Methodenartikel

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

DOI:

10.3791/62045

⸱

26 maart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serial block-face scanning electron microscopie (SBF-SEM) maakt het mogelijk om honderden tot duizenden serieel geregistreerde ultrastructurele beelden te verzamelen, wat een ongekend driedimensionaal beeld biedt van weefselmicroanatomie. Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit. Dit beeldvormingssysteem profiteert van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag. Zonder de juiste weefselvoorbereiding kan de cellulaire ultrastructuur echter zodanig worden gewijzigd dat onjuiste of misleidende conclusies kunnen worden getrokken. Bovendien worden afbeeldingen gegenereerd door het blokvlak van een met hars ingebed biologisch monster te scannen en dit brengt vaak uitdagingen en overwegingen met zich mee die moeten worden aangepakt. De accumulatie van elektronen in het blok tijdens beeldvorming, bekend als "weefsel opladen", kan leiden tot een verlies van contrast en een onvermogen om cellulaire structuur te waarderen. Bovendien kan het verhogen van de intensiteit/spanning van elektronenbundels of het verlagen van de stralingsscansnelheid de beeldresolutie verhogen, maar dit kan ook de ongelukkige bijwerking hebben van het beschadigen van het harsblok en het vervormen van latere beelden in de beeldvormingsreeks. Hier presenteren we een routineprotocol voor de voorbereiding van biologische weefselmonsters die cellulaire ultrastructuur behouden en het opladen van weefsel verminderen. We bieden ook beeldvormingsoverwegingen voor de snelle verwerving van hoogwaardige seriële beelden met minimale schade aan het weefselblok.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serial block face scanning electron microscopie (SBF-SEM) werd voor het eerst beschreven door Leighton in 1981, waar hij een scanning elektronenmicroscoop maakte, aangevuld met een ingebouwde microtome die dunne delen weefsel ingebed in hars kon snijden en in beeld kon snijden. Helaas beperkten technische beperkingen het gebruik ervan tot geleidende monsters, omdat niet-geleidende monsters zoals biologisch weefsel onaanvaardbare oplaadniveaus (elektronenopbouw in het weefselmonster)1. Terwijl het coaten van de blokwand tussen sneden met verdampte koolstof verminderde weefsel opladen, deze sterk verhoogde beeldverwervingstijd en beeldopslag bleef een probleem omdat computertechnologie op dat moment onvoldoende was om de grote bestandsgroottes die door het apparaat werden gecreëerd te beheren. Deze methodiek is in 2004 door Denk en Horstmann opnieuw bekeken met behulp van een SBF-SEM uitgerust met een variabele drukkamer2. Dit maakte de introductie van waterdamp in de beeldvormingskamer mogelijk, waardoor het opladen in het monster werd beperkt, waardoor beeldvorming van niet-geleidende monsters levensvatbaar werd, zij het met verlies van beeldresolutie. Verdere verbeteringen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden maken het nu mogelijk om beeldvorming met behulp van hoog vacuüm mogelijk te maken, en SBF-SEM-beeldvorming is niet langer afhankelijk van waterdamp om het opladen3,4,5,6,7,8,9af te voeren . Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit.

SBF-SEM maakt de geautomatiseerde verzameling van duizenden serieel geregistreerde elektronenmicroscopiebeelden mogelijk, met een planaire resolutie van 3-5 nm10,11. Weefsel, geïmpregneerd met zware metalen en ingebed in hars, wordt geplaatst in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) met een ultramicrotome uitgerust met een diamantmes. Een vlak oppervlak wordt gesneden met het diamantmes, het mes wordt ingetrokken en het oppervlak van het blok wordt gescand in een rasterpatroon met een elektronenstraal om een beeld van weefsel ultrastructuur te creëren. Het blok wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid (bijv. 100 nm) in de z-as verhoogd, bekend als een "z-stap", en een nieuw oppervlak wordt gesneden voordat het proces wordt herhaald. Op deze manier wordt een 3-dimensionaal (3D) blok beelden geproduceerd terwijl het weefsel wordt weggesneden. Dit beeldvormingssysteem profiteert verder van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag.

