R-lusanalyse door dot-blot

Summary

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode die de R-lus kwantificeert, een driestrengs nucleïnezuurstructuur die bestaat uit een RNA-DNA-hybride en een verplaatste DNA-streng.

Abstract

De driestrengige nucleïnezuurstructuur, R-loop, wordt steeds meer erkend voor zijn rol bij genregulatie. Aanvankelijk werd gedacht dat R-lussen de bijproducten van transcriptie waren; maar recente bevindingen van minder R-lussen in zieke cellen maakten duidelijk dat R-lussen functionele rollen spelen in een verscheidenheid aan menselijke cellen. Vervolgens is het van cruciaal belang om de rol van R-lussen te begrijpen en hoe cellen hun overvloed in evenwicht brengen. Een uitdaging in het veld is de kwantificering van R-lussen, aangezien veel van het werk berust op het S9.6 monoklonale antilichaam, waarvan de specificiteit voor RNA-DNA-hybriden in twijfel is getrokken. Hier gebruiken we dot-blots met het S9.6-antilichaam om R-lussen te kwantificeren en de gevoeligheid en specificiteit van deze test aan te tonen met RNase H, RNase T1 en RNase III die respectievelijk RNA-DNA-hybriden, enkelstrengs RNA en dubbelstrengs RNA splitsen. Deze methode is zeer reproduceerbaar, maakt gebruik van algemene laboratoriumapparatuur en reagentia en levert binnen twee dagen resultaten op. Deze test kan worden gebruikt in onderzoeks- en klinische omgevingen om R-lussen te kwantificeren en het effect van mutaties in genen zoals senataxine op de overvloed aan R-lus te beoordelen.

Introduction

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor een dot-blot-test die een snelle vergelijkende beoordeling mogelijk maakt van de overvloed aan R-loop, een driestrengige nucleïnezuurstructuur. R-lus ontstaat wanneer RNA een dubbelstrengs DNA binnendringt om een RNA-DNA-hybride te genereren en de andere DNA-streng te verplaatsen. R-lussen worden aangetroffen in verschillende stadia van de levenscyclus van RNA. In het transcriptiecomplex wordt het ontluikende RNA gesynthetiseerd complementair aan het sjabloon-DNA en wordt de niet-sjabloonstreng verplaatst. De korte RNA-DNA-hybride (<10 bp) wordt opgelost om het ontluikende RNA vrij te maken, zodat het het RNA-polymerasecomplex kan verlaten via het uitgangskanaal ^1,2. Buiten het transcriptiecomplex bevindt het ontluikende RNA zich dicht bij zijn DNA-sjabloon, die nog enigszins is afgewikkeld door te worden gekopieerd, dus het RNA kan opnieuw hybridiseren met zijn sjabloon-DNA en R-lussen 3 vormen. Bovendien kunnen R-lussen worden gevormd wanneer replicatie- en transcriptiecomplexen botsen⁴, en bij antisense-transcriptie⁵. Gezien de vele mogelijkheden voor hun vorming, zijn R-lussen niet zeldzaam en kunnen ze worden aangetroffen in 3-5% van het menselijk genoom⁶, afhankelijk van de transcriptiestatus van de cel. R-lussen worden aangetroffen in genpromotors⁷ en terminatie^5-plaatsen in mRNA, en langs ribosomaal RNA⁸ en transfer-RNA⁹. R-lussen bevinden zich ook in telomere gebieden van chromosomen.

R-loops spelen een regulerende rol. Ze reguleren genexpressie door transcriptie bij promotors^{te beïnvloeden 10,11}, klasse-switch-recombinatie te mediëren¹² en op CRISPR gebaseerde genoombewerking te vergemakkelijken 13,14,15. Zoals veel cellulaire gebeurtenissen, wordt de overvloed aan R-lus strak getitreerd; te veel of te weinig R-lussen hebben invloed op de normale celfunctie^16,17. R-lussen worden gereguleerd door een verscheidenheid aan eiwitten, waaronder RNase H, senataxine en andere helicasen die de RNA-DNA-hybriden afwikkelen 18,19,20,21,22.

