Methodenartikel

Fabricage van magnetische platforms voor micronschaalorganisatie van onderling verbonden neuronen

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62013

⸱

14 juli 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk presenteert een bottom-up benadering van de engineering van lokale magnetische krachten voor controle van neuronale organisatie. Neuron-achtige cellen geladen met magnetische nanodeeltjes (MNP's) worden bovenop geplateerd en bestuurd door een micro-patroon platform met loodrechte magnetisatie. Ook beschreven zijn magnetische karakterisering, MNP cellulaire opname, cel levensvatbaarheid, en statistische analyse.

Samenvatting

Het vermogen om neuronen te sturen in georganiseerde neurale netwerken heeft grote implicaties voor regeneratieve geneeskunde, weefseltechnologie en bio-interfacing. Veel studies zijn gericht op het sturen van neuronen met behulp van chemische en topografische signalen. Meldingen van organisatorische controle op micronschaal over grote gebieden zijn echter schaars. Hier is een effectieve methode beschreven voor het plaatsen van neuronen in vooraf ingestelde locaties en het begeleiden van neuronale uitgroei met micronschaalresolutie, met behulp van magnetische platforms ingebed met micro-patroon, magnetische elementen. Het is aangetoond dat het laden van neuronen met magnetische nanodeeltjes (MNP's) ze omzet in gevoelige magnetische eenheden die kunnen worden beïnvloed door magnetische gradiënten. Volgens deze aanpak is een uniek magnetisch platform vervaardigd waarop PC12-cellen, een gemeenschappelijk neuronachtig model, werden geplateerd en geladen met superparamagnetische nanodeeltjes. Dunne films van ferromagnetische (FM) meerlagen met stabiele loodrechte magnetisatie werden afgezet om effectieve aantrekkingskrachten naar de magnetische patronen te bieden. Deze MNP-geladen PC12-cellen, geplateerd en gedifferentieerd bovenop de magnetische platforms, werden bij voorkeur aan de magnetische patronen bevestigd en de uitgroei van neuriet was goed uitgelijnd met de patroonvorm en vormde georiënteerde netwerken. Kwantitatieve karakteriseringsmethoden van de magnetische eigenschappen, cellulaire MNP-opname, cel levensvatbaarheid en statistische analyse van de resultaten worden gepresenteerd. Deze aanpak maakt de controle van neurale netwerkvorming mogelijk en verbetert de neuron-naar-elektrode-interface door de manipulatie van magnetische krachten, wat een effectief hulpmiddel kan zijn voor in vitro studies van netwerken en nieuwe therapeutische biointerfacing-richtingen kan bieden.

Inleiding

Micropatterning van neuronen heeft een groot potentieel voor weefselregeneratie1,2,3,4,5 en de ontwikkeling van neuro-elektronische apparaten6,7,8. De microngeschaalde positionering van neuronen bij hoge ruimtelijke resolutie, zoals in biologische weefsels, vormt echter een aanzienlijke uitdaging. Het vormen van vooraf ontworpen structuren op deze schaal vereist de begeleiding van zenuwcelprocessen door somamotiliteit en axonale uitgroei lokaal te beheersen. Eerdere studies hebben het gebruik van chemische en fysische signalen9,10,11, 12 voor het begeleiden van neuronale groei gesuggereerd. Hier richt een nieuwe benadering zich op het regelen van celpositionering door magnetische veldgradiënten13,14,15,16,17, waardoor cellen geladen met MNP's worden omgezet in magnetisch-gevoelige eenheden, die op afstand kunnen worden gemanipuleerd.