Terwijl SBF-SEM-beeldvorming voornamelijk backscattered elektronen gebruikt om een beeld van het blokvlak te vormen, worden secundaire elektronen gegenereerd tijdens het beeldvormingsproces12. Secundaire elektronen kunnen zich ophopen, naast backscattered en primaire-bundel elektronen die niet ontsnappen aan het blok, en produceren "weefsel opladen," die kan leiden tot een gelokaliseerd elektrostatisch veld aan de block-face. Deze elektronenaccumulatie kan het beeld vervormen of ervoor zorgen dat elektronen uit het blok worden geworpen en bijdragen aan het signaal dat door de backscatterdetector wordt verzameld, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verlaagd13. Hoewel het niveau van weefsellading kan worden verlaagd door de spanning of intensiteit van de elektronenbundel te verminderen of de verblijftijd van de bundel te verkorten, resulteert dit in een verminderde signaal-ruisverhouding14. Wanneer een elektronenbundel met een lagere spanning of intensiteit wordt gebruikt, of de bundel slechts gedurende een kortere periode in elke pixelruimte mag blijven hangen, worden minder teruggetrokken elektronen uit het weefsel geworpen en door de elektronendetector opgevangen, wat resulteert in een zwakker signaal. Denk en Horstmann hebben dit probleem aangepakt door waterdamp in de kamer te brengen, waardoor de lading in de kamer en op het blokgezicht wordt verminderd ten koste van de beeldresolutie. Bij een kamerdruk van 10-100 Pa wordt een deel van de elektronenbundel verspreid, wat bijdraagt aan beeldruis en een verlies van resolutie, maar dit produceert ook ionen in de monsterkamer die de lading binnen het monsterblok neutraliseren2. Recentere methoden voor het neutraliseren van lading binnen het monsterblok gebruiken focale gasinjectie van stikstof over het blokvlak tijdens beeldvorming, of het introduceren van negatieve spanning in het SBF-SEM-stadium om de energie van de sondestraallading te verminderen en het verzamelde signaal te verhogen6,7,15. In plaats van stadiumbias, kamerdruk of gelokaliseerde stikstofinjectie te introduceren om de ladingsopbouw op het blokoppervlak te verminderen, is het ook mogelijk om de geleidbaarheid van de hars te verhogen door koolstof in de harsmix te introduceren, waardoor agressievere beeldvormingsinstellingen mogelijk zijn16. Het volgende algemene protocol is een aanpassing van het in 2010 gepubliceerde Deerinck et al.-protocol en omvat wijzigingen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden die we nuttig vonden voor het minimaliseren van weefselladen met behoud van beeldverwerving met hoge resolutie3,17,18,19. Hoewel het eerder genoemde protocol gericht was op weefselverwerking en impregneren van zware metalen, biedt dit protocol inzicht in de beeldvormings-, gegevensanalyse- en reconstructieworkflow die inherent is aan SBF-SEM-studies. In ons laboratorium, dit protocol is met succes en reproduceerbaar toegepast op een breed scala van weefsels, waaronder hoornvlies en voorste segment structuren, ooglid, traan en harderian klier, netvlies en oogzenuw, hart, long en luchtwegen, nier, lever, cremaster spier, en cerebrale cortex / medulla, en in een verscheidenheid van soorten, waaronder muis, rat, konijn, cavia, vis, monolayer en gelaagde celculturen, varken, niet-menselijke primaat, evenals mens2. Hoewel kleine veranderingen de moeite waard kunnen zijn voor specifieke weefsels en toepassingen, is dit algemene protocol zeer reproduceerbaar en nuttig gebleken in de context van onze kernbeeldvormingsfaciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren werden behandeld volgens de richtlijnen beschreven in de Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research en de University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de instellingen waar ze werden behandeld: muis-, ratten-, konijnen-, cavia- en niet-menselijke primatenprocedures werden goedgekeurd door de University of Houston Animal Care and Use Committee, zebravisprocedures werden goedgekeurd door de DePauw University Animal Care and Use Committee en varkensprocedures werden goedgekeurd door het Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Al het menselijk weefsel werd behandeld in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki met betrekking tot onderzoek naar menselijk weefsel en er werd een passende goedkeuring van de instellingscommissie verkregen.

