Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Samenvatting

De Golden Gate-kloonmethode maakt een snelle assemblage van meerdere genen in elke door de gebruiker gedefinieerde opstelling mogelijk. Het maakt gebruik van type IIS beperking enzymen die snijden buiten hun herkenning sites en creëren een korte overhang. Dit modulaire kloonsysteem (MoClo) maakt gebruik van een hiërarchische workflow waarin verschillende DNA-onderdelen, zoals promotors, coderingssequenties (CDS) en terminators, eerst worden gekloond tot een invoervector. Meerdere invoervectoren worden vervolgens samengevoegd tot transcriptie-eenheden. Verschillende transcriptie-eenheden verbinden vervolgens met een multi-gen plasmide. De Golden Gate-kloonstrategie is van enorm voordeel omdat het littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk maakt. De hiërarchische workflow maakt het meestal mogelijk om een grote verscheidenheid aan multi-genconstructies te klonen zonder dat er een sequencing nodig is die verder gaat dan invoervectoren. Het gebruik van fluorescerende eiwituitval maakt een eenvoudige visuele screening mogelijk. Dit werk biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de gist modulair klonen (MoClo) kit. We tonen optimale en suboptimale resultaten van multi-gen plasmide assemblage en bieden een gids voor screening op kolonies. Deze kloonstrategie is zeer toepasbaar voor gist metabole engineering en andere situaties waarin multi-gen plasmide klonen vereist is.

Inleiding

Synthetische biologie is gericht op het ontwikkelen van biologische systemen met nieuwe functionaliteiten die nuttig zijn voor de farmaceutische, agrarische en chemische industrie. Het assembleren van grote aantallen DNA-fragmenten op een high-throughput manier is een fundamentele technologie in de synthetische biologie. Een dergelijk ingewikkeld proces kan worden opgesplitst in meerdere niveaus met afnemende complexiteit , een concept dat is ontleend aan fundamentele ingenieurswetenschappen^1,2. In de synthetische biologie assembleren DNA-fragmenten meestal hiërarchisch op basis van functionaliteit: (i) Deelni....

Protocol

OPMERKING: Het hiërarchische kloonprotocol dat in deze toolkit wordt aangeboden, kan worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: 1. Het klonen van deelplasmiden; 2. Klonen van transcriptie-eenheden (TUs); 3. Klonen van multi-gen plasmiden (Figuur 1). Dit protocol begint bij het primerontwerp en eindigt met toepassingen van de gekloonde multi-gen plasmide.

1. Primer ontwerp voor het klonen van het onderdeel plasmide (pYTK001):

1. Ontwerp de voorwaartse en omgekeerde primers met flankerende nucleotiden TTT aan het 5'-uiteinde, een BsmBI-herkenningssite met een extra nucleotide (CGTCTCN), een 4-nucleo....

Resultaten

Hier de resultaten van vier replicerende multi-gen plasmiden voor β-caroteen (geel) en lycopeen (rood) productie. Een integratieve multi-gen plasmide voor het verstoren van de ADE2 locus werd gebouwd, waarvan de kolonies rood zijn.

CDSs klonen in de invoervector (pYTK001)
ERG20 werd versterkt uit het gistgenoom en de drie carotenoïde genen crtE, crtYB, crtI van de .......

Discussie

De moclo gebaseerde kloonkit ontwikkeld door Lee et al. biedt een uitstekende bron voor snelle assemblage van één tot vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide voor replicatie of integratie in het gistgenoom. Het gebruik van deze kit elimineert het tijdrovende kloonknelpunt dat vaak bestaat voor het uitdrukken van meerdere genen in gist.

We hebben vijf verschillende condities getest voor de spijsvertering/ligatie cycli van Golden Gate klonen met T4 DNA ligase. We ontdekten dat 30 cy.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	Voor het lyseren van gistcellen
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component van het gistextract pepton dextrose-medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	een zeer efficiënte versie van BsaI restrictie-enzym
Carbenicilline	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibioticum voor screening op transcriptie-eenheidsniveau
Chloramfenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibioticum voor screening op entry vector-niveau
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Aminozuursupplement van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Koolstofbron van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
Difco Giststikstofbasis zonder aminozuren	BD & Company	291940	Stikstofbron van het volledige synthetische gistmedium (CSM)
dNTP-mix	Promega	U1515	dNTP's voor PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	een zeer efficiënte isoschizomer van BsmBI
Frozen-EZ Gist Transformatie II Kit	Zymo Research	T2001	Voor gisttransformatie
Hexanen	Fisher Chemical	H302-1	Voor carotenoïde-extractie uit gistcellen
Kanamycine	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibioticum voor screening op multigen-plasmide-niveau
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogeen agarmedium voor E. coli-kweek
LB Bouillon, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogeen vloeibaar medium voor E. coli-kweek
Lycopeen	Cayman chemicals	NC1142173	Voor lycopeen-kwantificering
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositerend Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	Voor plasmide-zuivering uit E.coli
Nanodrop Spectrofotometer	Thermo Scientific	ND2000c	Voor het meten van nauwkeurige DNA-concentraties
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restrictie-enzym voor lineaire lineaire plasmidelinearisatie
Nourseothricin Sulfaat	Goldbio	N-500-100	Antibioticum Selectiemarker voor de pCAS-plasmide gebruikt in deze studie
Phusion HF-reactiebuffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer voor PCR met behulp van Phusion-polymerase
Phusion High Fidelity DNA-polymerase	New England Biolabs	M0530S	Hoge-fideliteitspolymerase voor alle PCR-reacties
pLM494	Addgene	100539	Plasmid gebruikt om crtI, crtYB en crtE te versterken, gebruikt in deze studie
Kwarts Cuvette	Thermo Electron	10050801	Voor het kwantificeren van carotenoïden
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase voor Golden Gate-klonen
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	Voor het uitvoeren van alle PCR- en kloningsreacties
Weefsel Homogenisator	Bullet Blender	Model: BBX24	Voor homogenisatie van gistcellen
UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	Voor het kwantificeren van carotenoïden
Gist Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component van het gistextract pepton dextrose-medium (YPD)
β-caroteen	Alfa Aesar	AAH6010603	Voor β-caroteen-kwantificering