Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een muismodel voor chronische pancreatitis via galweg TNBS-infusie

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

28 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Chronische pancreatitis (CP) is een ziekte die wordt gekenmerkt door ontsteking en fibrose van de alvleesklier, vaak geassocieerd met hardnekkige buikpijn. Dit artikel richt zich op het verfijnen van de techniek om een muismodel van CP te genereren via galweginfusie met 2,4,6 -trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS).

Samenvatting

Chronische pancreatitis (CP) is een complexe ziekte waarbij alvleesklierontsteking en fibrose, glandulaire atrofie, buikpijn en andere symptomen betrokken zijn. Verschillende knaagdiermodellen zijn ontwikkeld om CP te bestuderen, waarvan het galkanaal 2,4,6 -trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) infusiemodel de kenmerken van neuropathische pijn repliceert die bij CP worden gezien. Galweg medicijninfusie bij muizen is echter technisch uitdagend. Dit protocol demonstreert de procedure van galweg TNBS-infusie voor het genereren van een CP-muismodel. TNBS werd toegediend in de alvleesklier via het ampulla van Vater in de twaalfvingerige darm. Dit protocol optimaliseerde het medicijnvolume, chirurgische technieken en medicijnbehandeling tijdens de procedure. Met TNBS behandelde muizen vertoonden kenmerken van CP zoals weerspiegeld door gewichtsverminderingen van het lichaamsgewicht en de alvleesklier, veranderingen in pijngerelateerd gedrag en abnormale pancreasmorfologie. Met deze verbeteringen was de mortaliteit geassocieerd met TNBS-injectie minimaal. Deze procedure is niet alleen van cruciaal belang bij het genereren van pancreasziektemodellen, maar is ook nuttig bij de lokale toediening van pancreasgeneesmiddelen.

Inleiding

Chronische pancreatitis (CP) is een chronische ontstekingsziekte die wordt gekenmerkt door de atrofie van de alvleesklier, fibrose, buikpijn en uiteindelijk verlies van zowel exocriene als endocriene functies1. De huidige medische en chirurgische behandelingen zijn niet curatief, maar worden uitgevoerd om symptomen te verlichten die het gevolg zijn van de ziekte: refractaire buikpijn, endocriene en exocriene disfunctie. Daarom zijn effectievere behandelingen dringend nodig2. Diermodellen bieden een essentieel hulpmiddel voor het ontwikkelen van een beter begrip van de ziekte en het onderzoeken van potentiële therapieën3. Er zijn meerdere muismodellen voor CP ontwikkeld, waarvan ceruleïne- en/of alcoholmodellen veel worden gebruikt. Van ceruleïne, een oligopeptide dat de secretie van de alvleesklier stimuleert, is aangetoond dat het reproduceerbaar een CP-model induceert met pancreasatrofie, fibrose, onder andere4. Een ander veel voorkomend model maakt gebruik van seriële injecties van L-arginine, die exocriene insufficiëntie produceert die vergelijkbaar is met die waargenomen bij menselijke patiënten5. CP kan ook worden geïnduceerd door volledige of gedeeltelijke ligatie van de ductus pancreatischeul,- en pancreaskanaalhypertensie6,7. Ondanks de verscheidenheid aan diermodellen die beschikbaar zijn voor CP, reproduceert geen van deze modellen effectief de buikpijn die wordt ervaren door CP-patiënten8.

Eerdere studies toonden aan dat lokale pancreasinjectie van 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) de aanhoudende pijn repliceert die wordt ervaren door CP-patiënten9,10,11. Met TNBS behandelde muizen vertoonden abdominale overgevoeligheid en verhoogd pijngerelateerd gedrag, evenals een "gegeneraliseerde overgevoeligheid" voor pijnlijke stimuli, een fenomeen dat is waargenomen bij CP-patiënten10. Naast het nauwkeurig nabootsen van CP-pijn, repliceert het TNBS-model ook andere pathologische kenmerken van de menselijke conditie, zoals fibrose, mononucleaire celinfiltratie en vervanging van acinaire cellen door vetweefsel10,12. TNBS-infusie via galwegen is echter een technisch uitdagende procedure bij muizen die de dood kan veroorzaken. Voor onze weten is er geen visueel protocol om aan te tonen hoe galweginfusie wordt uitgevoerd. In dit artikel demonstreren we de procedure van de gal-duction infusie van TNBS om een CP-muismodel te genereren. Deze procedure zal helpen bij het genereren van waardevolle diermodellen voor de studie van CP en andere pancreasziekten en kan worden gebruikt om andere materialen (bijv. Virus, cellen) in de pancreas te injecteren13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committees aan de Medical University of South Carolina en het Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J mannelijke muizen tussen de 8-10 weken oud werden gebruikt in deze studie. Muizen werden gehuisvest onder een standaard 12 licht / 12 donkere cyclus met ad libitumtoegang tot voedsel en water.