1. Weefselverwerking

  1. Bereid een stamoplossing van 0,4 M natriumcacodylaatbuffer door natriumcacodylaatpoeder te mengen in ddH2O. Meng de buffer grondig en de pH stel de oplossing in op 7,3. Deze buffer wordt gebruikt om fixatieve (hieronder beschreven samenstelling in stap 1.3), wasbuffer, evenals osmium- en kaliumferrocyanideoplossingen te maken.
    OPMERKING: Perfusiefixatie is vaak de beste fixatiemethode voor SBF-SEM-studies, omdat fixatie snel en door het hele lichaam plaatsvindt. Als perfusiefixatie niet mogelijk is binnen je studieontwerp, ga dan naar stap 1.3.
  2. Voer perfusiefixatie uit met de juiste fysiologische druk voor het diermodel24,25,26. Dit gebeurt via transcardiale sequentiële perfusie met geïmpïneerde zoutoplossing gevolgd door fixatief, elk geplaatst op een specifieke hoogte (bijv. 100 cm) boven het organisme (aangepast aan de fysiologische druk van het vasculaire systeem in het diermodel), waarbij fixatief in de linkerventrikel stroomt en uit een incisie in het rechteratrium komt. Weefsel van belang zal bleek worden als bloed wordt vervangen door fixatief, als het geheel of een deel van uw weefsel niet blancheert, kan het zijn dat weefsel niet op de juiste manier wordt gefixeerd en dat ultrastructuur mogelijk niet wordt bewaard.
  3. Gebruik een scheermesje of scherpe scalpel om weefselmonsters in blokken van niet groter dan 2 mm x 2 mm x 2 mm te snijden. Als stap 1.2 is overgeslagen, doe dit dan snel zodat weefsel zo snel mogelijk kan worden ondergedompeld.
    1. Als alternatief kunt u weefsel onder fixatief ontleden en overbrengen naar vers fixatief om het onderdompelingsproces te voltooien. De uiteindelijke samenstelling van het fixatief bestaat uit 0,1 M natriumcacodylaatbuffer die 2,5% glutaraldehyde en 2 mM calciumchloride bevat. Laat de fixatie minimaal 2 uur bij kamertemperatuur en maximaal 's nachts bij 4 °C doorgaan. Gebruik indien mogelijk een tuimel-/kantelplaat om de monsters voorzichtig te roeren tijdens het bevestigen.
    2. Als alternatief, als er een inverter magnetron beschikbaar is, fixeer weefsel in het bovengenoemde fixatief onder vacuüm op 150 watt gedurende 4 cycli van 1 minuut aan, 1 minuut uit. Microgolffixatie is de voorkeursmethode voor stap 1.3 omdat het snel weefsel fixeert en weefsel ultrastructuurbehoudt 27.
      OPMERKING: Weefsel mag tijdens dit protocol nooit drogen, zorg ervoor dat weefsel snel van de ene oplossing naar de andere wordt overgedragen.
  4. Was vast weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten in totaal) op kamertemperatuur in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer met 2 mM calciumchloride.
  5. Maak de volgende osmium ferrocyanide oplossing vers, bij voorkeur tijdens de vorige wasstappen. Combineer een 4% osmium tetroxideoplossing (bereid in ddH2O) met een gelijk volume van 3% kaliumferrocyanide in 0,2 M cacodylaatbuffer met 4 mM calciumchloride. Na de vorige wasstap plaatst u het weefsel in deze oplossing gedurende 1 uur op ijs in het donker en in de zuurkast.
    OPMERKING: Osmiumtetroxide is een gele kristallijne stof die in een ampul wordt geleverd. Om de osmiumtetroxide-oplossing te maken, scheurt u de ampul open, voegt u ddH2O toe en soniceert u gedurende 3-4 uur in het donker totdat de kristallen volledig zijn opgelost. Osmium tetroxide oplossing is een heldergele oplossing, als de oplossing zwart is is het osmium verminderd en mag het niet meer gebruikt worden.
  6. Terwijl het weefsel in de osmium ferrocyanide-oplossing broedt, begint u met het bereiden van de thiocarbohydrazide (TCH) oplossing. Bereid deze oplossing vers en laat hem direct beschikbaar zijn aan het einde van de 1 uur durende osmium ferrocyanide fixatieperiode. Combineer 0,1 g thiocarbohydrazide met 10 ml ddH2O en plaats deze oplossing gedurende 1 uur in een oven van 60 °C. Om ervoor te zorgen dat de oplossing is opgelost, wervelt u voorzichtig om de 10 minuten. Filter deze oplossing voor gebruik door een spuitfilter van 0,22 μm.
  7. Was het weefsel vóór incubatie in TCH met kamertemperatuur ddH2O 5x gedurende elk 3 minuten (in totaal 15 minuten).
  8. Plaats het weefsel in de gefilterde TCH-oplossing gedurende in totaal 20 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1A-C).