Om de overvloed aan R-lussen te monitoren, verrijken genoombrede methoden eerst voor R-lussen met het antilichaam S9.6 ^8,23,24 of met andere nucleasen 25, waaronder RNase H 10,26,27, en beoordelen vervolgens het aantal verrijkte R-lussen door middel van sequencing. Vroege versies van deze op sequencing gebaseerde methoden bereikten geen adequate sequentiedekking om nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken, maar snelle verbetering in sequencingtechnologieën maakt nu locus-voor-locus R-lusanalyse mogelijk. Immunofluorescentietechnieken zijn ook gebruikt om R-lussen te kwantificeren en te lokaliseren^10,17. Deze methoden zijn veelomvattend, maar ze zijn niet praktisch in veel klinische omgevingen of als eerste beoordelingen, omdat ze dure apparatuur en gespecialiseerde analyse vereisen.

Er is een procedure nodig die uniform kan worden uitgevoerd in verschillende laboratoria in klinische omgevingen. Dot-blots bieden een dergelijke optie, omdat ze kunnen worden uitgevoerd zonder specifieke apparatuur of computationele analyse. Als voorbereidende stap of in klinische omgevingen om de effecten van mutaties op R-lussen te evalueren, moeten deze dot-blots gevoelige en specifieke resultaten opleveren. Hier beschrijven we onze test die specifiek R-lussen identificeert; het sluit signalen uit van dubbelstrengs (ds) DNA, dubbelstrengs RNA en enkelstrengs RNA. Ons protocol gebruikt het S9.6-antilichaam²⁷ om RNA-DNA-hybriden in R-lussen te identificeren en bevat RNase H, een endoribonuclease dat splitst en daarom leidt tot de afbraak van het RNA in een RNA-DNA-hybride ^20,28, om ervoor te zorgen dat de gedetecteerde signalen die van hybriden zijn. We hebben ook RNase T1 opgenomen dat enkelstrengs RNA splitst bij guanine^29,30, en RNase III dat dubbelstrengs RNA splitst, inclusief stamlussen ^31,32 om te controleren op niet-specifieke signalen. Het S9.6-antilichaam herkent RNA-DNA-hybriden van verschillende lengtes, zelfs die welke slechts 8 nucleotiden lang zijn³³.

Hier presenteren we het protocol dat begint met nucleïnezuurisolatie, gevolgd door dot-blot-voorbereiding en R-lusdetectie met S9.6-antilichaam. Ons protocol bevat stappen om ervoor te zorgen dat gelijke hoeveelheden samples worden geladen en dat de signalen specifiek zijn. Het levert oligonucleotiden om te dienen als positieve en negatieve controles. Dit is een snelle, gemakkelijke en gebruiksvriendelijke methode om de overvloed aan R-loop te beoordelen.

Protocol

1. Cellyse voor nucleaire fractionering

1. Spoel cellen twee keer met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder cellen uit weefselkweekschalen met behulp van standaard celdissociatietechnieken zoals trypsine. Tel cellen met behulp van een hemocytometer.
   OPMERKING: De hieronder beschreven stappen werden gebruikt voor de analyse van primaire fibroblasten van de menselijke huid, hoewel een reeks celtypen kan worden getest. Fibroblasten werden gekweekt in basale media die 10% foetaal runderserum bevatten. Als alternatief kan cellysebuffer (tabel 1) na het wassen direct aan de celcultuur worden toegevoegd.
2. Breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml om de cellen te pelleteren.
3. Centrifugeer het monster bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspireer de media.
4. Was twee keer met ijskoude 1x PBS met behulp van centrifugatie-instellingen in stap 1.3.
5. Voeg koude cellysebuffer (tabel 1) toe aan de celpellet (300 μL per 2 x 10⁶ cellen). Pipetteer op en neer om de pellet opnieuw te suspenderen.
6. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
7. Draai 5 minuten op 500 x g om de kernen te pelleteren.
8. Gooi het bovenstaande weg en suspenseer de nucleaire pellet opnieuw in 400 μl koude nucleaire lysisbuffer (tabel 1).
9. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
   OPMERKING: Fractionering van de nucleaire en cytoplasmatische compartimenten van de cellen zorgt voor signaalspecificiteit. De kwaliteit van nucleaire en cytoplasmatische scheiding kan worden geëvalueerd voordat verder wordt gegaan (Tabel 2).
10. Voeg 3 μl 20 mg/ml proteïnase K toe en incubeer gedurende 3-5 uur bij 55 °C.
    OPMERKING: De aangegeven volumes zijn voor 2 x 10⁶ cellen, schaal omhoog of omlaag indien nodig.

