Methodenartikel

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

DOI:

10.3791/61995

⸱

14 januari 2021

 ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het cardiovasculaire systeem is een belangrijke speler in de menselijke fysiologie en biedt voeding aan de meeste weefsels in het lichaam; vaten zijn aanwezig in verschillende maten, structuren, fenotypes en prestaties, afhankelijk van elk specifiek doordrenkt weefsel. Het gebied van weefseltechniek, dat tot doel heeft beschadigde of ontbrekende lichaamsweefsels te herstellen of te vervangen, vertrouwt op gecontroleerde angiogenese om een goede vascularisatie binnen de gemanipuleerde weefsels te creëren. Zonder een vasculair systeem kunnen dik ontworpen constructies niet voldoende worden gevoed, wat kan leiden tot celdood, slechte engraftment en uiteindelijk falen. Het begrijpen en beheersen van het gedrag van gemanipuleerde bloedvaten is dus een uitstekende uitdaging in het veld. Dit werk presenteert een systeem met hoge doorvoer dat het mogelijk maakt om georganiseerde en herhaalbare scheepsnetwerken te creëren voor het bestuderen van scheepsgedrag in een 3D-steigeromgeving. Dit tweestaps zaaiprotocol laat zien dat vaten binnen het systeem reageren op de steigertopografie en onderscheidend kiemgedrag vertonen, afhankelijk van de geometrie van het compartiment waarin de vaten zich bevinden. De verkregen resultaten en het begrip van dit hoge doorvoersysteem kunnen worden toegepast om betere 3D-bioprinted steigerconstructieontwerpen te informeren, waarbij de fabricage van verschillende 3D-geometrieën niet snel kan worden beoordeeld bij het gebruik van 3D-printen als basis voor cellulaire biologische omgevingen. Bovendien kan het begrip van dit systeem met hoge doorvoer worden gebruikt voor de verbetering van snelle geneesmiddelenscreening, de snelle ontwikkeling van coculturenmodellen en het onderzoek van mechanische stimuli op de vorming van bloedvaten om de kennis van het vasculaire systeem te verdiepen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebied van weefseltechniek vordert snel in de richting van de fabricage van constructies om ontbrekende of beschadigde organen en weefsels te vervangen1. Volledig functionele constructies moeten echter nog worden bereikt, deels omdat het genereren van operationele vasculaire netwerken voor weefselvoeding een uitstekende uitdaging blijft. Zonder de juiste vascularisatie zijn gemanipuleerde weefsels beperkt tot een passief diffusietransport van zuurstof en voedingsstoffen, waardoor de maximale levensvatbare weefseldikte wordt beperkt tot de diffusielimiet, ongeveer 200 μm2. Dergelijke diktes zijn niet geschikt om grote weefseldefecten te herstellen of voor volledige orgaanfabricage, waardoor de aanwezigheid van functioneel vasculair netwerk een verplicht kenmerk is voor functionele en implanteerbare weefsels3.

Het vasculaire systeem bestaat uit een grote verscheidenheid aan bloedvaten, met verschillende groottes, fenotypes en organisatie, nauw verwant aan het gastheerweefsel. Inzicht in het gedrag, de respons en de migratiebeslissingen van de ontwikkelende en ontkiemende vaten kan hun integratie in gemanipuleerde weefsels instrueren4. Momenteel is de meest voorkomende aanpak voor het creëren van in vitro vasculaire netwerken het combineren van endotheelcellen (EC's) met ondersteunende cellen (SCs, met de mogelijkheid om te differentiëren in muurschilderingscellen), gezaaid in een driedimensionale micro-omgeving. Deze omgeving biedt chemische en fysische aanwijzingen om de cellen in staat te stellen zich te hechten, te verspreiden en zelf te assembleren in scheepsnetwerken2,5,6,7,8. Wanneer ze worden gekweekt, scheiden SCs extracellulaire matrix (ECM) eiwitten af en bieden ze mechanische ondersteuning aan de EC's, die de buisvormige structuren vormen. Bovendien bevordert een kruisinteractie tussen beide celtypen tubulogenese, het ontkiemen van vaten en migratie, naast de rijping en differentiatie van de SCs in α-gladde spier actine-expresserende (αSMA) mural cellen4. De ontwikkeling van scheepsnetwerk wordt meestal bestudeerd in 3D-omgevingen die zijn gemaakt met behulp van hydrogels, poreuze polymere steigers of een combinatie daarvan. De laatste optie biedt ook een celvriendelijke omgeving en de vereiste mechanische ondersteuning voor zowel de cellen als de ECM9.