  9. Na incubatie in TCH, was het weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten in totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  10. Plaats weefsel in ddH2O met 2% osmiumtetroxide (niet osmium verminderd met kaliumferrocyanide) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Dit moet gebeuren in de zuurkast en in het donker, omdat osmium kan worden verminderd door licht (bijv. onder aluminiumfolie) (Figuur 1D-F).
  11. Na osmium tetroxide incubatie, was weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  12. Plaats weefsel in 1% waterig uranylacetaat (uranylacetaatpoeder gemengd in ddH2O) 's nachts in een koelkast bij 4 °C.
  13. Vlak voordat u weefsel uit de koelkast haalt, bereidt u verse Walton's lood aspartaatoplossing. Begin met het oplossen van 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuuroplossing van 0,03 m (0,04 g asparaginezuur in 10 ml gedestilleerd water) en stel de pH in op 5,5 bij 1 N KOH (0,5611 g in 10 ml gedestilleerd water).
    LET OP: Bij het aanpassen van de pH kan een neerslag ontstaan. Dat is onaanvaardbaar.
    1. Voeg met behulp van een roerstaaf langzaam de 1 N KOH dropwise toe terwijl u de pH controleert. Verwarm de afgewerkte heldere loodoplossing gedurende 30 minuten voor in een oven van 60 °C. Als er een neerslag ontstaat, kan de oplossing niet worden gebruikt en moet een andere oplossing worden bereid.
  14. Haal het weefsel uit de koelkast en was elk 5x gedurende 3 minuten (15 minuten in totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  15. Plaats na het wassen het weefsel gedurende 30 minuten in de opgewarmde Walton-aspartaatoplossing met behoud van de temperatuur op 60 °C.
  16. Na incubatie in walton's lood aspartaat, was het weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten totaal) bijkamertemperatuurddH 2 O (Figuur 1G-I).
  17. Dehydrateer het weefsel door middel van een ijskoude acetonreeks (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% en 100% aceton (in ddH2O indien van toepassing) waardoor 10 minuten voor elke stap in de serie mogelijk is.
  18. Na de ijskoude uitdrogingsreeks plaatst u weefsel gedurende 10 minuten in aceton op kamertemperatuur.
    1. Formuleer gedurende deze tijd Embed 812 ACM hars. Gebruik het recept "harde mix" omdat het beter bestand is tegen stralingsschade. Meng de hars grondig en plaats het weefsel gedurende 4 uur in Embed 812:aceton (1:3 mix), gevolgd door Embed 812:aceton (1:1 mix) gedurende 8 uur of 's nachts, en tenslotte Embed 812:aceton (3:1 mix) 's nachts. Voer deze harsinfiltratiestappen uit bij kamertemperatuur.
  19. Plaats de volgende dag het weefsel 4-8 uur in 100% Embed 812, vervolgens in verse 100% Embed 812 's nachts en ten slotte in verse 100% Embed 812 gedurende 4 uur. Voer deze harsinfiltratiestappen uit bij kamertemperatuur.
    1. Vlak voor het inbedden, plaats een kleine hoeveelheid hars in een mengcontainer en meng langzaam (een houten stok kan worden gebruikt om te roeren) in koolstofzwart poeder totdat de hars verzadigd is met het poeder, maar nog steeds vloeibaar is en niet korrelig wordt. Het moet op dikke inkt lijken en langzaam van de houten stok kunnen druppelen zonder zichtbare klonten.
  20. Oriënteer de weefselmonsters in een siliconenrubberen mal en maak een foto zodat de monsteroriëntatie in het harsblok wordt geregistreerd en kan worden verwezen. Bedek de monsters in koolstofzwarte verzadigde hars aan de punt van de siliconenvorm en plaats de mal ~1 uur in een oven bij 65 °C.
    1. Plaats de mal op een helling om de hars aan de punt van de mal te bevatten waar deze het weefselmonster bedekt. Plaats een etiket met een identificatiemiddel voor experimenten/weefselmonsters in de mal aan de andere kant van de hars (figuur 2A).
  21. Haal de siliconen mal uit de oven en vul de rest van de mal met heldere hars (geen carbonzwart) en zorg ervoor dat het etiket zichtbaar blijft. Hard de hars doordrenkt met koolstofzwart genoeg uit om niet gemakkelijk te mengen met de heldere hars.
    1. Bereid een extra goed in de mal die geen weefsel bevat. Begin met de extra put, vul de rest van de mal met heldere hars.
    2. Als de koolstofzwarte hars in de heldere hars begint te bloeden, plaatst u de siliconenvorm gedurende extra tijd (bijv. 15 minuten) terug in de oven.
    3. Zodra alle weefselmonsters zijn afgesplijst met heldere hars, plaatst u de siliconenvorm gedurende 48 uur terug in de oven (plat, zonder helling) op 65 °C om het uithardingsproces te voltooien.

