Laseropname van microdissectie op chirurgische weefsels om afwijkende genexpressie te identificeren bij verminderde wondgenezing bij diabetes type 2

Samenvatting

Deze techniek biedt een leidraad voor het toebrengen van ex vivo wonden, het uitvoeren van laser-capture microdissectie en het kwantificeren van veranderingen in genexpressie gerelateerd aan slechte wondgenezingsprocessen bij diabetes met behulp van klinisch relevant menselijk weefsel.

Samenvatting

De wereldwijde prevalentie van diabetes mellitus type 2 (T2DM) escaleert in een snel tempo. Patiënten met T2DM hebben last van een groot aantal complicaties en een daarvan is een verminderde wondgenezing. Dit kan leiden tot de ontwikkeling van niet-genezende zweren of voetzweren en uiteindelijk tot amputatie. Bij gezonde personen volgt wondgenezing een gecontroleerde en overlappende opeenvolging van gebeurtenissen die ontsteking, proliferatie en hermodellering omvatten. In T2DM worden een of meer van deze stappen disfunctioneel. Huidige modellen om verminderde wondgenezing bij T2DM te bestuderen, omvatten in vitro kraswondtesten, huidequivalenten of diermodellen om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan wondgenezing en/of mogelijke therapeutische opties. Deze geven echter geen volledige samenvatting van het complexe wondgenezingsproces bij T2DM-patiënten, en ex vivo menselijke huidtesten zijn problematisch vanwege de ethiek van het nemen van ponsbiopten van patiënten waarvan bekend is dat ze slecht zullen genezen. Hier wordt een techniek beschreven waarbij expressieprofielen van de specifieke cellen die betrokken zijn bij de (dys)functionele wondgenezingsrespons bij T2DM-patiënten kunnen worden onderzocht met behulp van overtollig weefsel dat wordt weggegooid na amputatie of electieve cosmetische chirurgie. In dit protocol worden monsters van gedoneerde huid verzameld, gewond, ex vivo gekweekt in de lucht-vloeistofinterface, op verschillende tijdstippen gefixeerd en doorgesneden. Specifieke celtypen die betrokken zijn bij wondgenezing (bijv. epidermale keratinocyten, dermale fibroblasten (papillair en reticulair), het vaatstelsel) worden geïsoleerd met behulp van lasercapture-microdissectie en verschillen in genexpressie geanalyseerd door sequencing of microarray, waarbij genen van belang verder worden gevalideerd door qPCR. Dit protocol kan worden gebruikt om inherente verschillen in genexpressie tussen zowel slecht genezende als intacte huid te identificeren, bij patiënten met of zonder diabetes, met behulp van weefsel dat gewoonlijk na een operatie wordt weggegooid. Het zal een beter begrip opleveren van de moleculaire mechanismen die bijdragen aan chronische T2DM-wonden en verlies van de onderste ledematen.

Inleiding

De incidentie van diabetes type 2 neemt wereldwijd toe, gedreven door een obesitas-epidemie en lichamelijke inactiviteit. Slechte wondgenezing komt vaak voor bij deze patiënten en tot 25% van de patiënten zal een chronische niet-genezende wond ontwikkelen¹. De mechanismen die hieraan ten grondslag liggen, zijn complex en worden onvolledig begrepen, waardoor het ontdekkingspercentage voor nieuwe therapieën wordt beperkt. Een van de factoren die hieraan bijdragen, is het ontbreken van een geschikt model voor het bestuderen van wondgenezing bij diabetes type 2-patiënten. Het doel van deze methode is dus om een fysiologisch relevant ex vivo model te bieden voor het onderzoeken van wondgenezing bij mensen met een risico op chronische wonden, waardoor transcriptomische analyse mogelijk is om de identificatie van nieuwe therapeutische doelen te bevorderen.

Er zijn momenteel meerdere modellen beschikbaar om wondgenezing te bestuderen, en elk heeft zijn sterke en zwakke punten. In vivo diermodellen, zoals de db/db-muis² of streptozotocine-geïnduceerde diabetische ratten³ worden veel gebruikt; Wonden in knaagdiermodellen genezen echter via contractie, wat heel anders is dan het mechanisme dat in het menselijk lichaam wordt gebruikt, en hebben beperkt succes bij de vertaling naar klinische onderzoeken ^4,5. De voordelen van het gebruik van menselijk weefsel worden algemeen erkend⁴, maar worden bemoeilijkt door de ethiek van het toebrengen van experimentele wonden aan personen van wie al bekend is dat ze een verminderde wondgenezingsreactie hebben. Bijgevolg zijn studies bij menselijke proefpersonen met diabetes vaker gericht op de ontstekingsreactie in plaats van op experimenten met uitgesneden weefsel⁶. Organ-on-a-chip⁷ en kunsthuidmodellen⁸ zijn ook beschikbaar. Deze hebben het voordeel dat ze de bijdragen van menselijke cellen kunnen analyseren, maar geven weinig indicatie van variabiliteit tussen patiënten. Klinisch relevante modellen om de voortgang van wondgenezing bij kwetsbare patiëntenpopulaties te bestuderen, zouden dus het mechanistische begrip en de ontdekking van geneesmiddelen op dit gebied kunnen versnellen.