Er is veel werk verricht om de vasculaire ontwikkeling te bestuderen, waaronder het co-cultiveren van de cellen op hydrogels10, hydrogels-steigercombinaties11,12, 2D-platforms en microfluïdische apparaten13. Hydrogels kunnen echter gemakkelijk worden vervormd door de door cellen uitgeoefende krachten14, terwijl 2D - en microfluïdische systemen er niet in slagen een dichter bij de natuur gebrachte omgeving te creëren om een meer extrapoleerbare respons te verkrijgen15,16. Inzicht in hoe vormende vaten reageren op hun omgeving kan kritisch inzicht geven dat het mogelijk maakt om ontworpen omgevingen te fabriceren met het vermogen om de ontwikkeling van het schip op een voorspelbare manier te begeleiden. Het begrijpen van vasculaire vormingsverschijnselen is vooral van cruciaal belang om gelijke tred te houden met de snelle opkomst van submicron-tot-micron schaal fabricagetechnieken, zoals stereolithografie, digitale projectielithografie, continue vloeibare interfaceproductie, 3D smelt-elektro jetwriting, oplossingsgebaseerd 3D-elektrojetschrift en opkomende bioprinttechnieken17,18,19,20,21. Het afstemmen van de controle van deze microproductietechnieken met een verdiept begrip van vasculaire biologie is de sleutel tot het creëren van een geschikte ontworpen vasculatuur voor een doelweefsel.

Hier presenteren we een 3D-systeem om de reactie van nieuwe vormende en ontspruitende vaten op de omringende steigergeometrie te bestuderen, waarbij ze hun kiemoorsprong en daaropvolgende migratie observeren22. Door gebruik te maken van 3D-steigers met gemeleerde compartimentgeometrieën en een tweestaps zaaitechniek, slaagden we erin om op een duidelijke en eenvoudig te analyseren manier zeer georganiseerde vasculaire netwerken te creëren. De tessellated geometrieën bieden een systeem met hoge doorvoer met afzonderlijke eenheden met vaten die reageren op hun lokale omgeving. Met behulp van veelkleurige EC's volgden we de oorsprong van de kiemvorming en de daaropvolgende migratiepatronen, gecorreleerd met de compartimentgeometrie en de SCs-locatie22.

Hoewel het voorgestelde protocol is voorbereid om de effecten van geometrische signalen op vascularisatiegedrag te analyseren, kan deze aanpak worden uitgebreid en toegepast op een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen. De tessellated scaffold en de gemakkelijk te beeldbare netwerken maken een eenvoudige analyse van verschillende EC's en SCs-interactie mogelijk, de toevoeging van specifieke orgaancellen en hun interactie met de vasculaire netwerken, medicijneffect op vasculaire netwerken en meer. Ons voorgestelde systeem resulteert zeer veelzijdig en van eenvoudige fabricage en verwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tessellated steigerfabricage

OPMERKING: Fotolithografie is een wijdverspreide techniek die gespecialiseerde apparatuur vereist die meestal is ondergebracht in een nanofabrication-faciliteit / laboratorium. De methode in dit protocol werd zoveel mogelijk gealdaliseerd voor het publiek; afhankelijk van de apparatuur waarover de lezer beschikt, kunnen echter kleine wijzigingen in de procedures nodig zijn. We raden aan om deze procedures uit te voeren in een schone ruimte in een nanofabrication-faciliteit om de hoogste proceskwaliteit te garanderen. Voordat u begint, moet u toegang krijgen tot een maskeruitlijner (of een uv-belichtingsopstelling), een spincoater, kookplaten, een oplosmiddelwasstation, een fotomasker en een plasmareiniger. De oplosmiddelen en chemicaliën die in de procedure worden gebruikt, zijn gevaarlijk, dus wees uiterst voorzichtig om blootstelling aan chemicaliën te voorkomen. Identificeer bij het ontwerpen van het fotomasker welke siliconenwafels en fotomaskers compatibel zijn met de spincoater en maskeruitlijner. Bovendien is de fotoresist die zich naar de randen van de siliciumwafel bevindt, meestal vervormd door hantering; maak daarom de ontwerpen naar het middengebied van de wafer.

