Een nieuwe techniek voor bloedcircuitreconstructie in een heterotopisch abdominale muisharttransplantatiemodel wordt gedemonstreerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bloedcircuitreconstructie in een abdominale muis harttransplantatiemodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De chirurgische techniek van heterotopic abdominale harttransplantatie bij muizen is een standaardmodel voor onderzoek in transplantatie immunologie. Hier wordt de gevestigde techniek voor een aangepaste bloedcircuitreconstructie in een heterotopisch buikharttransplantatiemodel gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van de intrathoracale inferieure vena cava (IIVC) in plaats van de longslagader van het donorhart voor de anastomose tot de inferieure vena cava van de ontvanger. Het faciliteert en verbetert de slagingspercentages voor abdominale harttransplantatie bij muizen.
Inleiding
De chirurgische techniek van heterotopic abdominale harttransplantatie bij muizen vertegenwoordigt een standaardmodel voor onderzoek intransplantatieimmunologie 1,2,3. Het is echter zeer uitdagend om uit te voeren en dit impliceert een beperking van het wijdverbreide gebruik van dit model4,5.
Bij traditionele muisharttransplantatie (THTx) worden de donoraorta en de ontvangende abdominale aorta geanastomoseerd terwijl de longslagader anastomosed is voor de ontvanger inferieure vena cava6,7,8.
Bij deze aangepaste muisharttransplantatietechniek wordt de donoraorta geangomoseerd naar de abdominale aorta van de ontvanger en wordt de donor IIVC geangomoseerd aan de ontvanger inferieure vena cava(3,4,6) ( figuur2 en figuur 3).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren van richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (ethische commissie goedgekeurd, #G1071/09).
OPMERKING: Voorbereidende voorbereiding, anesthesie, postoperatieve zorg en bewakingswerkzaamheden zijn hetzelfde als bij traditionele chirurgische methoden1,2,4. BALB/c muizen dienden als hartdonoren en C57BL/6J als transplantatieontvangers. Muizen waren 8-12 weken oud, wogen ~ 30 g bij transplantatie en werden onder standaardomstandigheden gehuisvest.
1. Voorbereidende stappen
- Geef muizen voor anesthesie inhalatie-isofluraan (2%) totdat ze in slaap vallen, gevolgd door intraperitoneale injecties ketamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg). Breng voor postoperatieve analgesie metamizol (200 mg/kg) p.o. en Carprofen (5 mg/kg) s.c.
OPMERKING: De toepassing van antibiotica werd met opzet onthouden, omdat deze stoffen immunologische reacties kunnen beïnvloeden. - Gebruik voor chirurgie een set microscopische instrumenten, waaronder een microschaar, micro-tang, een naaldhouder en micro-hemostatische klemmen. Een elektrochirurgische pen is ook nodig. Voer hechtingen uit met 7/0er, 10/0er en 4/0er nylon types.
- Plaats de muis in een doos voor isofluraaninhalatie (2%) gedurende 40-60 seconden. Bepaal de diepte van anesthesie door de poot met een pincet te knijpen. Als er een volledig gebrek aan respons is voor deze stimulus, ga dan naar de volgende stap.
- Zodra de muis in slaap is gevallen, weegt u de muis.
- Breng een intraperitoneale injectie ketamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg) aan op de verdoofde muis.
- Knip de buikvacht en plaats de muis op de operatietafel. Voer desinfectie uit met povidonejodide gedurende 3 keer en drapeer de muis vervolgens goed met behulp van een fenestrated chirurgische handdoek.
2. Procedure voor donoroperaties
- Gebruik een schaar om de huid van de nek naar de onderbuik te knippen en pel de volledige laag van de huid af tot de middellijn van beide oksel.
- Gebruik een schaar om de spieren van de buikwand te knippen en beweeg de ingewanden voorzichtig naar links (vanuit het zicht van de operator). Wikkel de ingewanden weg met een zout gaasje om de inferieure vena cava veilig bloot te leggen.
- Gebruik een spuit van 1 ml om 0,4 ml van de heparineoplossing (bevat 500 U heparine) langzaam in de onderste vena cava te injecteren en wacht 1 minuut voordat u de naald eruit trekt.
- Trek de naald eruit en gebruik een microschaar om zowel de inferieure vena cava als de abdominale aorta te snijden om exsanguinatie te versnellen.