2. Blokvoorbereiding

OPMERKING: De methode is afhankelijk van hoe het monster in het blok is georiënteerd en hoe de doorsnede moet plaatsvinden. De meest voorkomende weefseloriëntatie vindt het weefsel echter gecentreerd in de punt van het harsblok, loodrecht op het lange uiteinde van het harsblok.

  1. Knip in de meeste gevallen eerst het uiteinde van het blok bij om het weefsel te lokaliseren door het monsterblok in de microtome-boorkop te plaatsen met het taps toelopende uiteinde ongeveer 5-6 mm uit de boorkop. Vergrendel het op zijn plaats met de ingestelde schroef en plaats het onder een warmtelamp.
  2. Na enkele minuten is het blok kneedbaar en gemakkelijk te trimmen. Plaats de boorkop in de stereomicroscoophouder en gebruik een nieuw scheermesje met dubbele rand om dunne secties parallel met het blokvlak te maken totdat het weefsel zichtbaar is. Dit is het best te zien door licht over het blokvlak te hengelen, het weefselmonster zal minder reflecterend en korrelig zijn in vergelijking met die delen van de hars die verstoken zijn van weefsel. Raadpleeg de foto die is genomen van weefselmonsters voorafgaand aan de introductie van koolstofzwarte verzadigde hars voor een idee van hoe en waar het weefsel zich bevindt.
  3. Zet één monsterpenhouder opzij voor trimmen. Deze speldhouder wordt nooit in de SEM-kamer geplaatst en kan daarom zonder handschoenen worden gehanteerd, dit wordt de trimpenhouder genoemd. Elke monsterhouder die bestemd is om in de beeldvormingskamer te worden geplaatst, mag nooit zonder handschoenen worden aangeraakt. Dit voorkomt het inbrengen van vet en olie in de microscoopkamer.
  4. Plaats een aluminium monsterpen in de trimpenhouder en draai de stelschroef iets vast met het vlak (vlakke oppervlak) van de pen 3-4 mm boven de penhouder.
  5. Maak verschillende diepe, kriskras krassen in het gezicht van de pin om een groter oppervlak te bieden voor de lijm die wordt gebruikt om het monster op zijn plaats te houden. Als een aluminium pen wordt gebruikt, wordt een kleine stalen platte schroevendraaier aanbevolen voor deze stap (figuur 2B).
  6. Plaats de boorkop met het weefselmonster terug onder de warmtelamp totdat de hars zacht en kneedbaar wordt en plaats deze vervolgens in de klauwplaat onder de stereomicroscoop.
  7. Gebruik een tweesnijdend scheermesje om overtollige hars weg te snijden van het deel van het harsblok dat het weefselmonster bevat. Uiteindelijk zal de grootte van het weefselblok dat aan de pin is bevestigd ongeveer 3 mm in diameter en 2-3 mm hoog zijn.
    1. Duw het scheermes voorzichtig recht naar beneden in het harsblok ongeveer 1-2 mm en duw het scheermes vervolgens voorzichtig horizontaal in het harsblok op een diepte die gelijk is aan de vorige snede. Doe dit langzaam en met grote zorg, omdat het mogelijk is om het deel van het blok met het weefselmonster te beschadigen of weg te snijden. Als de twee sneden samenkomen, zal de overtollige hars zich van het blok scheiden. Blijf hars verwijderen totdat er slechts een verhoogd oppervlak van 3 mm x 3 mm overblijft.
  8. Plaats na deze eerste trimming het blok (nog steeds in de boorkop) enkele minuten onder het warmtelampje.
  9. Zodra de hars zacht en kneedbaar wordt, plaatst u het blok terug onder de stereomicroscoop. Snijd met een nieuw scheermesje met twee kanten de bovenkant van het harsblok af, ongeveer 1 mm onder het bijgesneden gedeelte, met een enkele gladde snede. Een vlak oppervlak heeft de voorkeur omdat dit aan de specimenpen wordt gelijmd. Zorg ervoor dat het monster niet verloren gaat, omdat deze stap enige kracht vereist die naar het verwijderde deel van het blok kan worden overgedragen en ervoor kan zorgen dat het wegvliegt. Plaats het gesneden en bijgesneden monster opzij.