  1. Bereid steigers voor met behulp van een fotolithografietechniek met de geselecteerde geometrie van belang.
    1. Reinig de siliconen wafer voordat u de coating spint. Dit kan met plasmareiniging of een techniek op basis van oplosmiddelen. Volg bij plasmareiniging de standaardprocedure van het instrument voor operationele details. Spuit met gecomprimeerd stikstofgas en inspecteer de wafer om er zeker van te zijn dat deze vrij is van vuil voordat u gaat spinnen. Deze wafer zal dienen als substraat waarop de steigers worden gemaakt.
      OPMERKING: Begin voor het beste resultaat met een verse wafel. Wafers kunnen worden hergebruikt, maar moeten vrij zijn van oude fotoresistentie, oppervlaktedefecten en puin. Het is handig om wafer-pincet te gebruiken voor het hanteren.
    2. Centreer een siliconen wafer op de spin-coater chuck met behulp van een geleider. Draai de wafer kort om er zeker van te zijn dat deze goed op de boorkop is gecentreerd, pas deze zo nodig aan totdat deze goed gecentreerd is. Dit moet gebeuren telkens wanneer een wafer op de spincoater wordt geplaatst. Doseer 1-4 ml van het lift-off reagens op de wafer (dit is afhankelijk van de grootte van de wafer). Ongeveer 2 ml lift-off reagens werkt goed voor een 4-inch wafer.
      1. Stel de draailaagspreidingssnelheid in op 500 tpm gedurende 5 seconden en de spinsnelheid op 1000 tpm gedurende 30 seconden en draai vervolgens het lift-off reagens. Inspecteer de wafer om er zeker van te zijn dat deze een gelijkmatige coating over de wafer heeft. Alle brokstukken die op de wafer achterblijven, zullen op dit moment heel duidelijk zijn. Steigers in een gebied met puin zullen waarschijnlijk onbruikbaar zijn. Na het spinnen van de coating overbrengen naar een hete plaat en 1 minuut bakken op 200 °C.
    3. Herhaal de vorige stap nog twee keer voor in totaal drie coatings.
    4. Spin-coat de lift-off reagens gecoate silicium wafer met SU-8 2050 fotoresist tot het verkrijgen van een dikte van ongeveer 100 μm.
      1. Doseer 1 ml weerstand voor elke 25 mm substraatdiameter.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u bellen vermijdt tijdens het gieten van de weerstand. Voor SU-8 2050 werkt het gieten van ongeveer een cirkel met een diameter van 2 inch bij gebruik van een 4-inch siliciumwafel goed.
      2. Spin-coat de SU-8 2050. Verspreid bij een snelheid van 500 tpm gedurende 5 seconden, gevolgd door een draaisnelheid tussen 1700 en 1800 tpm om een dikte van ongeveer 100 μm te bereiken.
      3. Optioneel: Laat de spincoating wafers na het spinnen 's nachts ontgassen op een vlak oppervlak dat beschermd is tegen licht voordat u het voorbakken. Dit kan helpen om de weerstand van eventuele bubbels te verwijderen en defecten te laten nivelleren.
        OPMERKING: De werkelijke dikte van de weerstand en de resulterende steigers kunnen variëren met de parameters van de gebruikersfout en de apparatuur. Daarom moet de dikte van de steigers later worden gecontroleerd, in stap 1.6. Pas de procedures voor spincoating dienovereenkomstig aan om de gewenste dikte te bereiken.
    5. Bak de wafels vóór blootstelling gedurende 10 minuten op 65 °C en vervolgens 40-50 minuten op 95 °C. Test vóór blootstelling het oppervlak van de weerstand door met een pincet op de rand te drukken om er zeker van te zijn dat het niet langer smakeloos/stroperig is. Het is handig om het wafeltje van de kookplaat te trekken en het 0,5-1 minuut te laten afkoelen voordat u de kleefkracht beoordeelt.
      OPMERKING: Trage oprijtijden (verwarmen en koelen) kunnen helpen om kromtrekken van de steigers te voorkomen.
  2. Stel de fotoresist bloot aan UV-licht (350-400 nm) door middel van een fotomasker met een belichtingsenergie van 215-240 mJ/cm2 voor een weerstandsdikte van 85 - 110 μm. Raadpleeg de richtlijnen van de fotoresist fabrikant voor aanbevolen correlaties tussen blootstelling en energiedikte.
    1. Zorg ervoor dat de belichting zodanig is gekalibreerd dat de energie wordt gecontroleerd. Pas de belichtingstijd zo nodig aan om de gewenste belichtingsenergie te bereiken. Bovendien kunnen maskeruitlijners verschillende belichtingsmodi mogelijk maken: vacuümcontact, hard contact, zacht contact en nabijheidscontact (specifieke termen kunnen variëren). Over het algemeen hebben deze invloed op de resolutie en de uitlijning van functies. De auteurs gebruikten meestal een "hard contact"-modus.
    2. Voor kleine objecten of meerdere lagen, waarbij uitlijning belangrijk is, moet u de belichtingsmodi en maskeruitlijnprocedures zorgvuldiger overwegen. Houd bij het aanpassen van de diktewaarde rekening met de hoogte van de weerstand. Raadpleeg de standaardprocedures van uw maskeruitlijner voor meer informatie over de werking.
      OPMERKING: Het ontwerp van het fotomasker bepaalt de grootte van de steigers, de geometrie van het compartiment en het aantal steigers dat per batch wordt verkregen. Het gebruik van een hardglas- of kwartsfotomasker levert de hoogste resolutie op; een zacht polymeer transparant filmfotomasker kan echter over het algemeen worden gebruikt voor deze grote functiegroottes (>10 μm). Het gebruik van een filmfotomasker kan leiden tot topografische kenmerken langs de z-as van de steigerporiën als gevolg van een slechtere functieresolutie. Dit kan mogelijk invloed hebben op het gedrag van cellen. Controleer de gewenste resolutie raadpleeg degene die het fotomasker produceert om ervoor te zorgen dat de gewenste resolutie wordt bereikt.
  3. Bak de wafel onmiddellijk na UV-blootstelling gedurende 2-5 minuten op 65 °C en vervolgens op 95 °C gedurende 8-10 minuten.
  4. Ontwikkel de steigers om onontwikkelde weerstand te verwijderen.
    1. Dompel de steigers gedurende 7-10 minuten onder met een laag volume SU-8 developer-oplossing om onontwikkelde weerstand op te lossen.
    2. Afspoelen met isopropylalcohol (IPA).
    3. Droog wafeltje met samengeperste stikstof.
      OPMERKING: Zorg er tijdens stap 1.4 voor dat de steigers niet voortijdig worden losgelaten. Lage volumes van ontwikkelaar en zachte behandeling zijn nodig om dit te bereiken.
  5. Bak de wafels na de ontwikkeling 150 °C hard op 150 °C gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Na hard bakken kan het uitschakelen van de kookplaat om de wafels heel langzaam te laten afkoelen voordelig zijn om kromtrekken /krullen van de laatste steigers te voorkomen.
  6. Optioneel: Na het hard bakken en voorafgaand aan het opstijgen, de steigerdikte beoordelen, omdat de steigers nog steeds voorzichtig aan het oppervlak van de wafer moeten worden vastgekleefd. Voor deze procedure werkt contactprofilering goed; elke geschikte methode kan echter worden gebruikt.
  7. Til de steigers van de wafel.
    1. Dompel de steigers onder in SU-8 developer om ze onmiddellijk van de wafer af te tillen. Als steigers niet opstijgen, duwt u de steigers voorzichtig met een wafer-pincet.
    2. Verwijder overtollige ontwikkelaars.
    3. Breng de steigers over in een nieuwe container en dompel ze onder in isopropylalcohol. Spoel minimaal 6 keer in IPA om ervoor te zorgen dat alle ontwikkelaars zijn verwijderd.
  8. Droog de steigers minimaal een week voor gebruik aan de lucht.

