Methodenartikel

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

DOI:

10.3791/62093

⸱

11 februari 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmslijmvlies wordt bekleed door een enkele laag epitheelcellen die een dynamische barrière vormt die paracellulair transport van voedingsstoffen en water mogelijk maakt en tegelijkertijd de doorgang van luminale bacteriën en exogene stoffen voorkomt. Een breuk van deze laag resulteert in een verhoogde permeabiliteit van de luminale inhoud en rekrutering van immuuncellen, die beide kenmerken zijn van pathologische toestanden in de darm, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD).

Mechanismen die de epitheliale barrièrefunctie en transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) reguleren, worden onvolledig begrepen vanwege het gebrek aan experimentele in vivo methoden die kwantitatieve analyses mogelijk maken. Hier beschrijven we een robuust murien experimenteel model dat een exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt. De exteriorized intestinale lus (iLoop) is volledig gevasculariseerd en biedt fysiologische voordelen ten opzichte van ex vivo kamergebaseerde benaderingen die vaak worden gebruikt om permeabiliteit en PMN-migratie over epitheliale celmonolagen te bestuderen.

We demonstreren twee toepassingen van dit model in detail: (1) kwantitatieve meting van intestinale permeabiliteit door detectie van fluorescentie-gelabelde dextrans in serum na intraluminale injectie, (2) kwantitatieve beoordeling van gemigreerd PMN over het darmepitheel in het darmlumen na intraluminale introductie van chemoattractanten. We tonen de haalbaarheid van dit model aan en leveren resultaten met behulp van de iLoop bij muizen die het epitheliale strakke junction-geassocieerde eiwit JAM-A missen in vergelijking met controles. Van JAM-A is aangetoond dat het de epitheliale barrièrefunctie en PMN TEpM reguleert tijdens ontstekingsreacties. Onze resultaten met behulp van de iLoop bevestigen eerdere studies en benadrukken het belang van JAM-A bij de regulering van intestinale permeabiliteit en PMN TEpM in vivo tijdens homeostase en ziekte.

Het iLoop-model biedt een sterk gestandaardiseerde methode voor reproduceerbare in vivo studies van intestinale homeostase en ontsteking en zal het begrip van de darmbarrièrefunctie en mucosale ontsteking bij ziekten zoals IBD aanzienlijk verbeteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmslijmvlies omvat een enkele laag zuilvormige intestinale epitheelcellen (IECs), onderliggende lamina propria immuuncellen en het muscularis-slijmvlies. Naast zijn rol in de opname van voedingsstoffen, is het darmepitheel een fysieke barrière die het lichaamsinterieur beschermt tegen luminale commensale bacteriën, pathogenen en voedingsantigenen. Bovendien coördineren IECs en lamina propria immuuncellen de immuunrespons die tolerantie of respons induceert, afhankelijk van de context en stimuli. Er is gemeld dat de verstoring van de epitheliale barrière kan voorafgaan aan het begin van pathologische mucosale ontsteking en kan bijdragen aan inflammatoire darmziekte (IBD) die zowel colitis ulcerosa als de ziekte van Crohnomvat 1,2,3,4,5,6,7. Personen met colitis ulcerosa vertonen overmatige transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) die crypte abcessen vormen, een bevinding die is geassocieerd met de ernst van ziekte8,9. Hoewel gecompromitteerde epitheliale barrièrefunctie en overmatige immuunresponsen kenmerken van IBD zijn, is er een gebrek aan experimentele in vivo assays om kwantitatieve beoordelingen van intestinale permeabiliteit en immuuncelwerving in het darmslijmvlies uit te voeren.

De meest gebruikte methoden voor het bestuderen van intestinale epitheliale permeabiliteit en PMN TEpM maken gebruik van ex vivo kamergebaseerde benaderingen met behulp van IEC-monolagen gekweekt op semi-permeabele poreuze membraaninzetstukken10,11,12. De integriteit van de epitheelbarrière wordt gecontroleerd door metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) of de paracellulaire flux van het Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabelde dextran van apicaal naar basaalcompartiment 13,14,15. Evenzo wordt PMN TEpM meestal bestudeerd als reactie op een chemoattractant dat wordt toegevoegd in de onderste kamer16. PMN wordt in de bovenste kamer geplaatst en na een incubatieperiode wordt PMN dat naar het basale compartiment is gemigreerd verzameld en gekwantificeerd. Hoewel deze methoden nuttig, gemakkelijk uit te voeren en zeer reproduceerbaar zijn, zijn het duidelijk reductionistische benaderingen en vertegenwoordigen ze niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige weerspiegeling van in vivo omstandigheden.