Kunze et al., die de kracht kenmerkten die nodig is om cellulaire reacties te induceren met behulp van magnetische chip- en MNP-geladen cellen, bewees dat vroege axonale rek kan worden geactiveerd door mechanische spanning in cellen18. Tay et al. bevestigden dat micro-gefabriceerde substraten met verbeterde magnetische veldgradiënten draadloze stimulatie mogelijk maken van neurale circuits gedoseerd met MNP's met behulp van calciumindicatorkleurstoffen19. Bovendien hebben Tseng et al. nanodeeltjes in cellen samengebald, wat resulteerde in gelokaliseerde nanodeeltjesgemedieerde krachten die de cellulaire spanning benaderden20. Dit leidde tot de fabricage van gedefinieerde patronen van micromagnetische substraten die hielpen bij het bestuderen van cellulaire respons op mechanische krachten. Cellulaire spanning als gevolg van de toepassing van gelokaliseerde nanodeeltjesgemedieerde krachten werd bereikt door nanodeeltjes in cellen 20 samen tebundelen. Een complementair metaaloxide halfgeleider (CMOS)-microfluïdisch hybride systeem werd ontwikkeld door Lee et al. die een reeks micro-elektromagneten in de CMOS-chip integreerden om de beweging van individuele cellen gelabeld met magnetische kralen te regelen21.

Alon et al. gebruikten microschaal, voorgeprogrammeerde, magnetische pads als magnetische "hot spots" om cellen te lokaliseren22. Specifieke activiteit kan ook worden gestimuleerd in cellen met behulp van micro-patroon magnetische arrays om nanodeeltjes te lokaliseren op specifieke subcellulaire locaties23. Cellulaire MNP-opname is met succes aangetoond in primaire neuronen van bloedzuiger, rat en muis24,25,26. Hier is dit aangetoond op een RAT PC12 feochromocytoom cellijn, waarvan eerder is gemeld dat het een hoge opname van MNPs27vertoont. In de afgelopen jaren zijn er verschillende medische toepassingen van MNP's geweest, waaronder medicijnafgifte en thermotherapie bij kankerbehandelingen28,29,30,31. In het bijzonder hebben studies betrekking op de toepassing van MNP's en neuronnetwerken32,33,34,35. De magnetische organisatie van neuronen die MNP's op een enkelcellig niveau gebruiken, verdient echter verder onderzoek.

In dit werk is een bottom-up benadering beschreven om lokale magnetische krachten te engineeren via vooraf ontworpen platforms voor het regelen van neuronale opstelling. De fabricage van micronschaalpatronen van FM-meerlagen is gepresenteerd. Deze unieke, FM meerlagige structuur creëert stabiele loodrechte magnetisatie die resulteert in effectieve aantrekkingskrachten naar alle magnetische patronen. Via incubatie werden MNP's in PC12-cellen geladen, waardoor ze werden omgezet in magnetische gevoelige eenheden. MNP-geladen cellen, geplateerd en gedifferentieerd bovenop de magnetische platforms, werden bij voorkeur aan de magnetische patronen bevestigd en de uitgroei van neuriet was goed afgestemd op de patroonvorm en vormde georiënteerde netwerken. Verschillende methoden zijn beschreven om de magnetische eigenschappen van de FM-meerlagen en de MNP's te karakteriseren, en technieken voor cellulaire MNP-opname en cel levensvatbaarheidstesten zijn ook gepresenteerd. Bovendien zijn morfometrische parameters van neuronale groei en statistische analyse van de resultaten gedetailleerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Voer alle biologische reacties uit in een bioveiligheidskast.