2. Steiger fibronectine coating

  1. Dompel voor desinfectie de steigers minimaal 15 minuten onder in 70% ethanol (v/v) en was ze voor gebruik 2 keer in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    LET OP: De SU-8 steigers zijn broos en kunnen gemakkelijk breken. Behandeling wordt aanbevolen met behulp van stompe en gebogen tangen, en ze moeten met de grootste zorg worden behandeld. Eenvoudigere hantering kan worden bereikt door de steigers in vloeistof onder te dompelen, om elektrostatische interacties tussen de steigers en het oppervlak te voorkomen.
  2. Bereid een verdunning van 50 μg/ml menselijk fibronectine in PBS en bedek de steigers door eiwit adsorptie.
    1. Meng 1,5 μL fibronectinevoorraadoplossing (1 mg/ml) met 28,5 μL PBS per te zaaien steiger. Bereid bij voorkeur slechts één fibronectineverdunning voor die voor alle steigers moet worden gebruikt om pipetfouten te voorkomen.
      1. Meng voor 10 steigers 15 μL stamfibtineoplossing in 285 μL PBS, wat neerkwam op een totaal van 300 μL van 50 μg/ml fibronectineverdunning.
    2. Plaats de steigers schaars op een hydrofoob oppervlak (d.w.z. niet-weefselkweek (nonTC) 10 cm schotel) en bedek elke steiger met 30 μL fibronectineverdunning bereid in stap 2.2.1.
      LET OP: Zorg ervoor dat er geen bellen in de steigercompartimenten vastzitten. Als er bellen aanwezig zijn, kunnen ze worden verwijderd door de steiger voorzichtig in de druppel te schudden of licht te pipetten.
    3. Vervang het deksel van de plaat en plaats de met fibronectine bedekte steigers minimaal een uur in een incubator met een luchtvochtigheid van 37 °C en 100% vochtigheid.
    4. Spoel na incubatie de steigers lichtjes af in PBS om fibronectineresten te verwijderen. De steigers kunnen tot een week voor gebruik in PBS bij 4 °C worden bewaard.

3. Endotheliale cellen zaaien

  1. Bereid EC-medium door het basale medium te mengen met de bijbehorende mediumkitcomponenten, waaronder een antibioticaoplossing (Pen/Strep), foetale runderserum (FBS) en endotheelcelgroeisupplementen, zoals aangegeven door de fabrikant.
  2. Maak een menselijke vet microvasculaire endotheelcel (HAMEC) suspensie in EC medium met een concentratie van 4 x 106 cellen/ml.
    OPMERKING: Real-time beeldvorming kan worden uitgevoerd als de gebruikte endotheelcellen eerder zijn getransfecteerd om een fluorescerend eiwit uit te drukken, of vooraf gekleurd met behulp van een niet-toxische cytoplasmatische membraankleurstof (verder aangeduid als gelabelde EC's).
  3. Plaats met behulp van een tang één fibronectine-gecoate steiger per put op een niet-TC 24-put plaatput.
  4. Bedek elke steiger met 25 druppels HAMEC-suspensie van 25 μL. Pas op dat u de ophanging niet van de steiger laat wegvloeien, omdat dit de celhechting kan belemmeren.
  5. Plaats het deksel op de plaat en plaats het in een incubator op 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid. Laat minimaal 60 minuten en maximaal 90 minuten incuberen.
    OPMERKING: Tijdens de incubatie verbetert het plaatsen van de plaat op een orbitale shaker in de incubator de celbevestiging op de wanden van de steiger. De orbitale shaker mag niet meer dan 5 tpm worden ingesteld.
  6. Vul na incubatie elke put met 700 μL EC-medium met behulp van een pipet.
    OPMERKING: Verwacht EC's aan de onderkant van de put te zien, omdat sommige cellen zich niet aan de steiger hechten en door de holtes van de steiger vallen.
  7. Incubeer de endotheelsteigers totdat EG-samenvloeiing kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie op de wanden van de steiger (bij gebruik van gelabelde EC's), of gedurende 3 dagen (bij gebruik van niet-gelabelde EC's), wat voldoende tijd biedt om EG-samenvloeiing te bereiken. Verander het medium om de andere dag.