Het hieronder beschreven ex vivo verwondingsprotocol is een bewerking van Stojadinovic en Tomic-Canic, 2013⁹. Het is geschikt voor het onderzoeken van transcriptionele gegevens van gecontroleerde verwonding van menselijke weefselmonsters ex vivo en kan worden toegepast op klinische monsters van patiënten met slechte wondgenezing (bijv. diabetes type 2, ouderen), om de kennis te vergroten over hoe wondgenezing in deze aandoeningen wordt beïnvloed en mogelijk hoe deze kan worden hersteld.

Protocol

Dit protocol is gebaseerd op de verstrekking van menselijk chirurgisch weefsel. Voorafgaand aan het experiment werden ethische goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de patiënt verkregen, en de studie voldeed aan de principes die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki.

1. Afname van weefsel en ex vivo verwonding

1. Verzamel chirurgisch weefsel na amputatie/operatie van ledematen in een steriele container met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 5% penicilline-streptomycine-fungizon, 2 mM L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS; volledig groeimedium).
   OPMERKING: Weefsel dat op deze manier wordt verzameld, kan tot 24 uur voorafgaand aan het experimenteren bij 4 °C worden bewaard. Om de levensvatbaarheid van weefsel voor ex vivo experimenten te garanderen, wordt aanbevolen om het weefsel zo snel mogelijk te verwerken of om een vast tijdsverschil aan te houden tussen verzameling en verwonding om experimenten te standaardiseren voor meerdere weefseldonaties. Als het weefsel voor een bepaalde tijd moet worden bewaard, moet een RNA-stabilisatieoplossing aan het monster worden toegevoegd om de RNA-integriteit te behouden.
2. Breng het weefsel met een steriele tang over naar een petrischaaltje van 60 mm gevuld met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 5% penicilline-streptomycine-fungizon. Knip het vet van de dermis met een steriel scalpel en/of een chirurgische schaar en gooi het weg. Breng het weefsel over naar een vers petrischaaltje gevuld met steriel PBS.
3. Bevestig twee steriele mesjes aan elkaar zodat er een opening van 1 mm is tussen de twee mesjes. Snijd twee parallelle lineaire lijnen, ~1 mm uit elkaar, in over de lengte van de epidermis en het bovenste deel van de papillaire dermis^10,11.
4. Verwijder de opperhuid tussen de breuklijnen met behulp van een steriele tang en een chirurgische schaar om een lineaire wond te creëren.
5. Gebruik een scalpel om het weefsel in kleine rechthoeken te snijden (maximale grootte van 1 cm²) die de wond omvatten met aan weerszijden intacte opperhuid.
   OPMERKING: Om de integriteit van het weefsel en het daaropvolgende RNA te behouden, moeten de stappen 1.2-1.5 zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
6. Maak een foto van het gewonde weefsel met behulp van een microdissectiemicroscoop met een vergroting van 4x, zodat het gezichtsveld de hele wond en het omringende intacte epidermale weefsel vastlegt.
7. Plaats met een steriele tang de weefselrechthoeken op een weefselkweekinzetstuk in een plaat met 6 putjes en pipetteer voorzichtig 2 ml volledig groeimedium in het putje. Dit zorgt ervoor dat het monster wordt gekweekt op het grensvlak tussen vloeistof en lucht.
8. Incubeer bij 37 °C in 5% CO₂ in lucht gedurende maximaal 120 uur.
   OPMERKING: Het weefsel moet aan het einde van de incubatie worden afgebeeld met een microdissectiemicroscoop met dezelfde vergroting als in stap 1.6. Indien nodig kunnen er ook elke 24 uur foto's worden gemaakt.

2. Weefselfixatie en cryosectie

1. Vries het weefsel snel in vloeibare stikstof in. Plaats een kleine hoeveelheid cryostaat-compatibel snijmedium op een cryostaathouder en sluit het weefsel erin in. Richt het weefsel loodrecht op de klauwplaat zodat het snijvlak door alle huidlagen snijdt, inclusief het gewonde gebied. Bewaren bij -80 °C.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. Reinig de cryostaat bij kamertemperatuur met 70% ethanol en RNase-decontaminatiespray. Stel de cryostaattemperatuur in op -28 °C.
3. Controleer of de oriëntatie van de klauwplaat en het cryostaatblad secties kan produceren die de volledige dikte van het weefsel omvatten, inclusief het gewonde weefsel en de onderliggende dermis.
4. Snijd met behulp van de cryostaat maximaal tien secties van 7 μm uit elke wond en plaats deze op RNA-vrije microdissectieglaasjes.
5. Bewaar de objectglaasjes in de originele doos waarin de microdissectieglaasjes zijn meegeleverd bij -80 °C om een RNase-vrije omgeving te garanderen.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, maar houd er rekening mee dat de RNA-degradatie zal toenemen naarmate de opslagtijd langer is.