Bij muizen is een veel voorkomende test om de intestinale paracellulaire permeabiliteit te bestuderen door orale gavage van FITC-dextran en daaropvolgende meting van fitc-dextran uiterlijk in het bloedserum13,17. Het nadeel van deze test is dat het een beoordeling is van de algehele barrière-integriteit van het maagdarmkanaal in plaats van die van regionale darmbijdragen. Bovendien wordt Evans blue vaak gebruikt om vasculaire lekkage in vivo18 te evalueren en is het ook gebruikt om de darmslijmvliesdoorlaatbaarheid bij muis en rat19,20,21te evalueren . De kwantificering van Evans blauw in het darmslijmvlies vereist extractie uit weefsel met behulp van incubatie in formamide 's nachts. Daarom kan hetzelfde weefsel niet worden gebruikt om intestinale epitheelpermeabiliteit en neutrofiele infiltratie te bestuderen.

Hier benadrukken we een eenvoudig protocol dat het aantal dieren vermindert dat nodig is om reproduceerbare gegevens te verzamelen over darmslijmvliespermeabiliteit en leukocyten transepitheliale migratie in vivo. Daarom raden we het gebruik van FITC-dextrans aan die gemakkelijk detecteerbaar zijn in bloedserum zonder de integriteit van darmlussen in gevaar te brengen die kunnen worden geoogst voor verdere analyse. Van belang is dat de intestinale ligated loops zijn gebruikt bij verschillende soorten (waaronder muis, rat, konijn, kalf) om bacteriële infecties (zoals Salmonella, Listeria monocytogenes en Escherichia coli)22,23,24,25 en intestinale permeabiliteit26te bestuderen; voor zover wij weten zijn er echter geen studies die mechanismen van PMN TEpM onderzoeken in specifieke regio's in de darm zoals ileum of dikke darm die vaak betrokken zijn bij IBD.

Hier beschrijven we het muis intestinale lus (iLoop) model dat een robuuste en betrouwbare microchirurgische in vivo methode is die een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment van het ileum of proximale dikke darm gebruikt. Het iLoop-model is fysiologisch relevant en maakt de beoordeling van de integriteit van de darmbarrière en PMN TEpM op levende muizen onder narcose mogelijk. We demonstreren twee toepassingen: 1) kwantificering van serumspiegels van 4 kDa FITC-dextran na intraluminale toediening in de iLoop 2) kwantificering van getransmigreerd PMN in het iLoop lumen na intraluminale injectie van het krachtige chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Bovendien, het gebruik van het iLoop-model met Jam-a-null muizen of muizen die selectief verlies van JAM-A op IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) in vergelijking met controlemuizen, kunnen we eerdere studies bevestigen die een belangrijke bijdrage hebben gemeld voor nauw junction-geassocieerd eiwit JAM-A aan intestinale permeabiliteit en neutrofiele transmigratie15,28,29,30,31.

Het iLoop-model is een zeer functionele en fysiologische methode die kan worden gebruikt om in vitro assays te bevestigen. Bovendien is dit een veelzijdig experimenteel model dat de studie mogelijk maakt van verschillende reagentia die in het luslumen kunnen worden geïnjecteerd, waaronder chemokinen, cytokinen, bacteriële pathogenen, toxines, antilichamen en therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en het beleid van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Institutional Animal Care &Use Committee van de Universiteit van Michigan.

1. Preoperatieve voorbereiding

OPMERKING: Deze methode werd gegenereerd met behulp van volwassen muizen met een C57BL/6 genetische achtergrond, in de leeftijd van 8 - 12 weken. Alle muizen werden gehouden onder strikte specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden met ad libitum toegang tot normale chow en water. De resultaten werden verkregen met behulp van C57BL/6, Jam-a - null muizen (Jam-a-/-) of muizen die selectief verlies van JAM-A op IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) en littermate Jam-afl/fl controles zoals eerder beschreven30.