- Gebruik een schaar om de borstholte te openen door een u-vormige snede uit te voeren; het hart, de longen en alle borstbloedvaten volledig blootstellen.
- Stel de thoracale aorta bloot, snijd 1/2 van het lumen en snijd vervolgens de longader om irrigatie en drainage te vergemakkelijken.
- Steek een irrigatiebuis in de opening van de thoracale aorta, injecteer ten minste 2 ml koude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat cardioplegieoplossing (Custodiol HTK-oplossing)9 totdat de longaderuitstroom volledig helder is en het hart volledig stopt met kloppen.
- Trek de irrigatiebuis eruit en maak het borstbeen los.
- Gebruik een microschaar om de thymus te verwijderen en het vet rond de aortaboog enigszins te strippen.
- Gebruik rechte en gebogen tangen om de romp van de arteria pulmonalis (aan de rechterkant van de aortaboog) bloot te leggen en te ligaeren met een 10/0 hechtdraad.
- Gebruik micro-tangen om het vet- en bindweefsel dat aan het IIVC is bevestigd te scheiden, stel de superieure vena cava (aan de linkerkant van de aortaboog) bloot en ligateer deze met een 7/0-hechting en gebruik een microschaar om deze achter de ligatie te snijden.
- Maak een 7/0 hechting rond de basis van het hart onder de aortaboog, het IIVC en beide oorschelpen. Ligateer dan de longslagadertakken en veneuze longvaten.
- Gebruik een microschaar om de aortaboog zo distaal mogelijk te transecteren, de longvaten onder de ligatuur en het IIVC in de buurt van het middenrif. Haal het hart uit de borst.
- Plaats het hart van de explanted donor in een koude HTK cardioplegieoplossing van 4 °C en bewaar deze tijdelijk.
3. Procedure voor de werking van de ontvanger
OPMERKING: De eerste operatiestappen zijn vergelijkbaar met die eerder getoond voor de donormuis, inclusief anesthesie en desinfectie.
- Voer de buikhuidsnede op een transversale manier uit, bedek de buikorganen met een nat gaas met behulp van een zoutoplossing.
- Gebruik micro-tangen om de inferieure vena cava en abdominale aorta bloot te leggen en ze te bevrijden van omliggend vetweefsel.
- Gebruik micro-tangen om zijtakvaten (laterale of onder de ader/aorta) onder de niervaten te ligaeren of elektrocauteriseren.
- Gebruik clip applicator forceps om twee micro hemostatische klemmen te plaatsen op het abdominale deel van de ader/aorta die van rechts komen en meer dan 1 cm afstand voor beide aorta/ader verlaten om ruimte te garanderen voor de constructie van de anastomose ertussen.
- Gebruik een microschaar om een incisie in de aorta te maken die iets dichter bij de onderste klem ligt dan bij de bovenste klem. U kunt ook een naald van 30 G gebruiken om een klein gaatje te maken en het te openen met een microschaar.
- Plaats de ontvangermuis zo dat de aorta naar de operator gericht is met de vena cava aan de andere kant. Plaats het hart vervolgens in de buikholte en bedek het met een klein nat gaasje.
- Gebruik een 10/0 hechting om de donoraorta aan te passen en te hechten aan de ontvangende aorta die caudaal begint, maak een knoop en ga verder met een lopende hechting aan de bovenkant van de incisie (ongeveer 4-5 hechtingen). Draai vervolgens het hart naar rechts (vanuit het oogpunt van het onderwerp), bedek het opnieuw en ga verder met de hechting aan de linkerkant totdat u het staarteind bereikt en knoop het.
- Gebruik een irrigatiebuis om ten minste 0,5 ml HTK cardioplegieoplossing van 4 °C te injecteren om het IIVC van de donor door te spoelen.
- Gebruik een microschaar om een rond gat te snijden op de abdominale inferieure vena cava van de ontvanger, die dezelfde grootte van het IIVC-lumen van de donoren moet hebben. De incisie moet zich boven de aorta-anastomotische opening bevinden. Maak de aderincisie groter dan de aorta-incisie.
