Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De katoenbolworm, Helicoverpa armigera, is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Een combinatie van moleculaire genetica, fysiologie, functionele genomica en gedragsstudies heeft van H. armigera een modelsoort gemaakt in Lepidoptera Noctuidae. Om de in vivo functies van en interacties tussen verschillende genen te bestuderen, is geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / geassocieerd eiwit 9 (Cas9) genoombewerkingstechnologie een handige en effectieve methode die wordt gebruikt voor het uitvoeren van functionele genomische studies. In deze studie bieden we een stapsgewijze systematische methode om gen knock-out in H. armigera te voltooien met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Het ontwerp en de synthese van gids-RNA (gRNA) worden in detail beschreven. Vervolgens worden de volgende stappen, bestaande uit genspecifiek primerontwerp voor het maken van gids-RNA (gRNA), embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantendetectie samengevat. Ten slotte worden advies en opmerkingen over het oplossen van problemen verstrekt om de efficiëntie van genbewerking te verbeteren. Onze methode zal dienen als referentie voor de toepassing van CRISPR/Cas9 genoombewerking in H. armigera en andere Lepidoptera motten.
Inleiding
De toepassing van genoombewerkingstechnologie biedt een efficiënt hulpmiddel om doelgenmutanten in diverse soorten te bereiken. De opkomst van het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) systeem biedt een nieuwe methode om genomen te manipuleren1. Het CRISPR/Cas9-systeem bestaat uit een geleidings-RNA (gRNA) en het Cas9-endonuclease2,3, terwijl het gRNA verder kan worden onderverdeeld in twee delen, een doel complementair CRISPR-RNA (crRNA) en een trans-activerend crRNA (tracrRNA). Het gRNA integreert met Cas9 endonuclease en vormt ee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Ontwerp van genspecifieke primers en bereiding van sgRNA
- Verifieer een geconserveerd genomisch gebied in het gen van belang door middel van PCR-amplificatie- en sequencinganalyses. Amplificeer het doelgen uit het genoom-DNA van H. armigera en onderscheid de exonen en introns.
OPMERKING: De sequentiespecificiteit van de gidssite is noodzakelijk om off-target genbewerking te voorkomen. Zoek mogelijke gidsplaatsen in de exonen liggen dicht bij de 5' UTR van het gen. Dan is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het gen volledig niet-functioneel is. Een samenvatting van het stromingspad voor de bereiding van sgRNA is geïllustreerd in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor het verkrijgen van gen knock-out lijnen van H. armigera met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De representatieve resultaten verkregen door dit protocol worden samengevat voor gDNA-selectie, embryoverzameling en -injectie, insectenopfok en mutantendetectie.
In deze studie bevond de doelplaats van ons interessante gen zich in zijn tweede exon (figuur .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De toepassing van het CRISPR/Cas9-systeem heeft krachtige technische ondersteuning geboden voor de analyse van de genfunctie en interactie tussen verschillende genen. Het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, toont de generatie van een homozygote mutant in H. armigera via CRISPR / Cas9-genoombewerking. Deze betrouwbare procedure biedt een eenvoudige manier voor gerichte genmutagenese bij H. armigera.
De keuze van crispr-doellocaties kan van invloed zijn op de
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 voor GW en 31171912 voor CY).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | aangeduid als "capillary glass" in het protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | gebruikt voor mutant detectie |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Referenties
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