  10. Plaats de trimpenhouder met de gesneden aluminium pen in de stereomicroscoophouder. Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het punt van de pin, zodat deze de pin volledig bedekt zonder een zichtbare meniscus te vormen. Pak het bijgesneden stuk van het weefselblok met een tang en plaats het op de penvlak. Centreer het weefselmonster op de monsterpen. Duw het naar beneden en houd het enkele seconden vast. Laat de lijm enkele minuten intrekken.
  11. Wanneer de lijm goed droog is, plaatst u de trimpenhouder terug onder de stereomicroscoop. Vijl met behulp van een fijn vijl overtollige hars weg, zodat er geen hars overhangt. De harsvorm moet lijken op de ronde penkop.
  12. Zoek het weefsel op het verhoogde deel van uw harsblok, schuine verlichting is hiervoor nuttig. Met behulp van een scheermes met dubbele rand moet het verhoogde deel van de hars dat het weefselmonster bevat, worden bijgesneden tot een gebied dat niet groter is dan 1 mm2. Indien mogelijk kan het blokvlak nog kleiner worden bijgesneden, dit vermindert de belasting van het diamantmes en verbetert de levensduur.
    1. Verwijder zoveel mogelijk overtollige hars, waardoor het blok iets langer in één dimensie blijft. Dit gebeurt langzaam en met zorg, omdat het mogelijk is dat de hars die het weefselmonster bevat, afbreekt als er te veel kracht wordt uitgeoefend. Hoewel een scheermes wordt aanbevolen, kan een fijn metalen vijl voor deze stap worden gebruikt.
  13. Met een fijne metalen vijlhoek de overtollige hars, in het gebied buiten het verhoogde gedeelte dat het weefselmonster bevat, naar beneden naar de rand van de pen (figuur 2C).
  14. Verwijder harsdeeltjes en stof uit het voorbereide monster voordat u zilververf aanbrengt, gevolgd door goudsputteren. Meng zilver met aceton zodat het een gemakkelijk smeerbare vloeistof is, vergelijkbaar met nagellak (maar niet zo dun dat het van de applicator druipt) en breng een dunne laag aan op het hele monsterblokoppervlak. Aceton verdampt snel, dus het kan nodig zijn om extra aceton toe te voegen naarmate de zilververf begint te verdikken.
    1. Laat de zilververf 's nachts drogen voordat u in de microscoop laadt.
      OPMERKING: Deze zilverlaag moet dun zijn om te voorkomen dat het blokvlak groter wordt dan 1 mm x 1 mm, en hoewel de zilververf het diamantmes nooit heeft beschadigd, worden kleinere blokvlakken nog steeds aanbevolen om de levensduur van het diamantmes te behouden. De aceton vermengd met het zilver moet volledig verdampen voordat het monster in de microscoop sputtert of wordt geladen om te voorkomen dat acetondamp in de beeldvormingskamer wordt gebracht.
    2. Breng na het aanbrengen van zilververf een dunne laag goud aan op het monsterblok. Met behulp van een standaard vacuüm sputterapparaat uitgerust met een standaard goudfolie doel, zal een kamerdruk van 200 milliTorr (Argon gas) en 40 milliampère lopen gedurende 2 minuten resulteren in een 20 nm dikke gouden coating.
  15. Plaats na het coaten het gemonteerde en bijgesneden blok in een buis met het juiste experimentlabel erop. Maak aangepaste buizen met behulp van wegwerptransferpipetten.
    1. Snijd de transferpipet net onder de lamp, laat een kort deel van de transferpipetbuis onder het bolvormige uiteinde zitten. Verkort het buisvormige gedeelte dat is weggesneden en snijd de pipetpunt voldoende terug zodat de aluminium monsterpen er strak in kan worden geduwd.
    2. Plaats het uiteinde met de aluminium monsterpen in het bolvormige uiteinde van de gewijzigde transferpipet.
  16. Voordat u een voorbereid weefselblok laadt, knipt u voorzichtig overtollige zilververf van het oppervlak van het blokvlak weg.