1. Magnetische platformfabricage

  1. lithografie
    1. Snijd glazen dia's in 2 x 2 cm2 met behulp van een schrijfpen. Reinig de glazen dia's in aceton en vervolgens isopropanol gedurende elk 5 minuten in een ultrasonicatiebad. Droog met ultra-hoge zuiverheid (UHP) stikstof.
    2. Bedek het glas met fotoresist met behulp van spincoating bij 6.000 tpm gedurende 60 s, om een dikte van 1,5 μm te bereiken en bak op 100 °C gedurende 60 s. Stel het monster bloot aan een lichtbron, met behulp van een geschikte golflengte voor fotoresist, met een gewenst patroon, met behulp van een fotomasker of maskerloze lithografie.
    3. Ontwikkel gedurende 40 s in een ontwikkelaar, verdund in gedestilleerd water (DW) volgens de instructies van de fabrikant; wassen in DW gedurende 45 s en drogen met UHP stikstofgas. Inspecteer het patroon onder een optische microscoop.
  2. Sputter depositie
    1. Plaats het monster in de hoofdkamer van het depositiesysteem en wacht op basisdruk (~5 × 10-8 Torr). Open de gasstroom; stel hierin de argonstroom in voor standaard sputteren (28 sccm [standaard kubieke cm per min). Ontsteek de sputterdoelen en stel vervolgens de sputterdruk in op 3 mTorr.
    2. Verhoog het vermogen op elk doel totdat de gewenste snelheid is bereikt.
      OPMERKING: Pd-snelheid: 0,62 A/s = 1,0 nm in 16 s; Co80Fe20 Snelheid: 0,32 A/s, 0,2 nm in 6,25 s.
    3. Schakel rotatie in. Deponeer de FM-meerlaag, afwisselend tussen de Co80Fe20- en Pd-doelen, door respectievelijk de doelluiken te openen en te sluiten. Deponeer 14 tweelagen Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) en eindig met een extra aftoppingslaag van 2 nm Pd.
    4. Lift-off: Week het monster gedurende 30 minuten in aceton en spoel af met isopropanol. Droog vervolgens met UHP-stikstof en bewaar het monster in een schone en droge omgeving tot gebruik.

2. Karakterisering van magnetische apparatuur via transportmetingen

  1. Gebruik een Si-substraat of glazen glijbaan met een kruisvormige magnetische staaf van 100 μm breedte, afgezet met FM-meerlagen (zie figuur 1C-inzet). Bevestig het monster aan de houder met dubbelzijdige tape.
  2. Bind met behulp van een draadlijmer 4 draden aan het monster, één op elk been van de kruiselektrode. Stel de monsterhouder en het monster in het transportmeetsysteem in met een magnetisch veld, zodat het magnetische veld loodrecht op het monster staat. Voer metingen uit bij kamertemperatuur.
  3. Voer transversale spanning (VT)meting van het apparaat uit; volg de markeringen in figuur 1C (inzet): breng een stroom van 1 mA aan tussen contact 1 en 3; meet de VT tussen contactlenzen 2 en 4; breng vervolgens een stroom aan tussen 2 en 4 en meet de spanning tussen 1 en 3. Bereken ten slotte het verschil tussen de spanningen van zowel de metingen als deling door 2 om VTte verkrijgen. Gebruik een schakelsysteem om automatisch te schakelen tussen de twee meetconfiguraties.
  4. Veeg het magnetisch veld tussen 0,4 T en -0,4 T in stappen van 5 mT en meet de VT als functie van het veld. Zet de dwarsweerstand (VT/I) versus het magnetisch veld in om het afwijkende Hall-signaal te bepalen, dat evenredig is met de loodrechte magnetisatie in de film.

3. Karakterisering van MNP's en magnetische meerlagen door magnetometriemetingen

  1. Magnetometrische meting voor FM-meerlagen
    1. Deponeer de FM-meerlaag op het Si-substraat (zie rubriek 1.2). Snijd het monster in 6 vierkanten van 4 x 4 mm2 formaat. Stapel de monsters op elkaar en plaats ze in de capsule loodrecht op de richting van het magnetisch veld (zie figuur 1D-inzet).
    2. Plaats de capsule in de magnetometer en meet de magnetisatie bij kamertemperatuur. Veeg het magnetisch veld tussen -0,4 T en 0,4 T.
    3. Bereken het totale volume van het magnetische materiaal, rekening houdend met de dikte van de magnetische laag, de grootte van de monsters en het aantal substraten. Deel de magnetisatie door het totale volume van het magneetmateriaal.
    4. Zet de magnetisatie (per volume-eenheid) versus het magnetisch veld in. Trek de diamagnetische achtergrond van het substraat af van de hoge magnetische veldrespons en extrapoleer de verzadigingsmagnetisatie van de FM uit de grafiek.
  2. Magnetometrische meting voor MNP's
    1. Plaats een aangewezen massa MNP's in een synthetische polymeercapsule. Overweeg een groter volume bij het meten van kleine magnetisatieverzadigingswaarden.
    2. Als de MNPs in een oplosmiddel zijn gesuspendeerd, droogt u de MNPs door de capsule 's nachts open te laten. Plaats de capsule in de magnetometer en meet de magnetisatie bij kamertemperatuur. Veeg het magnetisch veld tussen -0,2 T en 0,2 T.
    3. Bereken de totale massa van de MNP's door het aangegeven volume te vermenigvuldigen met de deeltjesconcentratie. Normaliseer de resultaten tot 1 g.
    4. Zet de genormaliseerde magnetisatie (per gram) versus het magnetisch veld in. Extrapoleer de magnetisatieverzadiging van de MNPs uit de grafiek.