3. Microdissectie van laseropname

1. Plaats de microdissectieglaasjes met het weefselgedeelte in droogijs en ga naar de microdissectiemicroscoopkamer voor laseropname.
2. Droog het 1e^glaasje aan de lucht en ga snel verder met het bekleuren van de secties met hematoxyline met behulp van een RNase-vrije hematoxyline- en eosinekleuringskit onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van laseropnamemicrodissectie.
3. Visualiseer het gewonde weefsel met behulp van een lasermicrodissectiemicroscoop met een vergroting van 10x en maak een foto van het interessegebied dat met de laser wordt vastgelegd.
4. Trek rond dat gebied (bijvample, epitheeltong, granulatieweefsel, microvaten) en verzamel in microdissectie 0.5 ml diffuserisolatiedoppen met behulp van de software-instructies voor de specifieke microscoop die wordt gebruikt.
5. Visualiseer en beeld het door de laser vastgelegde interessegebied opnieuw met behulp van de laser-capture microdissectiemicroscoop met een vergroting van 10x om de locatie en volledige excisie van het ontlede weefsel aan te tonen.
   NOTITIE: Voer laseropname uit voor elk monster (maximaal 10 secties) gedurende een maximale tijd van 1 uur om RNA-degradatie te minimaliseren.
6. Voeg RNA-opslagbuffer toe aan de buis met het microontlede weefsel volgens de instructies van de fabrikant en bewaar het in droogijs totdat het kan worden overgebracht naar een vriezer van -80^°C.
   OPMERKING: Het protocol kan hier tijdelijk worden gepauzeerd.

4. Kwantificering van differentiële genexpressie

1. Centrifugeer de monsterbuisjes gedurende 1 minuut op volle snelheid.
2. Isoleer RNA uit het microontlede weefsel volgens de instructies van de fabrikant.
3. Uleer het RNA in een eindvolume van 12 μL RNasevrij water en amplificeer het RNA met behulp van een RNA-amplificatiekit en thermische cycler, volgens de instructies van de fabrikant. Twee amplificatierondes worden aanbevolen om ervoor te zorgen dat er voldoende RNA is voor verdere analyse. Gebruik de versterkingsvoorwaarden in Tabel 1.

Eerste versterkingsronde			Tweede amplicatieronde
Synthese van de eerste streng			Synthese van de eerste streng
Stap	Temperatuur	Tijd	Stap	Temperatuur	Tijd
1	65 °C	5 minuten	1	65 °C	5 minuten
2	4 °C	houden	2	4 °C	houden
3	42 °C	45 minuten	3	25 °C	10 minuten
4	4 °C	houden	4	37 °C	45 minuten
5	37 °C	20 minuten	5	4 °C	houden
6	95 °C	5 minuten
7	4 °C	houden	Synthese van de tweede streng
			Stap	Temperatuur	Tijd
Synthese van de tweede streng			1	95 °C	2 minuten
Stap	Temperatuur	Tijd	2	4 °C	houden
1	95 °C	2 minuten	3	37 °C	15
2	4 °C	houden	4	70 °C	5 minuten
3	25 °C	5 minuten	5	4 °C	houden
4	37 °C	10 minuten
5	70 °C	5 minuten	In vitro transcriptie
6	4 °C	houden	Stap	Temperatuur	Tijd
			1	42 °C	6 uur
In vitro transcriptie			2	4 °C	houden
Stap	Temperatuur	Tijd	3	37 °C	15 minuten
1	42 °C	3 uur	4	4 °C	houden
2	4 °C	houden
3	37 °C	15 minuten
4	4 °C	houden

Tabel 1: Versterking voorwaarden.