2. Zuivering van genomisch DNA (inclusief RNA-DNA-hybriden)

1. Als DNA stroperig is, voer dan sonicatie uit om de viscositeit te verminderen (bijv. sonicatie met hoog vermogen, 30 s AAN/ 30 s UIT, gedurende 2 minuten met behulp van een waterbad van 4 °C).
2. Voeg 400 μL elutiebuffer (Tabel 1) en 400 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1 pH 8,0) toe.
3. Vortex voor 10 s.
4. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten op 4 °C.
5. Breng de waterfase (ongeveer 350 μl) over naar een nieuwe buis.
6. Eenmaal extraheren met 1 volume chloroform, 10 s vortex en vervolgens 5 minuten bij 4 °C op 12.000 x g centrifugeren. Breng de waterfase over naar een nieuw buisje (ongeveer 300 μL).
7. Voeg 35 μL 3 M natriumacetaat (pH 5,2), 1 μL glycogeen en 700 μL ijskoude 100% ethanol toe.
8. Vortex gedurende 10 s en spin naar beneden op 12.000 x g gedurende 30 minuten op 4 °C.
9. Was de korrel met 1 ml 70% ethanol.
10. Vortex gedurende 10 s en centrifugeer naar beneden op 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
11. Gooi het bovenstaande weg en laat de pellet aan de lucht drogen.
12. Voeg 12 μL elutiebuffer en vortex gedurende 10 s toe om opnieuw te suspenderen. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C met agitatie of een nacht bij 4 °C om de pellet opnieuw te suspenderen.
13. Meet de DNA-concentratie met behulp van standaard spectrofotometrie.
    OPMERKING: De aangegeven volumes zijn voor 2 x 10⁶ cellen, schaal omhoog of omlaag indien nodig. DNA (met RNA-DNA-hybriden) kan indien nodig worden bewaard bij -20 °C.

3. Het deppen van DNA-monsters (waaronder RNA-DNA-hybriden) op nylon membranen

1. Bereid verdunningen van nucleïnezuren tot de gewenste concentraties in elutiebuffer (d.w.z. 50 ng/μl, 25 ng/μl of 12,5 ng/μl). Deze monsters met een bereik van concentraties (200, 100, 50, 25, 12,5 ng) zorgen ervoor dat er signalen binnen het lineaire bereik zijn.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u voldoende monster voorbereidt voor technische en biologische replicaten, en voor de verschillende RNase-behandelingen, zie stap 5.
2. Bereid een positief geladen nylon membraan voor zodat er ruimte is voor elk monster van 2 μL om een gebied van 0,5 cm2 in te nemen.
3. Spot 2 μL van elk monster op 2 membranen: een voor het S9.6-antilichaam en de andere voor dsDNA-antilichaam. Als alternatief kan een dot-blot- of slot-blot-apparaat worden gebruikt waarmee monsters met grotere volumes kunnen worden geladen.
4. Laat de monsters in het membraan verzadigen. Wacht minstens 2 minuten voordat u het membraan verknoopt met UV-licht.
5. Plaats het membraan in het midden van het UV-apparaat en verknoop het membraan met behulp van een UV-crosslinker met behulp van de instelling "Auto Crosslink" (1,200 μJ x 100).