4. Collageen-coating protocol

  1. Coating van kunststof schalen
    1. Bereid 0,01 M HCl door 490 μL HCl toe te voegen aan 500 ml autoclaaf dubbel gedestilleerd water (DDW).
      OPMERKING: Voer deze stap alleen uit in de chemische kap.
    2. Verdun collageen type 1 (oplossing van rattenstaart) 1:60-1:80 in 0,01 M HCl om de uiteindelijke werkconcentratie van 50 μg/ml te verkrijgen. Plaats 1,5 ml van de verdunde oplossing in een kweekschaal van 35 mm. Laat de schaal 1 uur afgedekt in de kap staan.
    3. Verwijder de oplossing en was 3x in steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Het gerecht is klaar voor celzaden.
  2. Coating glasglijbanen
    1. Verdun collageen type 1 (oplossing van rattenstaart) 1:50 in 30% v/v ethanol. Voeg voor het coaten van een schaal van 35 mm 20 μL collageen toe aan 1 ml 30% ethanol.
    2. Bedek de schaal met de oplossing en wacht tot alle oplossing verdampt, laat de schaal een paar uur onbedekt. Was 3x in steriel 1x PBS; de glazen dia is klaar voor celzaden.

5. Cellulaire MNP-opname en levensvatbaarheid

  1. Cellulaire MNP-opname
    1. Bereid het basisgroeimedium voor op PC12-celcultuur door 10% paardenserum (HS), 5% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine en 0,2% amfotericine toe te voegen aan roswell Park Medical Institute (RPMI) medium en te filteren met een nylonfilter van 0,22 μm.
    2. Voeg 1% paardenserum (HS), 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine en 0,2% amfotericine toe aan RPMI-medium om PC12-differentiatiemedium voor te bereiden en filter met een nylonfilter van 0,22 μm.
    3. Kweek cellen in een niet-behandelde kweekkolf met 10 ml basisgroeimedium; voeg elke 2-3 dagen 10 ml basisgroeimedium toe aan de kolf en subkweek de cellen na 8 dagen.
    4. Voor cellulaire opname, centrifugeer de celsuspensie in een centrifugebuis gedurende 8 minuten bij 200 × g en kamertemperatuur, en gooi het supernatant weg.
    5. Resuspend de cellen in 3 ml vers basisgroeimedium. Centrifugeer de celsuspensie nogmaals gedurende 5 minuten bij 200 × g en kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 3 ml vers differentiatiemedium.
    6. Aspireer de cellen 10x met behulp van een spuit en een naald om celclusters op te breken. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaai10 6 cellen in een gewone ongecoate schaal van 35 mm.
    7. Voeg aan de schaal het berekende volume MNP-suspensie en het volume van het differentiatiemedium toe om de gewenste MNP-concentratie en het totale volume te bereiken. Meng de cellen, MNPs en differentiatiemedium; incubeer de schaal gedurende 24 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 °C.
    8. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml vers differentiatiemedium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  2. MNP-geladen celdifferentiatie
    1. Opnameprotocol uitvoeren (paragraaf 5.1). Zaad 8 × 10 cellen met een MNP-belasting van4 MNP op een schaal van 35 mm, met collageentype l-coated, in aanwezigheid van een differentiatiemedium (zie het collageencoatingprotocol in rubriek 4.1). Voeg na 24 uur 1:100 verse muriene bètazenuwgroeifactor (β-NGF) (eindconcentratie 50 ng/ml) toe.
    2. Vernieuw het differentiatiemedium en voeg elke 2 dagen verse muriene β-NGF toe. Beeld de cellen om de 2 dagen met behulp van optische microscopie. Na netwerkvorming (6-8 dagen voor PC12-cellen), beeld de cellen met behulp van confocale microscopie, en observeer de fluorescentie van de deeltjes.
  3. Levensvatbaarheidstest voor MNP-geladen cellen: 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) cel levensvatbaarheidstest.