4. Kwantificeer de concentratie en zuiverheid van het versterkte RNA. Absorptieverhoudingen van A260/230 (zuiverheid) en A260/280 (verontreinigingen) > 1,8 zijn geschikt voor verdere analyse.
   OPMERKING: Gezuiverd geamplificeerd RNA kan worden gebruikt voor gerichte genexpressiestudies (stappen 4.5-4.6) of kan worden weggestuurd voor microarray-analyse.
5. Synthetiseer cDNA met behulp van een cDNA-reverse transcriptiekit met hoge capaciteit volgens de instructies van de fabrikant. Representatieve voorwaarden zijn als volgt:
   • 25 °C gedurende 10 min
   • 37 °C gedurende 2 uur
   • 85 °C gedurende 5 min
   • 4 °C vasthouden
6. Voer kwantitatieve PCR uit met 0,5 μL cDNA en 1 μM primers (van het gen van belang) volgens de instructies van de fabrikant. Representatieve omstandigheden en primersequenties zijn als volgt.
   1. Gebruik de volgende voorwaarden voor kwantitatieve PCR-omstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten; 40 cycli van 95°C gedurende 15 s en 62°C gedurende 1 minuut; 95 °C gedurende 5 min; en 4°C houden.
   2. Gebruik de volgende primersequenties:
      GAPDH
      Vooruit 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Achteruit 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Vooruit 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Achteruit 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interpretatie van de gegevens

1. Bereken de snelheid van wondgenezing met behulp van de afbeeldingen van het ex vivo weefsel dat is gegenereerd in stap 1.6-1.8 met behulp van ImageJ. Er zijn meerdere recente publicaties die verschillende variaties belichten op het automatisch analyseren van wondgebieden in AfbeeldingJ 12,13,14.
2. Kwantificeer genexpressie door gebruik te maken van de ΔC_T-methode , waarbij de drempelcycli voor het gen van belang worden vergeleken met dat van de huishoudster (bijv. glyceraldehyde-3-fosfaat; GAPDH). Noteer hiervoor de_CT-waarde voor de huishoudster en voor het gen van belang.
   1. Bereken het verschil tussen de_{twee CT-waarden} om de hoeveelheid aanwezig mRNA te normaliseren en controleer op verschillen in RNA-extractieconcentraties tussen verschillende isolaties:
      ΔC_T = C_T (gen van belang) - C_T (huishoudster)
   2. Bereken de grootte van het verschil tussen_{de CT-waarden} om de relatieve kwantificering van het gen van belang te geven, uitgedrukt als een percentage van de huishoudster:
      Relatieve kwantificering = (^2-ΔCT) x 100
   3. Onderzoek verschillen tussen verschillende patiëntdonoren/ziektetoestanden door de relatieve kwantificeringen van de genen die van belang zijn voor elk monster te vergelijken.
      OPMERKING: Een schema van de gehele techniek is te vinden in Figuur 1.

Resultaten

Volgens het protocol werd een 48-uurs tijdstip gekozen om representatieve resultaten te genereren. Het ontstaan van de initiële wond in overtollig weefsel van electieve cosmetische chirurgie is te zien in figuur 2A , waar de weggesneden wond duidelijk zichtbaar is. Hematoxyline- en eosinekleuring bevestigt dat hierdoor een wond van volledige dikte is ontstaan (Figuur 2B). Na 48 uur is een gedeeltelijke sluiting van de wond zicht...

Discussie

Naarmate de incidentie van chronische aandoeningen zoals diabetes type 2 wereldwijd toeneemt, wordt de behoefte aan technieken die pathofysiologisch relevante studies kunnen vergemakkelijken urgenter. Het hierboven beschreven protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het onderzoeken van transcriptomische gegevens van ex vivo genezende wonden met behulp van menselijk weefsel.

Dit protocol is afhankelijk van de verstrekking van overtollig klini...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Arcturus RiboAmp PLUS kit	ThermoFisher Scientific	KIT0521	RNA-amplificatiekit
Diffuser Caps 0.5mL	MMI	K10028161	Laser capture microdissectie doppen; verpakking van 50
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	Met 1000 mg/L glucose, L-glutamine en natriumbicarbonaat, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celcultuur
Foetaal runderserum	Thermo Fisher Scientific	10270106	Celcultuur supplement
H&E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Rnase-vrije hematoxyline en eosine kleuringskit
High capacity cDNA reverse transcriptiekit	Applied Biosystems	4368814	Reverse transcriptiekit
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030149	Celcultuur supplement
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laser capture microdissectie slides; 5 per doos
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Celcultuur inzet
Penicilline-Streptomycine-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Celcultuur supplement
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Cryostat-compatibel snijmembraan
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Vijf tablets per 100ml steriele water en vervolgens geautoclaveerd voor celcultuur gebruik
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA-extractiekit
RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNase spray
Steriele messen	Scientific Laboratory Supplies	INS4974	Weefsel dissectie implementaat
Support Slide	MMI	K10028159	Laser capture microdissectie ondersteunende slide, RNase-vrij
Chirurgische schaar	Scientific Laboratory Supplies	INS4860	Weefsel dissectie implementaat
Chirurgische pincetten	Scientific Laboratory Supplies	INS2026	Weefsel dissectie implementaat
SYBR Green Supermix	Applied Biosystems	4344463	Kwantitatieve PCR mastermix