4. Steun cel zaaien en co-cultuur

  1. Bereid tandpulpstamcel (DPSC) medium (DPSCm) door 500 ml gemodificeerd Eagle medium (low-glucose DMEM), 57,5 ml FBS, 5,75 ml niet-essentiële aminozuren (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX en 5,75 ml penicilline-streptomycine-nystatineoplossing te mengen.
  2. Breng de endotheelsteigers over in een nieuwe niet-TC 24-putplaat om EC's die met een tang aan de bodem van de putten zijn bevestigd, weg te gooien.
    1. Gooi alle media van de huidige plaat met behulp van een pipet van 1 ml of vacuümzuiging. Zorg ervoor dat u het vacuüm niet recht op de steiger aanbrengt.
    2. Plaats één steiger per put, bij voorkeur in het midden van de put om te voorkomen dat vloeistof naar de wanden loopt als gevolg van oppervlaktespanningseffecten. Droog het gebied rondom de steiger met lichtvacuüm, maar vermijd volledige droging van de steiger.
  3. Bereid een DPSC-suspensie voor in fibrine pre-geloplossing.
    1. Verdun trombine- en fibrinogeenvoorraadoplossingen met PBS tot het verkrijgen van een eindconcentratie van respectievelijk 5 U/ml en 15 mg/ml.
    2. Bereid een suspensie van 8 x10 6 DPSC/ml voor in de trombineverdunning van 5 U/ml en verdeel in afzonderlijke eppendorfs 12,5 μL van die suspensie per te zaaien steiger.
    3. Stel een pipet van 5-50 μL (of iets dergelijks) in op 12,5 μL en vul deze met de 15 mg/ml fibrinogeenoplossing.
    4. Zonder de punt te verwijderen, zet u de pipet op 25 μL. Het materiaal in de tip moet omhoog komen en een leeg volume in de richting van de tipopening laten.
    5. Druk langzaam op de zuigerknop totdat de vloeistof de tipopening bereikt, maar niet uitlekt. Houd de zuiger in deze positie en plaats de tip in een van de microcentrifugebuizen met de cellen in trombinesuspensie en zorg ervoor dat de tip in contact komt met de vloeistof.
      LET OP: De fibrine crosslinking begint direct nadat de trombine en fibrinogeen in contact komen. De volgende stap moet snel worden uitgevoerd.
    6. Laat de zuigerknop voorzichtig los en trek de celsuspensie in de punt. Meng beide materialen grondig en vermijd bubbelvorming.
  4. Verdeel de gemengde materialen snel over een endotheelsteiger. Herhaal de vorige stappen voor elke steiger en zorg ervoor dat u altijd van punt wisselt tussen het gebruik om onverwachte vorming van fibrinegel in de punt te voorkomen.
  5. Vervang het deksel van de plaat en incubeer de steigers gedurende 30 minuten bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid.
  6. Vul na incubatie elke put met 1 ml 1:1 DPSC en EC-medium.
    1. Cultuur voor 1 week, veranderen medium om de andere dag.
    2. Verwijder tijdens de kweek het medium uit de put en beeld de constructies op verschillende tijdstippen met behulp van een confocale microscoop om de vasculaire ontwikkeling of een andere parameter van belang te bestuderen.
      OPMERKING: Deze stap kan alleen worden uitgevoerd als het experiment wordt uitgevoerd met gelabelde EC's. Zie stap 6 - OPMERKING voor verdere verduidelijking.

5. Immunofluorescente kleuring voor karakteristieke vasculaire markers

OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd in dezelfde putten waar de constructies werden gekweekt. Het is van cruciaal belang om er altijd voor te zorgen dat de oplossingen de steigers volledig bedekken. Bovendien wordt, indien mogelijk, het uitvoeren van de stappen op een orbitale shaker aanbevolen, hoewel niet verplicht.