1. Bereiding van TNBS oplossing voor injectie

  1. Bereid 10% ethanol in 0,9% zoutoplossing. Los voorraad TNBS (zie Tabel met materialen) op in 10% ethanol tot een eindconcentratie van 7,5 mM door 7,5 μL TNBS toe te voegen aan 1 ml 10% ethanol.
    LET OP: TNBS vormt een chemisch gevaar. Bereid de oplossing in een zuurkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, brillen en een laboratoriumjas om direct contact met TNBS te voorkomen.
  2. Laad 50 μL 0,75% TNBS-oplossing in een insulinespuit met een naald van 31 gauge. Laad 50 μL 10% ethanol in zoutoplossing in een spuit van dezelfde grootte als de voertuigbesturing. Plaats de spuiten op ijs en bescherm ze tegen licht totdat ze nodig zijn.

2. Muisvoorbereiding en chirurgie

  1. Scheer het haar van de abdominale operatieruimte.
  2. Injecteer één preventieve dosis van het pijnstillend (bijv. buprenorfine 0,1 mg/kg i.p.) vóór de operatie.
  3. Induceer en onderhoud de muis onder algemene anesthesie met 1,5-2% isofluraan en 1 l/min zuurstof. Bevestig de verdoving door in de tenen te knijpen en het dier te observeren op een gebrek aan reflex.
  4. Plaats de muis tijdens de operatie op een verwarmde chirurgische pad. Breng veterinaire zalf aan op elk oog wanneer de muis onder narcose is.
  5. Desinfecteer de operatieplaats door het operatiegebied 3x af te vegen met 2% jodium, gevolgd door 70% alcohol(Tabel met materialen).
  6. Voer een laparotomie uit met een microschaar om een incisie van 0,5-1 cm te genereren.
  7. Leg de twaalfvingerige darm voorzichtig bloot en lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal met behulp van wattenstaafjes(Tabel met materialen).
  8. Plaats een rechte micro hemoclip(Materiaaltabel)over het proximale gemeenschappelijke kanaal om de stroom van TNBS of voertuigoplossingen in de lever en de galblaas te voorkomen(Figuur 1A,B).
  9. Leg de twaalfvingerige darm voorzichtig bloot en steek de naald in het pancreaskanaal via de papilla van Vater.
  10. Zodra de naald zich in het kanaal bevindt, plaatst u een gebogen microhemoclip(Materialentabel)over de twaalfvingerige darm rond de naald(figuur 1A)om de naald op zijn plaats te houden en te voorkomen dat de geïnjecteerde oplossing in de twaalfvingerige darm terechtkomt.
  11. Injecteer de oplossing (TNBS of vehikel) geleidelijk in de ductus pancreatische buiging in de loop van een minuut.
    OPMERKING: TNBS moet langzaam worden toegediend gedurende een minuut tijd, en het is gemakkelijk om de infusiesnelheid te regelen wanneer de alvleesklier wordt doordrenkt met een insulinespuit met een 5/16 inch en 31G naald. Houd de hand zo stabiel mogelijk om te voorkomen dat je in de galwegen prikt. Als TNBS met succes wordt geïnjecteerd, kan de gele kleur zichtbaar zijn in de alvleesklier.
  12. Verwijder na infusie voorzichtig de microklem in de buurt van de lever en verwijder vervolgens de microklem die de naald en de twaalfvingerige darm vasthoudt.
  13. Breng de twaalfvingerige darm voorzichtig terug naar zijn oorspronkelijke positie.
  14. Laat 0,5 ml warme steriele zoutoplossing (36-37 °C) in de buikholte voor sluiting, om de twaalfvingerige darm te helpen terugkeren naar zijn oorspronkelijke positie en te helpen bij het herstel van de peristaltiek.
  15. Sluit de incisie in de spierlaag met behulp van een continue hechting met een 5-0 steek. Sluit de huid met een onderbroken hechting met een 4-0 hechting.
  16. Plaats de kooi met muizen op een verwarmingskussen om herstel van de anesthesie mogelijk te maken.
  17. Bevestig dat de muizen warm zijn en in staat tot spontane beweging voordat u ze terugbrengt naar de wachtkamer.
  18. Blijf elke 12 uur een pijnstillend zuur (bijv. buprenorfine 0,1 mg / kg i.p.) en aanvullende warmte gedurende 48 uur na de operatie.