4. RNA-DNA hybride detectie met S9.6-antilichaam

1. Incubeer het membraan in een blokkerende oplossing (5% melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker.
   OPMERKING: Er moet voldoende blokkeeroplossing zijn om het membraan te bedekken.
2. Incubeer de vliezen een nacht in primair antilichaam (in 5% melk in TBST) bij 4 °C met schudden. Voeg anti-dsDNA-antilichaam (1:10.000 verdunning) toe aan één membraan. Voeg 1 μg/ml S9.6-antilichaam toe aan het tweede membraan (verdunning 1:1.000).
   OPMERKING: S9.6-antilichaam is in de handel verkrijgbaar of bij Dr. S. Leppla, NIAID, National Institutes of Health.
3. Verwijder primaire antilichamen en was 3x met TBST. Voer elke wasbeurt 5-10 minuten uit met schudden op kamertemperatuur.
4. Incubeer met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam (anti-muis, 1:5.000 verdunning) in 5% melk in TBST met schudden bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Anti-dsDNA en anti-RNA-DNA-hybride zijn beide muizenantilichamen.
5. Verwijder het secundaire antilichaam en was 3x met TBST gedurende 5-10 minuten met schudden op kamertemperatuur.
6. Ontwikkel met verbeterde chemiluminescentie (ECL) reagentia om signalen te verkrijgen voor beeldvorming.
7. Kwantificeer de signaalintensiteit met behulp van standaard beeldverwerkingstools zoals ImageJ.
   OPMERKING: Het oplossen van problemen wordt beschreven in Tabel 2.

5. Ribonucleasebehandelingen om de signaalspecificiteit te evalueren

OPMERKING: RNase-behandeling moet worden uitgevoerd op de nucleïnezuurmonsters om de specificiteit van S9.6-binding aan te tonen. Behandeling met RNase H, maar niet met RNase T1 of RNase III zou moeten resulteren in een vermindering van de S9.6-immunokleuring.

1. Verwerk de monsters met RNA-DNA-hybriden door ze in vier afzonderlijke buisjes te bereiden. Behandel elk van de 4 monsters met 5 U RNase H, 1000 U RNase T1, 0,5 U RNase III of mock. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 °C in volumes van 20 μl.
2. Laad 2 μl van elk monster op een membraan zoals beschreven in rubriek 3.

6. Bereiding van oligonucleotidecontroles om de signaalspecificiteit te evalueren

OPMERKING: Oligonucleotidecontroles kunnen worden gebruikt om de specificiteit van S9.6-binding aan te tonen. S9.6 herkent RNA-DNA-hybriden, maar geen dsDNA- of dsRNA-controles, zoals eerder is gerapporteerd³⁴.

1. Los oligonucleotiden (tabel 3) op in gloeibuffer (10 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) tot 100 μM.
2. Bereid 4 reactiebuizen voor
   1. RNA-DNA-hybride #1: Meng 10 μL ssRNA-topstreng met 10 μL ssDNA-onderstreng en 80 μL gloeibuffer.
   2. RNA-DNA-hybride #2: Meng 10 μL ssDNA-topstreng met 10 μL ssRNA-onderstreng en 80 μL gloeibuffer.
   3. dsRNA: Meng 10 μL ssRNA-topstreng met 10 μL ssRNA-onderstreng en 80 μL gloeibuffer.
   4. dsDNA: Meng 10 μL ssDNA bovenste streng met 10 μL ssDNA onderste streng en 80 μL gloeibuffer.
3. Verwarm de 4 mengsels uit stap 6.2 gedurende 10 minuten op 95 °C.
4. Laat de buizen langzaam afkoelen tot kamertemperatuur om het opnieuw gloeien van de strengen mogelijk te maken. Gegloeide standaarden kunnen bij -20 °C worden bewaard voor later gebruik.
   OPMERKING: De efficiëntie van het gloeien moet worden gecontroleerd door niet-denaturerende gelelektroforese. Duplexen migreren langzamer dan de niet-gegloeide oligonucleotiden (Tabel 2).
5. Laad 2 μL van elk monster op 2 membranen, één voor S9.6-antilichaam en één voor dsDNA-antilichaam, zoals beschreven in sectie 3.
6. Voer de stappen uit die worden beschreven in sectie 4.