    1. Bereid het basisgroeimedium voor volgens stap 5.1.1. Cultiveer de PC12-cellen met MNP's in verschillende concentraties (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml en 0,5 mg/ml in basisgroeimedium) en ook zonder MNP's voor de controle in drievoud in een vlakke plaat van 96 putten (totaal volume van 100 μL/put). Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een 5% CO2,bevochtigde incubator bij 37 °C.
    2. Bereid lege putten met medium zonder cellen voor achtergrondcorrectie. Ontdooi de XTT-reagensoplossing en de reactieoplossing met N-methyldibenzopyrazine-methylsulfaat) in een bad van 37 °C vlak voor gebruik. Wervel voorzichtig totdat er duidelijke oplossingen zijn verkregen.
    3. Meng voor één 96-put plaat 0,1 ml activeringsoplossing met 5 ml XTT-reagens. Voeg 50 μL van de reactieoplossing toe aan elke put, schud de plaat lichtjes voor een gelijkmatige verdeling van de kleurstof in de putten en incubeer de plaat vervolgens gedurende 5 uur in een incubator.
    4. Meet de absorptie van het monster tegen de blanco putten met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) lezer op een golflengte van 450 nm. Meet de referentieabsorpantie met een golflengte van 630 nm en trek deze af van de 450 nm meting.
    5. Aangezien lichte spontane absorptie optreedt in het kweekmedium dat met het XTT-reagens bij 450 nm is geïncubeerd, trekt u de gemiddelde absorptie van de lege putten af van die van de andere putten. Trek signaalwaarden af van parallelle monsters van MNP's in dezelfde geteste concentraties als de celmonsters.
  4. Levensvatbaarheidstest voor MNP-geladen cellen: op resazurin gebaseerde cel levensvatbaarheidstest
    1. Bereid het basisgroeimedium voor volgens stap 5.1.1. Cultiveer de PC12-cellen met MNP's in verschillende concentraties (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml en 0,5 mg/ml in basisgroeimedium) en zonder MNP's als controle in drievoud in een vlakke plaat van 96 putten gedurende 24 uur. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C. Bereid lege putten met medium zonder cellen.
    2. Was de cellen met 1x PBS. Voeg het reagens op basis van resazurin (10% w/v) toe aan het medium en incubeer gedurende 2 uur in een incubator van 37 °C.
    3. Plaats 150 μL aliquots van de monsters in de ELISA-lezer en meet de absorptie bij een excitatiegolflengte van 560 nm en een emissiegolflengte van 590 nm. Trek de signaalwaarden af van de parallelle monsters van MNP's in dezelfde geteste concentraties als de celmonsters.

6. Karakterisering van de MNP-concentratie in de cellen met inductief gekoppeld plasma (ICP)

  1. Bereid het basisgroeimedium voor volgens stap 5.1.1. Cultiveer de PC12-cellen met MNP's in verschillende concentraties (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml en 0,5 mg/ml in basisgroeimedium) en zonder MNP's als controle in drievoud in een vlakke plaat van 96 put (totaal volume van 100 μL/put). Incubeer in een 5% CO2,bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 24 uur.
  2. Breng de suspensie over in een centrifugebuis (van elke put afzonderlijk), centrifugeer cellen op 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml vers differentiatiemedium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  3. Lyse de cellen door behandeling met 100 μL 70% salpeterzuur aan elk goed afzonderlijk gedurende ten minste 15 min. Voeg 5 ml DDW toe aan de gelyseerde cellen en filter de oplossingen.
  4. Meet de ijzerconcentratie met behulp van ICP en gebruik het celgetal om de Fe-concentratie per cel vast te leggen.