- Gebruik een 10/0 hechtdraad om de donor IIVC te naaien aan de ontvanger vena cava die cauaudaal begint. Knoop een knoop en voer een lopende hechting uit totdat de bovenkant van de incisie is bereikt. Gebruik vijf hechtingen en ga verder met de hechting aan de linkerkant. Bind ten slotte een knoop in de staarthoek en draai deze voorzichtig vast (pas op dat u niet te strak trekt).
- Plaats de kleine delen van de hemostatische spons rond de ader en aorta anastomosen.
- Gebruik clip applicator forceps om eerst de onderste en vervolgens de bovenste micro-hemostatische klemmen te verwijderen en spoel de buikholte af met 38,0 °C getemperd 0,9% natriumchloride.
- Gebruik micro-tang om de hemostatische spons weg te nemen.
- Let op de hartslag van het getransplanteerde hart.
- Gebruik een tang om de darmen terug in de buikholte te plaatsen en tweelaagse hechtingen (buikspieren gevolgd door huid) om de buikwond te sluiten met een 4/0 hechting.
- Plaats de muizen in een zuurstof- en temperatuurregelingswerkstationkamer (bijv. INVIVO2-400) om een warme en zuurstofrijke omgeving te bieden voor de getransplanteerde muizen om te herstellen, wacht tot de muizen wakker worden.
- Geef voor postoperatieve analgesie direct Metamizol 200 mg/kg per os na gebruik. Geef Metamizol 200 mg/kg per os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. Geef carprofen (5 mg/kg) s.c in de verdere follow-up om de 24 uur gedurende drie opeenvolgende dagen na de operatie aan de getransplanteerde muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier wordt een aangepaste techniek van heterotopic abdominale harttransplantatie bij muizen gepresenteerd die eerder in ons laboratorium is ontwikkeld en de afgelopen 16 jaar nuttig is gebleken. Eerder werd gemeld dat in totaal 40 gevallen van vena cava tot vena cava (V-V-groep) in vergelijking met 40 gevallen van de traditionele longslagader tot vena cava (P-V-groep) anastomoseprocedure4 (Tabel 1) de anastomose van het vat 20,8±1,3 min in de V-V-groep duurde, wat aanzienlijk kort...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De chirurgische techniek van heterotopic abdominale harttransplantatie bij muizen is zeer uitdagend en dit impliceert een beperking van het wijdverbreide gebruik van dit model.
Een van de nadelen van de conventionele techniek is de beperkende lengte van de longslagader (PA) van de donor. Het is meestal ongeveer 2 mm lang, terwijl de lengte van het IIVC van het donorhart dat in ons model wordt gebruikt over het algemeen ongeveer 1 cm is (figuur 2). Dat betekent dat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Yun Xu voor haar hulp als stemacteur, Dr. med. Jianhua Peng voor haar hulp bij videobewerking en Dr. Annika Kuckhahn voor haar opmerkingen en steun. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de German Research Foundation (DFG) om internationale samenwerkingen (HO2581/4-1 aan AH) en de National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 aan FJ) te bevorderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30G-naalden | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl muizen | Charles River. Duitsland | geen catalogusnummer | |
| Bepanthen oogzalf | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Doos voor isolatie- en zuurstoftoevoerapparaat | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J muizen | Charles River. Duitsland | geen catalogusnummer | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Gebogen pincetten | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | geen catalogusnummer | |
| Cutasept huiddesinfectie | VWR | BODL980365 | |
| elektrochirurgische pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| Gaasjes, wattenstaafjes | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Verwarmingsmat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatische spons | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-oplossing | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| IJsbox | PETZ | Geen catalogusnummer beschikbaar | |
| Inhalatieanesthesie-apparaat | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| isolatie- en zuurstoftoevoerapparaat | RUSKINN | INVIV | |
| isofluraan | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | geen catalogusnummer | |
| metamizol | WDT | geen catalogusnummer | |
| Micro schaar | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine (klem) Hoekig / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscoop | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscooplicht | SCHOTT | KL2500LED | |
| Zoutoplossing (NaCl 0,9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Schaar | Peha Instruments | 991083/4 | |
| Kleine petrischaal | Sarstedt | 833900 | |
| Rechte pincetten | WPI | 14113-G | |
| Chirurgisch plakband | BSN | 4120 | |
| Hechttang - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Hechtdraad(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Hechtdraad(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Hechtdraad(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Spuit (0,3 mL) | BD | 324826 | |
| Spuit (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
Referenties
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423(2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