  1. Gooi op dag 7 de media uit de putten en spoel de steigers af door PBS aan de putten toe te voegen en deze met vacuüm te verwijderen.
  2. Bevestig de steigers door 4% paraformaldehyde toe te voegen gedurende 20 minuten. Was 3 keer in PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  3. Permeabiliseer de vaste cellen met 0,3% Triton-X in PBS (v/v) gedurende 15 minuten. Was 3 keer in PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  4. Bereid een 5% runderserumalbumine (BSA) in PBS (w/v) blokkeeroplossing en bedek de steigers. Laat 1 uur op kamertemperatuur staan.
    OPMERKING: Alle benodigde oplossingshoeveelheden zijn afhankelijk van het aantal te beitsen steigers. Bereid de oplossingen indien nodig voor met behoud van de vermelde concentraties.
  5. Bereid de primaire antistoffenkleuringsoplossing voor en breng deze aan.
    1. Verdun konijn anti-von Willebrand factor (vWF) antilichaam 1:150 en muis anti-SMA antilichaam 1:50 in verse blokkerende oplossing.
      OPMERKING: Andere endotheelcellenmarkers, zoals CD31 of VE-Cadherin, kunnen worden gebruikt.
    2. Bedek de steigers met de primaire antistoffenoplossing en houd ze 's nachts op 4 °C. Was drie keer in PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  6. Bereid de secundaire antistoffenkleuringsoplossing voor en breng deze aan.
    1. Verdun geitenantimuis Cy3 antilichaam 1:150 en geit anti-konijn Alexa-Fluor 488 1:400 in PBS.
    2. Bedek de steigers met de secundaire antistoffenoplossing en incubeer gedurende minimaal 3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was 3 keer in PBS, 5 minuten per wasbeurt. Houd gebeitst steiger in 0,3% PFA in PBS (v/v) tot een maand.

6. Steiger confocale beeldvorming en scheepsontwikkelingsanalyse

OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op de vaste en bevlekte steigers op het gekozen eindtijdpunt of, indien fluorescerende cellen werden gebruikt, tijdens de celkweekperiode zonder dat het experiment hoeft te worden beëindigd. Voor de laatste wordt aanbevolen om specifieke tijdspunten in te stellen; dit werk toont dag 0 (vóór het zaaien van SCs) en dag 1, 3, 5 en 7 na het zaaien van SCs (figuur 3A).