7. Celdifferentiatie en groei op magnetisch platform

  1. Reinig het patroonsubstraat met 70% v/v/ethanol en plaats het substraat in een kweekschaal van 35 mm in de kap. Plaats een grote magneet (~1500 Oe) gedurende 1 minuut onder het substraat met patroon en verwijder de magneet door eerst de schotel omhoog en weg van de magneet te bewegen en vervolgens de magneet uit de kap te halen. Zet het ultraviolette licht 15 minuten aan.
  2. Bedek het substraat met collageen type 1 volgens sectie 4.2. S hang de cellen op na cellulaire MNP-opname (rubriek 5.1), zaai 105 cellen in een kweekschaal van 35 mm en voeg 2 ml differentiatiemedium toe. Incubeer de cultuur in een 5% CO2,bevochtigde incubator bij 37 °C.
  3. Voeg na 24 uur 1:100 verse murine toe β-NGF (eindconcentratie van 50 ng/ml). Vernieuw het differentiatiemedium en voeg elke 2 dagen verse muriene β-NGF toe. Beeld de cellen om de 2 dagen met behulp van lichte microscopie, en na netwerkvorming, uitvoeren immunostaining op de cellen (rubriek 8.1).

8. MNP-geladen celkleuring

  1. Tubuline immunostaining
    1. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing door 10 ml 16% w/v PFA-oplossing, 4 ml 10x PBS en 26 ml DDW te mengen. Bereid 50 ml 1% PBT voor door 500 μL van een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe te voegen aan 50 ml 1x PBS. Bereid 50 ml 0,5% PBT door 25 ml 1% PBT te mengen met 25 ml 1x PBS. Bereid de blokkeeroplossing voor door 1% runderserumalbumine en 1% normaal ezelserum te mengen in 0,25% PBT.
      OPMERKING: Gebruik PFA alleen in de chemische afzuigkap.
    2. Verwijder het supernatant medium uit de cellen. Bevestig de MNP-geladen cellen gedurende 15 minuten in 4% PFA bij kamertemperatuur in een chemische kap. Was de MNP-geladen cellen 3x in 1x PBS, 5 min elke wasbeurt, in een chemische kap.
    3. Permeabiliseer de MNP-geladen cellen met 0,5% PBT gedurende 10 minuten. Incubeer de MNP-geladen cellen eerst in blokkeeroplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens met konijn anti-α-tubuline antilichaam in blokkerende oplossing 's nachts bij 4 °C. Was MNP-geladen cellen 3x in 1x PBS, 5 min elke wasbeurt.
    4. Incubeer de MNP-geladen cellen met Cy2-geconjugeerde ezel anti-konijn secundaire antilichamen gedurende 45 minuten in het donker en bij kamertemperatuur. Was de MNP-geladen cellen 3x in 1x PBS, 5 min per wasbeurt.
    5. Voer confocale beeldvorming uit. Gebruik voor tubuline een excitatiegolflengte van 492 nm en een emissiegolflengte van 510 nm. Gebruik voor de MNPs (rhodamine) een excitatiegolflengte van 578 nm en een emissiegolflengte van 613 nm.
  2. Nucleaire kleuring met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)
    1. Was de MNP-geladen cellen 3x in 1x PBS, 5 min per wasbeurt. Verwijder overtollige vloeistof rond het monster, voeg 1 druppel (~50 μL) montagemedium met DAPI toe om een gebied van 22 mm x 22 mm te bedekken en incubeer gedurende 5 minuten in het donker en bij kamertemperatuur.
    2. Was de MNP-geladen cellen 3x in 1x PBS, 5 min per wasbeurt. Voer confocale beeldvorming uit. Gebruik voor DAPI een excitatiegolflengte van 358 nm en een emissiegolflengte van 461 nm. Gebruik voor de MNPs (rhodamine) een excitatiegolflengte van 578 nm en een emissiegolflengte van 613 nm.