7. Kwantificering en normalisatie van de signaalintensiteit van S9.6 R-loop met behulp van ImageJ.

1. Sla afbeeldingen van S9.6, dsDNA-kleuring op in TIFF-formaat en analyseer ze met behulp van de ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/).
2. Selecteer de optie voor het omkeren van de afbeelding (Bewerken | Omkeren). Na inversie is elke stip zichtbaar als wit tegen een donkere achtergrond.
3. Gebruik de tool voor het selecteren van ovale afbeeldingen om een ovaal te selecteren die groot genoeg is om de grootste stip op de afbeelding te omringen.
4. Gebruik de ROI-manager om het geselecteerde gebied voor kwantificering toe te voegen. Zorg ervoor dat de opties "Alles weergeven" en "Labels" zijn geselecteerd, zodat de interessegebieden kunnen worden gevisualiseerd.
5. Gebruik hetzelfde ovale selectiegebied dat tijdens stap 7.3 is gebruikt om extra interessegebieden toe te voegen rond elk punt dat moet worden gekwantificeerd. Gebruik de snelkoppeling Command + Shift + E om het geselecteerde gebied uit stap 7.3 naar elk van de volgende stippen te kopiëren.
6. Meet de geïntegreerde dichtheid van elk van de interesseregio's.
7. Deel de S9.6-signaalintensiteit voor elk monster door de meting van dsDNA om de S9.6/dsDNA-signaalverhouding te verkrijgen. Verifieer de resultaten door de experimenten te herhalen (ten minste drievoud voor zowel S9.6- als dsDNA-signaalacquisitie). De standaardfout van het gemiddelde kan worden berekend uit de signaalverhoudingen van S9.6/dsDNA.

Results

Enzymatische behandeling om de specificiteit van S9.6 (RNA-DNA) antilichaam te evalueren.
Primaire fibroblasten van de menselijke huid werden gekweekt¹⁷. DNA met RNA-DNA-hybriden werd geïsoleerd en gekwantificeerd. Twee μg van de monsters werd gedurende 15 minuten bij 37 °C verteerd met RNase T1, RNase H of RNase III. Een proefmonster werd ook geanalyseerd ter vergelijking met de met RNase behandelde monsters. Monsters (200, 100, 50, 25, 12,5 of 6,25 ng) werden op twee verschillende membranen gedept, zoals beschreven in sectie 3. De membranen werden verknoopt, geblokkeerd en een van hen werd onderzocht met S9.6-antilichaam (Figuur 1A).

De resultaten toonden aan dat het S9.6-signaal correleert met de overvloed van het geladen monster. Behandeling met RNase H, maar niet met RNase T1 of RNase III resulteert in een vermindering van de S9.6-kleuring.

Een tweede membraan werd onderzocht met een dsDNA-antilichaam (Figuur 1B) voor de normalisatie. Afbeelding J werd gebruikt om de signaalintensiteiten te analyseren. De 50 ng-monsters werden geselecteerd voor kwantificering omdat de signaalintensiteiten van de S9.6- en dsDNA-antilichamen binnen het dynamische bereik lagen. Signaalintensiteiten werden genormaliseerd naar die in nepmonsters. De gegevens worden weergegeven in figuur 2.

S9.6 antilichaam dot-blot met behulp van synthetische nucleotidecontroles.
Om de specificiteit van het S9.6-antilichaam te evalueren, gebruikten we oligonucleotiden die overeenkomen met dsRNA, dsDNA en RNA-DNA zoals beschreven in sectie 6. Een verdunningsreeks van RNA-DNA-, dsRNA- en dsDNA-nucleotiden werd bereid en op het nylonmembraan gedept zoals beschreven in sectie 3. Het membraan werd onderzocht met het S9.6-antilichaam (Figuur 3). De resultaten toonden aan dat het S9.6-antilichaam specifiek bindt aan RNA-DNA-hybriden op een dosisafhankelijke manier en minimale kruisreactiviteit vertoonde met dsRNA's en dsDNA's.