  1. Beeld de steigers in met een confocale microscoop met een 5X lens en een zoom van 0,5 en het volledige z-bereik van de steiger. Dit maakt het mogelijk om 9 afzonderlijke compartimenten vast te leggen voor de vierkante en cirkelvormige geometrieën, of 8 volledige compartimenten voor de zeshoekige geometrie. Beeld het fluorescerende signaal en het verzonden licht in, om zowel de netwerkstructuur van het vat als de geometrie van het compartiment te krijgen (figuur 3A).
  2. Snijd met ImageJ (of andere beeldverwerkingssoftware) elk afzonderlijk compartiment bij; voor dit proces zijn alleen de markers van vasculaire netwerken relevant. Verwijder een vat dat zich niet in het compartiment bevindt. Maak een projectie met maximale intensiteit en sla elk afzonderlijk bijgesneden compartiment op als een TIFF-afbeelding.
    1. Druk in ImageJ op Bestand > Openen en selecteer de gewenste TIFF-afbeelding met verschillende compartimenten. Het beeld moet ten minste twee kanalen hebben, het fluorescerende vatennetwerk en het verzonden lichtbeeld.
    2. Selecteer op de werkbalk het gereedschap Polygoonselectie. Selecteer het verzonden lichtkanaal. Klik op een van de hoeken van het zeshoekige compartiment, op de interface tussen het compartimentgebied en de steigerwand, dit zal de maskerdefinitie starten. Klik verder op de volgende hoeken in een opeenvolgende volgorde totdat de beginhoek is geselecteerd en sluit het masker.
      OPMERKING: Deze uitleg is van toepassing op een zeshoekig compartiment. Wanneer het compartiment vierkant of cirkelvormig is, gebruikt u respectievelijk het gereedschap Rechthoek of Ovaal om een geschikt masker te maken. Ongeacht de vorm, monteer altijd het masker om de binnenwand van de steiger te volgen.
    3. Klik op Analyze > Tools > ROI manager. Klik in de ROI-manager (ROI, regio van belang) op de knop Toevoegen om het gemaakte masker op te slaan. Het nieuwe masker verschijnt in de linkerlijst. Met deze stap kan de analyse consistent zijn tussen verschillende afbeeldingen.
      OPMERKING: In de ROI-manager is het mogelijk om een bestand met alle gemaakte maskers op te slaan door op Meer > Opslaante klikken. Kies in het selectievenster Opslaan een naam en locatie en sla het ROI-bestand op. Om het masker op te halen, klikt u in de ROI-manager op Meer > Openen en kiest u het gewenste .roi-bestand.
    4. Selecteer de afbeelding van het fluorescerende vatnetwerk en klik op Bewerken > Wissen buiten. Alleen de afbeelding in het masker blijft over, terwijl de rest wordt geëlimineerd.
    5. Klik met het openen van de gewiste netwerkafbeelding op Afbeelding > Dupliceren. Schrijf in het pop-upvenster Dupliceren de naam van de afbeelding. Als de dubbele hyperstack is geselecteerd, schakelt u deze uit en klikt u op OK. Er wordt een nieuwe afbeelding gemaakt die alleen de bijgesneden fluorescerende scheepsnetwerken bevat.
    6. Sla de bijgesneden afbeelding op door te klikken op Bestand > Opslaan als > Tiff. Kies de naam en map en klik op OK.
  3. Analyseer de vasculaire ontwikkeling op de bijgesneden afbeeldingen.
    1. Download en installeer de analytische vrije software AngioTool, die kwantitatieve tools biedt om een verscheidenheid aan vasculaire parameters te kwantificeren. De software is verkrijgbaar bij het volgende adres https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Stel de schaalwaarde van de afbeeldingen in om resultaten in millimetereenheden te verkrijgen en een afbeelding te laden.
      1. Klik op het tabblad Instelling en vul de afstand in pixels en afstand in mm in met representatieve waarden van de genomen afbeeldingen. Met behulp van de hierboven genoemde beeldparameters zijn de te vullen waarden 400 pixels per 1 mm.
      2. Druk op de knop Afbeelding openen en blader naar de afbeelding van belang.
    3. Kies de analyseparameters om de ontwikkeling van vaten te kwantificeren op het tabblad Analyse.
      1. Schakel onder het veld Diameter en intensiteit van het vat alle huidige markeringen uit de bovenste selectieschakelaar uit en activeer de markering die het getal 3 vertegenwoordigt.
      2. Verplaats onder het veld Diameter en intensiteit van het vat, op de onderste bereikkiezer, de onderste bereikmarkering naar 60 en laat de hoge rangermaker op 255 staan.
      3. Activeer de doos Kleine deeltjes verwijderen en zet de markering op 100.
      4. Selecteer onder het veld Voorkeuren voor opslaande naam en locatie van het spread sheet-bestand waarin de resultaten worden opgeslagen en druk op de knop Analyse uitvoeren. Als het vak Resultaatafbeelding opslaan is geselecteerd, genereert en slaat Angiotool een nieuwe jpeg-afbeelding op met de gekwantificeerde parameters van het scheepsnetwerk.
        OPMERKING: Voor elke uitgevoerde analyse zonder de bestandsnaam van het spreadblad te wijzigen, wordt een nieuwe rij toegevoegd onder aan het bestand, met de nieuw verkregen resultaten.
  4. Organiseer de gegevens en voer een statistische analyse uit.
    1. Voor alle verwerkte afbeeldingen kiest u de parameter van belang uit het spreadblad (bv. totale lengte van het vaartuig en oppervlakte vanhet vaartuig ) en voert u deze in een statistische analysesoftware in om de verkregen resultaten naar behoren te bestuderen ( figuur3C).