3. SEM-instellingen voor het weergeven van het blokvlak

OPMERKING: De beeldvormingsinstellingen die volgen, zijn geproduceerd op het apparaat dat door de auteurs wordt gebruikt, dat wordt vermeld in de verstrekte tabel met materialen. Hoewel dit apparaat in staat is om beeldvorming met variabele druk te maken, werden de beste resultaten vastgelegd onder hoog vacuüm.

  1. Stilstaande tijd: Gebruik 12 μs/px tijdens seriële doorsneden. Wanneer een interessegebied is geïdentificeerd, kan een afbeelding met een hogere resolutie worden verkregen bij 32 μs/px.
  2. Vacuüminstellingen: Gebruik een pistooldruk van 9e-008 Pa, een kolomdruk van 1,1e-004 Pa en een kamerdruk van 9,5e-002 Pa.
  3. Opnametijd: Leg met de bovenstaande instellingen een px-afbeeldingsstapel van 2048x2048 vast met een snelheid van 50 seconden per afbeelding. Afbeeldingen met een hogere resolutie van regio's van belang kunnen worden vastgelegd op 4096x4096 px met iets minder dan 9 minuten per afbeelding.
  4. Sectiedikte: Gebruik 100-200 nm. Minder is mogelijk, maar kan een lagere bundelspanning, intensiteit of verblijftijd vereisen.
  5. Hoogspanning (HV): Gebruik 7-12 kV. Terwijl het verhogen van de spanning de vlekgrootte vermindert en resolutie verhoogt, introduceert het meer mogelijkheid voor straalschade. Hogere kV verhoogt de straalpenetratie, wat resulteert in verlies van details. Het verlagen van de kV degradeert echter de signaal-ruisverhouding (figuur 3)14.
  6. Straalintensiteit (BI): Het SBF-SEM-apparaat van de auteur biedt een straalintensiteitsschaal variërend van 1-20. Op deze schaal geven waarden van 5-7 kwaliteitsbeelden zonder overmatig opladen en stralingsschade. Hoe hoger de BI, hoe groter de resolutie, maar er is meer kans op opladen en bundelschade14.
  7. Vlekgrootte en beeldvergroting: Bepaal de vlekgrootte aan de de straalintensiteit en het spanningsniveau. Idealiter mag de vlekgrootte niet groter zijn dan de gebruikte pixelgrootte. De pixelgrootte wordt bepaald door het gezichtsveld (FOV) te delen door het aantal pixels. Een FOV van 25 μm met een beeldgrootte van 2048x2048 px zou bijvoorbeeld 12,2 nm per pixel geven. Daarom mag de spotgrootte niet groter zijn dan 12,2 nm. Figuur 4 laat zien hoe HV, BI en spotgrootte met elkaar samenhangen.
  8. Werkafstand (WD) - Bij blokgezichtsbeeldvorming is de werkafstand niet instelbaar. Het is gewoon een factor van focus. Het zal bijna identiek zijn voor alle afgebeelde blokken. Hoewel de werkafstand niet instelbaar is, speelt deze een cruciale rol in de resolutie van het vastgelegde beeld. Naarmate de werkafstand afneemt, neemt de resolutielimiet voor vastgelegde beelden toe. In sommige gevallen kan het mogelijk zijn om de werkafstand te verkleinen door wijzigingen aan te brengen in de beeldkamer, maar deze wijzigingen moeten naar goeddunken van de gebruiker worden aangebracht. Om de werkafstand te verkleinen en de beeldresolutie te vergroten, hebben we de microtomeschroeven van de deurbevestiging losgemaakt en de microtome verplaatst zodat deze ~ 2 mm dichter bij de bundeldetector rustte na het opnieuw vastdraaien van de schroeven.
  9. Resolutie - Met behulp van de bovenstaande instellingen is een x - y-resolutie tot 3,8 nm mogelijk. Het is belangrijk op te merken dat de resolutie wordt beperkt door de grootte van de bundelvlek en de pixelresolutie van de beeldopnamen (bijvoorbeeld een gezichtsveld van 20 μm dat is vastgelegd in een pixelafbeelding van 2048x2048 heeft een pixelresolutie van 9,8 nm, zelfs als een spotgrootte van 3,8 nm is gebruikt). Beeldresolutie in het z-vlak is afhankelijk van doorsnededikte, we merken dat 100-200 nm goed werkt met dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muis Cornea