Figuur 1: Specificiteit van S9.6 zoals aangetoond door dot-blot geladen met nucleïnezuren van menselijke fibroblasten. Nucleïnezuurmonsters van menselijke fibroblasten werden ofwel nagebootst behandeld of behandeld met RNase T1, RNase H of RNase III en vervolgens op nylonmembranen geladen in een verdunningsreeks van 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 ng per 2 μL dot. Membranen werden vervolgens onderzocht met S9.6-antilichaam (A) of dsDNA-antilichaam (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kwantificering van S9.6 R-luskleuring. 50 ng-monsters uit figuur 1 werden geselecteerd voor kwantificering met ImageJ. Het S9.6-signaal werd gedeeld door de intensiteit van het dsDNA-signaal en vervolgens genormaliseerd naar het nepmonster volgens de stappen die in sectie 7 worden beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: S9.6 dot-blot met behulp van oligonucleotidecontroles. S9.6 antilichaam dot-blot tegen een verdunningsreeks van synthetische oligonucleotiden als dsRNA, dsDNA of RNA-DNA-hybride. S9.6 bindt specifiek aan RNA-DNA-hybriden op een dosisafhankelijke manier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cel lysis buffer	Voor 10 ml	Voor 200 ml	Finale Conc.
Water, nucleasevrij	9 ml	180 ml	-
10% NP-40	0,5 ml	10 ml	0.5%
2M KCl	0,4 ml	8 ml	80 mM
0,5 M LEIDINGEN (pH 8,0)	100uL	2 ml	5 miljoen meter
Nucleaire lysis buffer	Voor 10 ml	Voor 200 ml	Finale Conc.
Water, nucleasevrij	8,65 ml	173 ml	-
10% SDS	1 ml	20 ml	1%
1M Tris-HCl (pH 8,0)	0,25 ml	5 ml	25 mM
0,5 miljoen EDTA	100uL	2 ml	5 mM
Elutie buffer	Voor 10 ml	Voor 200 ml	Finale Conc.
1M Tris-Cl, pH 8,5	0,1 ml	2 ml	10 mM
Water, nucleasevrij	9,9 ml	198 ml	-

Tabel 1. Voorbereiding van buffers

Stap	Probleem	Mogelijke reden	Oplossing
1.9	N.V.T	Controleer de celfractionering	De kwaliteit van nucleaire en cytoplasmatische scheiding kan worden geëvalueerd door standaard proteaseremmercocktails toe te voegen aan de cel- en nucleaire lysisbuffers (Tabel 1).  De cytoplasmatische en nucleaire fracties kunnen worden geëvalueerd door middel van western blotting-analyse om een adequate beperking van labeling met cytoplasmatische markers (bijvoorbeeld GAPDH of HSP90) in cytoplasmatische fracties en labeling met nucleaire markers (bijvoorbeeld HDAC1 of Histone H3) in nucleaire fracties te bevestigen. De bijdrage van mitochondriale contaminatie in de nucleaire fractie kan worden geëvalueerd door middel van qPCR-analyse met sondes die specifiek zijn voor mitochondriaal DNA.
2.1	Monster is te stroperig	Het celnummer is te hoog.	Verminder het DNA met de helft en ga verder met de sonicatiestap 2.1
2.12	Geen zichtbare korrel	Onvoldoende uitgangsmateriaal of verlies tijdens de winning.	Begin vanaf het begin met het gebruik van meer cellen.
2.13	Lage DNA-concentratie
3.1	Niet genoeg DNA voor verdunningen
3.4	Het monster verzadigt niet in het membraan		Week het membraan in 1x TBST. Laat overtollige buffer drogen en begin bij stap 3.4
4.6	Er wordt een fragmentarisch of gespikkeld patroon gedetecteerd		Voeg 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe aan het monster en ga verder bij stap 3.1
4.6	De stippen hebben het uiterlijk van een "koffiering"		Voeg 0,01% Sarkosyl toe aan de steekproef en ga verder bij stap 3.1
5.2	De RNaseH-controle vertoont geen afname van het signaal	De ribonuclease-vertering is onvolledig.	Verhoog de incubatie of verhoog de enzymconcentratie.
6.5	Geen signaal voor de oligo-besturing	Duplex werd niet gevormd. Oligonucleotiden waren niet goed gegloeid.	Controleer de verhoudingen van oligonucleotiden en gloeibuffer.
6.5	S9.6-signaal is niet specifiek voor hybrides	S9.6-antilichaambatch heeft niet-specifieke binding	Valideer de gevoeligheid en specificiteit van nieuwe batches S9.6-antilichamen met behulp van RNase-enzymbehandelingen of synthetische oligonucleotide-analyse.

