor alle PCR-reacties
pLM494Addgene100539Plasmid gebruikt om crtI, crtYB en crtE te versterken, gebruikt in deze studie
Kwarts CuvetteThermo Electron10050801Voor het kwantificeren van carotenoïden
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase voor Golden Gate-klonen
ThermocyclerBIO-RAD1851148Voor het uitvoeren van alle PCR- en kloningsreacties
Weefsel HomogenisatorBullet BlenderModel: BBX24Voor homogenisatie van gistcellen
UV-Vis SpectrofotometerThermo ScientificGenesys 150Voor het kwantificeren van carotenoïden
Gist ExtractFisher BioreagentsBP1422-500Component van het gistextract pepton dextrose-medium (YPD)
β-caroteenAlfa AesarAAH6010603Voor β-caroteen-kwantificering

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5(2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622(2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892(2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55(2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16(2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185(2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123(2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131(2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965(2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202(2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932(2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931(2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181(1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golden Gate CloningModular CloningMulti Gene AssemblyYeast MoClo KitType IIS EnzymesEntry Vector CloningTranscription Unit AssemblyFluorescent Protein ScreeningDH5 Alpha TransformationUV Transilluminator Screening

Related Articles