  1. Gebiedsvoorbereiding
    1. Voer een operatie uit in een schone omgeving. Het intestinale Loop-model is echter een niet-overlevingsoperatie waarvoor geen aseptische / steriele techniek nodig is. Neem veterinaire sanitaire praktijken in acht en gebruik gereinigde chirurgische instrumenten (d.w.z. geschrobd met zeep, gespoeld met water gevolgd door 70% ethanol).
    2. Schakel een temperatuurgecontroleerde chirurgische plank (of verwarmingskussens) en een aangepaste lichtbron in om te voorkomen dat dieren onderkoeld worden tijdens de anesthesie en operatie.
    3. Bereid ligaturen voor door 6 cm segmenten van niet-absorbeerbare 4-0 zijden chirurgische hechtingen te snijden.
    4. Bereid katoenen gaasjes (5 cm x 5 cm) die in het midden worden gesneden volgens een ellipsvormige vorm. Deze worden gebruikt om de midline laparotomie te bedekken en direct contact tussen de buitenste iLoop en dierenbont te voorkomen. Week de gesneden gaasjes in warme Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in een petrischaaltje.
    5. Bereid natte wattenstaafjes gedrenkt in warme HBSS die zullen worden gebruikt om organen en buitenzijde iLoop te behandelen.
    6. Bereid een spuit van 10 ml voor, gevuld met warme HBSS, en bevestig deze aan een gele voedingsbuis. Deze spuit wordt gebruikt voor het hydrateren van blootgestelde weefsels tijdens de operatie en om de iLoop van fecale inhoud voorzichtig door te spoelen.
  2. Dierlijke voorbereiding
    1. Verdoof het dier in overeenstemming met het goedgekeurde dierenprotocol. In dit protocol wordt een mix van isofluraan en zuurstof toegediend via een anesthesie vaporizer. Stel volgens de instructies van de fabrikant het zuurstofdebiet in op 1 L/min. Zet de vaporizer op 5% en laad de inductiekamer voor. Na 5 min, verminder isofluraan vaporizer tot 2% - 2,5%.
    2. Plaats het dier gedurende 3 min - 5 min in de inductiekamer, breng het dier vervolgens over op een verwarmde operatieplaat en sluit een anesthesie nosecone plug aan. Houd het dier in de liggende positie van de vier ledematen met plakband.
      OPMERKING: Als alternatief voor anesthesie kan een mengsel van ketamine (80 mg/kg - 100 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg - 10 mg/kg) verdund in zoutoplossing (0,9% NaCl) worden toegediend door intraperitoneale injectie. Anesthesie moet gedurende de hele operatie worden gehandhaafd door intramusculaire toediening van ketamine/xylazine (bij 0,1 - 0,25 keer de initiële doses) om de verdovingsdiepte te garanderen. Indien beschikbaar, wordt een isofluraan anesthesie vaporizer ten zeerste aanbevolen om een betere reproduceerbaarheid, overlevingskansen te garanderen en dierenpijn te voorkomen.
    3. Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    4. Voer een lichamelijk onderzoek uit met hartslag (ongeveer 500 slagen/min) en ritme, slijmvlieskleur (roze), capillaire navultijd (< 2 s), ademhalingsfrequentie (niet lager dan 40 - 60 ademhalingen/min) en temperatuur (36,5 °C)32.
    5. Voordat u doorgaat met de volgende stappen, beoordeelt u de verdovingsdiepte door middel van pedaalontwenningsreflex. Gebruik een pijnlijke stimulus (pinch) van de huid tussen de tenen en/of teenkussens. De muis zal reageren door zijn been samen te trekken en te verwijderen. Deze pedaalreflex verdwijnt wanneer het dier diep wordt verdoofd.
      OPMERKING: Monitoring van vitale functies en pedaalreflex wordt aanbevolen tijdens de anesthesie ten minste om de 15 minuten. De richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) voor de evaluatie van de anesthesiediepte bevelen aan om het volgende te controleren: (a) kleur van staart, voet en slijmvlies (zoals tong). Kleur roze als normaal en bleek of blauw als indicatie voor verminderde bloedperfusie of ademhalingsproblemen; b) evaluatie van het ademhalingspatroon als regelmatige versus onregelmatige ademhaling. Een rectale temperatuursonde, knaagdieroximeter en hartslagmeters kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van respectievelijk de lichaamstemperatuur, het hart en de ademhalingsfrequentie.