Dit protocol is uitgebreid toegepast op het hoornvlies van de muis. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming bleek een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels (EFMBs) aanwezig te zijn in het volwassen muis hoornvlies. Eerder werd aangenomen dat dit netwerk alleen aanwezig was tijdens embryonale en vroege postnatale ontwikkeling. SBF-SEM onthulde een uitgebreid EFMB-netwerk in het hele hoornvlies, met individuele vezels met een diameter van 100-200 nm wanneer gemeten in doorsnede. Er werd o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit methodedocument is om de weefselvoorbereidings- en beeldvormingsmethodologie te benadrukken die ons lab in staat heeft gesteld om op betrouwbare wijze seriële elektronenmicroscopiebeelden met hoge resolutie vast te leggen, en om te wijzen op kritieke stappen die tot dit resultaat leiden, evenals mogelijke valkuilen die kunnen optreden bij het uitvoeren van SBF-SEM-beeldvorming. Succes met behulp van dit protocol vereist een goede fixatie van weefsel, impregnatie van zware metalen in het monster, wijzigin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown en Margaret Gondo bedanken voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd deels ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 en P30 EY007551 (National Eye Institute), deels door de Lion's Foundation for Sight, en deels door NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1/16 x 3/8 Aluminium RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Gebruikt als monsterpinnen.
2.5mm Flathead SchroevendraaierWiha Quality Tools27225
AcetonElectron Microscopy SciencesRT 10000Gebruikt om zilververf te verdunnen.
AsparaginezuurSigma-AldrichA8949
CalciumchlorideFisherScientificC79-500
Geleidende ZilververfTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device uitgerust met standaard goudfolie doelwitDenton VacuumN/ADit is het goud-sputteringapparaat dat door de auteurs is gebruikt, alternatieven zijn acceptabel.
Dubbelzijdige ScheermesjesFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 gemonteerd in een Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/ADit is het SBF-SEM-apparaat dat door de auteurs is gebruikt, alternatieven zijn acceptabel.
Glazen flacons, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Superlijm - Impact ToughNANAIn de tekst aangeduid als cyanoacrylaatlijm.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDIn de tekst aangeduid als roet.
KOHFisherScientific18-605-593
LoodnitraatFisher ScientificL62-100
MicrogolfovenPelcoBioWave ProDit is de magnetron die door de auteurs is gebruikt, alternatieven zijn acceptabel.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Kalium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone InbeddingsvormTed Pella10504
Natrium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetThermoFisher Scientific202Gebruikt om monsterpinopslagbuizen te maken.
Zwitserse NaaldvijlElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetaatPolysciences, Inc.21447-25
Reconstructiesoftware
Amira SoftwareThermo ScientificN/AGebruikt om de reconstructies in figuren 5-7 en 9 te maken.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 kan aan Fiji worden toegevoegd om te helpen bij handmatige segmentatie.
Microscoopbeeldbrowser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstruct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AStaat reconstructie in virtual reality en histogram-gebaseerde reconstructiemethoden toe.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329(2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985(2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11(2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107(2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721(2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434(2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388(2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53(2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801(2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910(2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357(2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173(2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Serial Block Face SEMTissue PreparationThree Dimensional ImagingResin EmbeddingTissue UltrastructureImage AcquisitionElectron Microscopy ArtifactsCorneal Nerve Imaging

Gerelateerde artikelen