Tabel 2: Problemen oplossen

ssRNA, bovenste streng	5'-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3'
ssDNA, bovenste streng	5'-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3'
ssRNA, onderste streng	5'-GGGAUCAGUGGUUCCCAUAUCCCGGACGAGCCCCCA-3'
ssDNA, onderste streng	5'-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3'

Tabel 3. Controle oligonucleotidesequenties

Discussion

De 3-strengs nucleïnezuren, R-lussen, vormen zich in verschillende stadia tijdens de levenscyclus van RNA en blijken steeds vaker cellulaire processen te reguleren. Om R-lussen volledig te begrijpen, zijn betrouwbare technieken voor R-lusdetectie noodzakelijk. Hier beschrijven we een benadering om de overvloed aan R-lussen te ondervragen met behulp van S9.6-antilichaam ^8,23,24. Deze methode maakt een snelle beoordeling mogelijk van de R-lus-abundantie van cellen en weefselkweekmonsters. Er is geen speciale apparatuur of een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal voor nodig. Het zorgt voor specifieke en reproduceerbare resultaten met behulp van een combinatie van RNase-behandelingen.

Sommigen hebben hun bezorgdheid geuit over de specificiteit van het S9.6-antilichaam. Zoals bij elk reagens, kan er variabiliteit van batch tot batch zijn met het S9.6-antilichaam. Ons protocol omvat RNase H, RNase T1 en RNase III om de signaalspecificiteit te controleren. Daarnaast gebruiken we synthetische oligonucleotiden om de specificiteit van elke batch S9.6-antilichamen te garanderen.

R-lusbiologie is een groeiend veld; de ontwikkeling van betrouwbare detectie- en kwantificeringsmethoden, zoals degene die hier wordt gepresenteerd, zal mechanistische studies vergemakkelijken om op te helderen wanneer R-lussen worden gevormd, hoe ze worden gereguleerd en wat ze reguleren. Met de juiste controles is deze dot-blot-test een eenvoudige methode om te screenen op overvloed aan R-lus in klinische en onderzoeksomgevingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-dsDNA antibody	Abcam	ab27156
Anti-RNA-DNA hybrid antibody (S9.6)	Kerafast	ENH001
Biorupter sonicator	Diagenode	UCD-200
EB Buffer	Qiagen	19086
EDTA (0.5M)	Invitrogen	AM9261
Hybond N+ nylon membrane	GE healthcare Life Sciences	RPN203B
KCl (2M)	Invitrogen	AM9640G
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	I8896
PBS	Invitrogen	10010-023
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Invitrogen	15593031
PIPES (0.5M, pH 8.0)	VWR	AAJ61406-AE
Proteinase K	Qiagen	19131
RNase III	Invitrogen	AM2290
RNase H	New England Biolabs	M0297
RNase T1	ThermoFisher Sci.	EN0541
SDS (10%)	Invitrogen	15553027
sodium acetate (3M, pH 5.2)	Invitrogen	AM9740
Tris-buffered saline (10X)	Corning	46-012-CM
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	KD Medical	RGF-3360
TrypLE	Invitrogen	12605010
Tween-20	Sigma	P9416
UV Stratalinker 2400	Stratagene	Stratalinker 2400
Whatman marking pen	Sigma	WHA10499001