2. Generatie van de ileale lus

  1. Huidpreparaat: Scrub de vacht van de buikmidden met alcoholdoekjes of gaasspons gedrenkt in 70% ethanol. Maak een breed stuk bont niet nat met alcohol om onderkoeling te voorkomen.
  2. Voer met een schaar een laparotomie in de middellijn uit. Maak een verticale incisie in het midden van de buik (ongeveer 2 cm lang) en stel het buikvlies bloot. Wees voorzichtig om geen intra-abdominale organen te verwonden.
  3. Plaats voorgesneden nat katoenen gaas over de blootgestelde intra-abdominale holte.
  4. Gebruik natte wattenstaafjes om het caecum te mobiliseren en te buiten. Leg het caecum voorzichtig op het natte katoenen gaas.
    OPMERKING: Caecum is gelokaliseerd in het linker caudale kwadrant van de buikholte in een meerderheid van muizen onafhankelijk van het geslacht van het dier.
  5. Gebruik natte wattenstaafjes om het ileum waarvan het terminale gedeelte (distaal uiteinde) aan het caecum is bevestigd, te mobiliseren en voorzichtig buiten te brengen (figuur 1B).
  6. Gebruik ten minste 6 cm terminaal ileum op het natte katoenen gaas zonder verstoring van de mesenterische vaten en bloedtoevoer. De bloedtoevoer wordt gehandhaafd als er geen bloeding is en het weefsel zijn roze kleur behoudt (Figuur 1B).
    OPMERKING: Vermijd het drogen van blootgestelde weefsels door weefsels te allen tijde vochtig te houden met warme HBSS (elke 2 - 3 min) met behulp van een spuit van 10 ml die aan een gele voedingsbuis is bevestigd (stap 1.1.6).
  7. Dicht bij het caecum, identificeer de grote slagader die het ileum levert in de mesenterie. Zoek dan twee ligatieplaatsen in de mesenterie die vrij zijn van kritieke bloedvaten.
  8. Met behulp van stompe weefseldarm, stevig grijpen de terminale ileum (het dichtst bij het caecum) en met behulp van fijne tip forceps, fenestrate de mesenterie vermijden van bloedvaten. Plaats zijden hechtdraad over de perforatie en bind een chirurgische knoop om de eerste ligatie (distaal uiteinde van de lus) te creëren.
  9. Gebruik de liniaal om 4 cm afstand van de eerste ligatuur te meten en de tweede ligatuur (proximale uiteinde van de lus) te maken zoals vermeld in stap 2.8 (Figuur 1C).
  10. Met een fijne schaar zorgvuldig gesneden naast elke ligatie om de 4 cm ileale lus te isoleren, waardoor de bloedtoevoer en het mesenterische membraan intact blijven.
    OPMERKING: Snijd beide uiteinden van het buitenste segment van de iLoop af en spoel vervolgens voorzichtig door als een noodzakelijke stap die interferentie met de luminale inhoud (fecale materie) voorkomt, waardoor zelfs dispersie van FITC-dextrans of chemotactische stimuli over de gehele lengte van het geïsoleerde segment wordt vergemakkelijkt en een nauwkeurigere kwantificering van leukocyten door flowcytometrie mogelijk wordt. Deze procedure maakt ook een uniforme uitzetting van het slijmvlies mogelijk na injectie van gespecificeerde hoeveelheden reagens en een betere reproduceerbaarheid tussen dieren.
  11. Spoel de inhoud van het ileale lussegment voorzichtig door met warme HBSS met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die aan een spuit van 10 ml is bevestigd (zie stap 1.1.6).
  12. Ligateer de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde ileale lus met behulp van zijden hechtdraad.
  13. Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 30 G om langzaam 250 μL reagens zoals FITC-dextrans (stap 4.2) of chemokine (stap 5.3) in het darmlumen te injecteren. De ileale lus zal opblazen waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat (Figuur 1D).
    OPMERKING: Injecteer reagens in het luslumen aan de andere kant van de mesenterische slagader. Zorg ervoor dat u de ileale lus niet uit het dier trekt tijdens het injecteren om scheuren van bloedvaten te voorkomen en bloedingen te veroorzaken.
  14. Leg met natte wattenstaafjes voorzichtig de ileale lus, proximale ileum en caecum terug.
  15. Gebruik een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met omgekeerde snijnaald om de buikwand te sluiten.
  16. Plaats het dier in een temperatuurgereguleerde anesthesiekamer voor de incubatieperiode.

3. Generatie van de proximale dubbele puntlus (pcLoop)

OPMERKING: Zie de informatie aan het begin van de protocolsectie voor meer informatie over muizen die zijn gebruikt voor het genereren van de pcLoop.