7. Timelapse beeldvorming voor kieming oorsprongsdetectie en migratietracking

  1. Als alternatief, om de steigers in de incubator te cultiveren zoals beschreven in stap 4.6, stelt u een confocale microscoopcultuurkamer in op 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid.
    1. Plaats de plaat met de volledig gezaaide steigers in de confocale microscoopkamer en stel de beeldparameters in op de gewenste waarden.
    2. Stel het beeldopname-interval in op 30 minuten en de totale beeldtijd van 72 uur. Dit maakt het mogelijk om de timelapse volledig uit te voeren zonder dat er een gemiddelde wijziging nodig is.
      LET OP: In het geval dat een langere timelapse-beeldvorming gewenst is, moet een zorgvuldige positiekalibratie worden uitgevoerd om de oorspronkelijke beeldvormingslocatie te kunnen ophalen, omdat voor middelgrote veranderingen de plaat uit de confocale incubator en in de steriele biologische kap moet worden verwijderd.
      OPMERKING: De loslating van de steigerwanden en de vorming van buisvormige constructies begint binnen het eerste uur na het zaaien van de SCs (stap 4) en kan tot 50 uur duren. Na de eerste buisvorming beginnen nieuwe spruiten vanuit de omliggende vaten in het compartiment te migreren. Het ontkiemen en de daaropvolgende netwerkrenovatie zal gedurende het hele experiment ongeveer tot dag 10, wanneer de scheepsnetwerken stabiel worden, worden voortgezet22. Gebruik deze informatie om het beginpunt en de tijdstap voor timelapse dienovereenkomstig te kiezen.
  2. Sla het volledige timelapse-filmbestand op als een TIFF-reeks.
  3. Open ImageJ en klik op Bestand > Importeer > afbeeldingsvolgorde en selecteer uw bestanden. Hiermee wordt uw TIFF-reeks als een film geopend.
  4. Open de plug-in Handmatig bijhouden door te klikken op Plug-ins > Handmatige tracking. Hiermee wordt het venster Tracking geopend.
  5. Observeer de film en selecteer het te volgen vaartuig. Besteed aandacht aan de oorsprong en migratie.
  6. Activeer het vak Parameters weergeven en voer de 30 minuten voor tijdsinterval in. De x/y-kalibratie is afhankelijk van de pixelhoeveelheid die tijdens de beeldvorming is geselecteerd.
  7. Ga verder met het handmatig volgen van de ontkiemende vaten vanaf de steigercontour.
    1. Druk op de knop Track toevoegen. Druk op het eerste frame van de film op de locatie van het te volgen schip. Hierna verandert de film automatisch naar het volgende frame.
    2. Klik op de afbeelding van het tweede frame waar het schip zich bevindt. Nogmaals, de film verandert automatisch in het volgende frame.
    3. Ga verder met hetzelfde schip totdat de volledige migratietracking is voltooid.
    4. Klik in het trackingvenster op de overlay dots & lijnen om een visueel pad van de scheepsmigratie op de film in te drukken. Hiermee wordt een kopie van de film geopend met een stip die de huidige positie van de tracker weergeeft en een lijn die het vorige pad weergeeft.
    5. Klik op de knop End Track om de opname van de huidige scheepsbeweging af te ronden.
    6. Klik nogmaals op de knop Track toevoegen om opnieuw te beginnen met een nieuw schip. Wanneer u dit doet, veranderen de lijn- en puntmarkeringen automatisch hun kleur voor het nieuwe vat. Herhaal dit totdat alle gewenste vaten zijn gevolgd.
      OPMERKING: De x/y-locatie, de snelheid van het vat en de verplaatste afstand kunnen worden opgehaald uit het pop-upvenster Resultaten. Elk vaartuig wordt geïdentificeerd aan de linkerkant van de kolom. Deze gegevens kunnen worden gekopieerd en geplakt in een spread sheet om verdere analyse uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol, met behulp van stereolithografietechnieken, maakt het mogelijk om mozaïeksteigers van SU-8 fotoresist te fabriceren. Steigers met verschillende compartimentgeometrieën (vierkanten, zeshoeken en cirkels) en zeer nauwkeurige en herhaalbare kenmerken werden verkregen (figuur 1).

figure-results-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De behoefte aan een rijke vasculatuur in ingebed in gemanipuleerde weefsels is van cruciaal belang voor de overleving van de constructie en de juiste functie1. Hoewel engineering van het vasculaire systeem de focus is geweest van een enorme hoeveelheid onderzoek, is er nog veel over om te onderzoeken en te begrijpen24. In het bijzonder moet de microvasculatuur zich bij het recreëren van een specifiek weefsel gedragen en dienovereenkomstig organiseren12

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de University of Michigan - Israel Partnership for Research. De auteurs willen Uri Merdler, Lior Debbi en Galia Ben David bedanken voor hun grote hulp en steun, Nadine Wang, Ph.D. en Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. van de Lurie Nanofabrication Facility aan de Universiteit van Michigan, evenals Luis Solorio, Ph.D. voor verhelderende discussies over fotolithografietechnieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Angiotool freewareNIH-CCRGratis downloaden op https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum ProbuminMillipore82-045-1
TandpulpkliercellenLonzaPT-5025
ECM-medium + kogelkitSciencell#1001
Ethanol 96%Gadot-Group64-17-5
Evicel fibrine-sealantJohnson&JohnsonEVB05ILBiedt zowel thrombine als fibrinogeen (BAC2) oplossingen
GlutaMAXGibco35050061
Geiten anti-muis Cy3 antilichaamJackson115-166-072
Geiten anti-konijn Alexa-Fluor 488Thermo- Fisher ScientificA11034
Menselijke adipocytcellenSciencell#7200
Menselijke fibronectineSigmaF0895-5MGVoorraadconcentratie: 1 mg/mL
ImageJNIHGratis downloaden op https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcoholGadot-Group67-63-0
Lift-off reagentKayaku Advanced Materials, IncG112850Commerciële naam Omnicoat
Laag-glucose DMEMBiological Industries01-050-1A
Muis anti-SMA antilichaamDakoM0851
NEAAGibco11140068
Paraformaldehyde oplossing 4% in PBSChemCruzSC-281692
Penicilline-Streptomycine-Nystatine oplossingBiological Industries03-032-1B
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)SigmaP5368-10PAK
Konijn anti-vWF antilichaamAbcamab9378
SiliciumwafeltSilicon Valley Microelectronics (SVM)Wafels 4", Type N-1-10, 500-550 microns dik
SU-8 2050 fotoresistKayaku Advanced Materials, IncY11058
SU-8 ontwikkelaarKayaku Advanced Materials, IncY020100
Tryton-X 100BioLab LTD57836

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2(2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196(2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003(2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898(2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335(2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5(2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vorming van vasculair netwerkendotheelcellenconfocale microscopiefibronectine coatingSU 8 fotolakvatrijpingondersteuningscellen

Gerelateerde artikelen