3. Het gedrag van muizen controleren

  1. Verwijder hechtingen op dag 7 na de operatie.
  2. Controleer de gezondheid en het gedrag van muizen dagelijks tijdens de eerste week na de operatie. Let op tekenen van nood, zoals vocaliseren, gebogen rughouding of verminderde voortbeweging. Meet het lichaamsgewicht om de dag.
  3. Gebruik Von Frey monofilamenten (VFF's) om abdominale mechanische overgevoeligheid vóór en 2, 3 weken na de operatie te meten zoals beschreven9,14.
    1. Breng VFF's van verschillende toegepaste krachten in oplopende volgorde 10x elke 1-2 s aan op de bovenste buikstreek. Beschouw het opheffen, intrekken of likken van de buik (ontwenningsreactie) als een positieve reactie.
    2. Pas een sterkere stimulus toe als er geen positieve respons wordt waargenomen en een zwakkere stimulus als een positieve respons wordt waargenomen. De opnamedrempel is de kracht waarmee de muis 50% van de tijd reageert.

4. Verzameling en histologische analyse van pancreasweefsel

  1. Offer de muizen op onder anesthesie door cervicale dislocatie en ontleed de alvleesklier zorgvuldig uit de darm en andere organen.
  2. Fixeer de alvleesklier gedurende 24 uur in 10% paraformaldehyde, sluit ze in paraffine, snijd weefselsecties van 5 μm dikte en plaats ze op glazen dia's voor kleuring.
  3. Voer hematoxyline-eosine en Masson's trichrome kleuring uit met behulp van standaardmethoden zoals eerder gemeld4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De galweginfusieprocedures werden geoptimaliseerd om de sterfte bij muizen geassocieerd met deze procedure te verminderen10. TNBS werd eerst gegeven in een totaal volume van 35 μL of 50 μL. Injectie van TNBS in een volume van 50 μL kan de hele alvleesklier bereiken en een homogener ziektefenotype induceren(figuur 1B). Bovendien kan injectie van TNBS met behulp van insulinespuit met 31G-naald de infusiesnelheid beter regelen in vergelijking met gewone spuiten en naaldf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Galweginfusie van TNBS om chronische pancreatitis te induceren is technisch uitdagend bij muizen, omdat tot 22,5% van de muizen binnen 3-4 dagen na medicijninfusie kan sterven10. Hier verfijnde dit rapport de procedure op basis van eerdere studies en verminderde de vroege muizensterfte tot <10%. Het verhoogde medicijnvolume (van 35 μL tot 50μL) kan er bijvoorbeeld voor zorgen dat de medicijnen de hele alvleesklier bereiken. Het gebruik van een insulinespuit en een kleinere naaldgrootte (31G) vermi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) en het National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394 en DK118529 aan HW. We bedanken Dr. Hongju Wu voor het delen van technische ervaring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Neutral buffered formalin v/vFisher Scientific23426796
Alcohol prep pads, sterielFisher Scientific22-363-750
Animal Anesthesia systeemVetEquip, Inc.901806
Buprenorfine hydrochloride, injectiePar Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific0553859A
Ethanol, absoluut (200 proof), moleculaire biologie kwaliteitFisher ScientificBP2818500
Extra fijne micro dissectiescharen 4” rechte scherpeRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Graefe pincet 4” extra delicate tipRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
Verwarmd kussenAmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Naaldhouder 5.25”Roboz Surgical Instrument Co.RS-7850
Insuline spuit met 31-gauge naaldBD324909
Jodium prep padsFisher Scientific19-027048
IsofluraanPiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Micro clip aanbrengforceps 5.5”Roboz Surgical Instrument Co.RS-5410
Micro clip, recht, sterk gebogen 1x6mmRoboz Surgical Instrument Co.RS-5433
Micro clip, recht, 0.75mm clipbreedteRoboz Surgical Instrument Co.RS-5420
Picrylsulfonzuur oplossing, TNBS, 1M in H2OMillipore Sigma92822-1ML
Polypropyleen Naad 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
Polypropyleen Naad 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
Natriumchloride, 0.9% intraveneuze oplossingVWR2B1322Q
Chirurgisch doek, sterielMed-Vet InternationalDR1826
Weefsel cassetteFisher Scientific22-272416
Von Frey filamentenBiosebEB2-VFF

Referenties

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

GalganginfusiePancreasfibrosePancreasontstekingNeuropathische pijnPancreasatrofieChirurgische techniekMedicijntoediening aan de pancreas
Een muismodel voor chronische pancreatitis via galweg TNBS-infusie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.