Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan adipocytdifferentiatie en functie heeft veel geprofiteerd van het gebruik van vereeuwigde witte preadipocytcellijnen. Deze gekweekte cellijnen hebben echter beperkingen. Ze vangen niet volledig het diverse functionele spectrum van de heterogene adipocytpopulaties waarvan nu bekend is dat ze bestaan in witte vetdepots. Om een meer fysiologisch relevant model te bieden om de complexiteit van wit vetweefsel te bestuderen, is een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd om gelijktijdige isolatie van primaire witte en bruine adipocytvoorlopers van pasgeboren muizen, hun snelle uitbreiding in cultuur en hun differentiatie in vitro in volwassen, volledig functionele adipocyten mogelijk te maken. Het primaire voordeel van het isoleren van primaire cellen van pasgeborenen in plaats van volwassen muizen, is dat de vetdepots zich actief ontwikkelen en daarom een rijke bron zijn van proliferatie van preadipocyten. Primaire preadipocyten geïsoleerd met behulp van dit protocol differentiëren snel bij het bereiken van samenvloeiing en worden volledig volwassen in 4-5 dagen, een tijdelijk venster dat nauwkeurig het uiterlijk van ontwikkelde vetkussens bij pasgeboren muizen weerspiegelt. Primaire culturen die met behulp van deze strategie zijn voorbereid, kunnen met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgebreid en bestudeerd, waardoor ze geschikt zijn voor genetische en fenotypische schermen en de studie van de cel-autonome adipocytfenotypes van genetische muismodellen mogelijk worden. Dit protocol biedt een eenvoudige, snelle en goedkope aanpak om de complexiteit van vetweefsel in vitro te bestuderen.
Inleiding
Obesitas is het gevolg van een chronische onbalans tussen energie-inname en energieverbruik. Naarmate obesitas zich ontwikkelt, ondergaan witte adipocyten een enorme toename van de celgrootte die resulteert in hypoxie in het micromilieu, celdood, ontsteking en insulineresistentie1. Disfunctionele, hypertrofie adipocyten kunnen overtollige lipiden niet goed opslaan, die zich in plaats daarvan ophopen in andere weefsels waar ze insulinewerking dempen2,3. Middelen die de adipocytfunctie verbeteren en de normale lipidenpartitie tussen weefsels herstellen, worden voorspeld dat ze gunstig zij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol volgt alle IACUC-richtlijnen van het Scripps Research Institute en de University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Inzameling en vergisting van vetdepots (dag 1)
- Bereid twee buizen van 1,5 ml voor elke pup: één voor bruin vetweefsel (BBT) en één voor wit vetweefsel (WAT). Voeg 250 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 200 μL 2x isolatiebuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glucose, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), penicilline-streptocine toe. Houd oplossingen steriel en op ijs.
- Plaats de jongen in kleine kamers (bijv. een....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sectie 1 van het protocol zal een heterogene suspensie opleveren van cellen die zichtbaar zijn onder een standaard lichtmicroscoop. Het filteren van verteerd weefsel met een celzeef (sectie 2) zal onverteerd weefsel verwijderen. Sommige cellulaire brokstukken, bloedcellen en volwassen adipocyten zullen echter passeren (Figuur 1C). Zachte wasbeurten 1 uur na het plateren zullen niet-relevante cellen verwijderen, omdat preadipocyten zich snel aan de bodem van d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vetweefsel is van cruciaal belang voor systemische insulinegevoeligheid en glucosehomeostase20. Obesitas-gebonden adipocyt dysfunctie is nauw geassocieerd met het begin van type 2 diabetes. Daarom kan een beter begrip van de basisbiologie en fysiologie van vetweefsel het ontwerp van nieuwe behandelingen voor metabole aandoeningen mogelijk maken. Als aanvulling op directe functionele en transcriptieanalyse van volwassen adipocyten geïsoleerd uit vetdepots21,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn Cristina Godio van het Centro Nacional de Biotecnología in Madrid, Spanje, Mari Gantner van het Scripps Research Institute, La Jolla en Anastasia Kralli van de Johns Hopkins University in Baltimore dankbaar voor hun hulp bij het optimaliseren van dit protocol op basis van het eerste werk van Kahn et al.18. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies DK114785 en DK121196 aan E.S.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-wells platen | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collageenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | Voor Bioenergetica studies |
| DMEM, Hoge Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, geen calcium, geen magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinefrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Voor Bioenergetica studies |
| Chirurgische pincetten | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Chirurgische schaar | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
Referenties
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kus....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