9. Metingen en statistische analyse

  1. Morfometrische analyse van MNP-geladen celdifferentiatie
    1. Om het aantal snijpunten op verschillende afstanden van het cellichaam te meten, verkrijgt u fasebeelden van gekweekte cellen tot 3 dagen na behandeling met NGF.
      OPMERKING: Als dit later gebeurt, kunnen de cellen netwerken ontwikkelen, waardoor metingen van de resolutie van één cel worden voorkomen.
      1. Open de afbeeldingen in het beeldverwerkingsprogramma ImageJ en gebruik de NeuronJ-plug-in, waarmee een semiautomatische neuriettracering en lengtemeting36mogelijk is. Met behulp van de neurite tracer plug-in, traceer de neurieten en converteer de gegevens naar binaire afbeeldingen. Definieer het midden van de soma.
      2. Voer Sholl-analyse uit, beschikbaar in de NeuronJ-plug-in. Definieer de maximale straal. Herhaal het experiment drie keer. Analyseer meer dan 100 cellen in elk experiment.
  2. Cellokalisatieanalyse
    1. Om het percentage cellen te bepalen dat na 3 dagen incubatie op het magnetische gebied is gelokaliseerd, verkrijgt u confocale microscopische beelden van cellen met en zonder MNP-opname. Gebruik DAPI-kleuring (punt 8.2).
    2. Tel de cellen handmatig boven of gedeeltelijk bovenop het patroon (cellen aanraken) en de cellen die dat niet zijn. Herhaal dit voor drie experimenten. Analyseer meer dan 400 cellen met MNP en zonder opname.
    3. Bereken het relatieve aandeel van de cellen die zich boven op de magnetische patronen bevinden uit het totale aantal cellen, met en zonder MNP's. Bereken bovendien het percentage van het effectieve gebied van het magnetische patroon door de diameter van het cellichaam toe te voegen aan de patroonbreedte om de willekeurige kans te bepalen dat cellen op een magnetisch patroon landen.
    4. Voer een enkele monster Z-testuit om te analyseren of de celverdeling het resultaat is van isotrope cellanding of dat er een voorkeursbias is ten opzichte van het magnetische patroon.
  3. Groei directionaliteitsanalyse
    1. Om het effect op de uitgroeirichting van neuriet te kwantificeren, verkrijgt u confocale microscopische beelden van de cellen met en zonder MNP-behandeling na 8 dagen incubatie. Immunokleuring uitvoeren (rubriek 8.1).
    2. Meet met behulp van ImageJ-software de hoek tussen het celcastriet en de magnetische strepen in beide omstandigheden.
      OPMERKING: Analyseer alleen neurieten die afkomstig zijn van soma's op de magnetische strepen.
    3. Plot de verdeling van de hoeken van de neurieten ten opzichte van de richting van de strepen (Δθ). Voer een Chi-kwadraattest uit van de verdeling van Δθ om aan te tonen dat de verdeling niet normaal of uniform is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Magnetische platforms met verschillende geometrische vormen werden vervaardigd(figuur 1A). Magnetische patronen werden afgezet door sputteren: 14 meerlagen van respectievelijk Co80Fe20 en Pd, 0,2 nm en 1 nm. Elektronenmicroscopie onthulde de totale hoogte van de magnetische patronen op ~18 nm(figuur 1B). Deze unieke FM-meerlaagse depositie creëert een stabiel platform met loodrechte magnetisatie-anisotropie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De representatieve resultaten tonen de effectiviteit aan van de gepresenteerde methodologie voor het beheersen en organiseren van neuronale netwerkvorming op micronschaal. De met MNP geladen PC12-cellen bleven levensvatbaar en werden omgezet in magnetische gevoelige eenheden die door de magnetische krachten van de FM-elektroden naar specifieke locaties werden aangetrokken. Dit kan het best worden aangetoond in figuur 5C, waar de cellen zich bij voorkeur aan de grotere hoekpunten van de zesho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap & Technologie, Israël, en door de Israeli Science Foundation (569/16).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet.Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

Referenties

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560(2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299(2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030(2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37(2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32(2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290(2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055(2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911(2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303(2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403(2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuronale organisatiemagnetische nanodeeltjesPC12 cellenvorming van neurale netwerkenferromagnetische multilagenpatroonvorming op microniveauneurietuitgroeicelpositioneringbio interfaceapparatuur

Gerelateerde artikelen