  1. Voer stap 2.1 uit. - 2.4. zoals hierboven beschreven voor de ileale lus.
  2. Gebruik natte wattenstaafjes, maak het hele ileum buiten en leg het op de bovenkant van een nat katoenen gaas. Identificeer de proximale dikke darm en de bloedtoevoer in de mesocolon. Mobiliseer de proximale dikke darm en creëer met behulp van fijne tip forceps de eerste ligatuur in een gebied vrij van vaten in de mesocolon op ongeveer 0,5 cm distaal van het caecum (Figuur 2B).
  3. Meet 2 cm vanaf de eerste ligatuur en maak een tweede ligatuur op een gebied dat vrij is van bloedtoevoer in het mesocolon (figuur 2C).
  4. Snijd met een fijne schaar voorzichtig naast elke ligatie om een 2 cm lange pcLoop te isoleren.
    OPMERKING: Zoals vermeld in de opmerking onder stap 2.10, is het belangrijk om beide uiteinden af te snijden om een pcLoop te isoleren die voorzichtig wordt gereinigd van luminale inhoud. Snijd voorzichtig door het darmweefsel en mesocolon om te voorkomen dat kleine vaten in het darmlumen bloeden. Gebruik indien nodig thermische cauterie om bloedingen op de incisieplaats te beperken.
  5. Spoel de pcLoop voorzichtig door met warme HBSS om uitwerpselen te verwijderen met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die is bevestigd aan een spuit van 10 ml (zie stap 1.1.6).
  6. Ligateer de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde pcLoop met behulp van zijden hechtdraad.
  7. Gebruik een spuit van 1 ml met een naald van 30 G om langzaam 200 μL reagens zoals FITC-dextrans (stap 4.2) of chemokine (stap 5.3) in het darmlumen te injecteren. De pcLoop zal opblazen waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat (Figuur 2D).
    OPMERKING: Injecteer het reagens in het pcLoop lumen aan de andere kant van de mesenterische slagader. Zorg voor consistentie tussen dieren en creëer een 2 cm lange pcLoop om een gelijke uitzetting van het slijmvlies te garanderen.
  8. Gebruik natte wattenstaafjes om de ligated pcLoop, ileum en caecum voorzichtig terug te plaatsen in de buikholte.
  9. Gebruik een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met omgekeerde snijnaald om de buikwand te sluiten.
  10. Plaats het dier in een temperatuurgereguleerde anesthesiekamer voor de incubatieperiode.

4. Kwantitatieve beoordeling van de darmpermeabiliteit: 4 kDa FITC-dextran-test

  1. Voer een ileale lus of pcLoop uit (zoals hierboven beschreven).
  2. Injecteer met een spuit van 1 ml met een naald van 30 G in het darmlumen 250 μL (ileum - stap 2.13) of 200 μL (dikke darm - stap 3.7) van 4 kDa FITC-dextran-oplossing (1 mg / ml in HBSS). Houd de ongebruikte FITC-dextran-oplossing beschermd tegen licht om de standaardcurve na serumverzameling voor te bereiden.
  3. Volg voor de ileale lus de stappen 2.14 tot 2.16, voor de pcLoop stappen 3.8 tot 3.10. Plaats kort organen en iLoop terug op zijn plaats in de buikholte, sluit de buikwand.
  4. Plaats het dier gedurende 120 minuten in een verwarmde anesthesiekamer.
  5. Open na de incubatieperiode de buikwand, krijg toegang tot het hart en voer een hartpunctie uit met een spuit van 1 ml met een 25G-naald om het bloed te verzamelen. Breng bloed over in een serumstolselactivatorbuis van 1,3 ml, meng voorzichtig en houd het ijs beschermd tegen licht. Verzamel ten minste 500 μL bloed per muis.
    OPMERKING: Dieren worden geëuthanaseerd wanneer ze onder narcose zijn met behulp van een fysieke methode zoals onthoofding of cervicale dislocatie, en in overeenstemming met het goedgekeurde dierprotocol.
  6. Centrifugeer serumstolselactivatorbuis gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij kamertemperatuur volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verzamel het serum (supernatans) en breng het over in een centrifugebuis van 1,7 ml. Houd de buis op ijs en beschermd tegen licht.
  7. Kwantificering van fluorescentie in bloedserum
    1. Bereid een standaardcurve van FITC-dextran 4 kDa voor in serum van controlemuizen (zoutoplossing of HBSS is een geldig alternatief). Maak een tweevoudige seriële verdunning met een startconcentratie van 1 mg/ml FITC-dextran. FITC-dextran 4 kDa concentraties die worden gemeten variëren tussen 0,25 mg/ml en 2 μg/ml.
    2. Breng het gelijke volume van het monster en de normen over op een zwarte plaat met 96 putten (vlakke bodem) en meet fitc in een fluorescentieplaatlezer (excitatie 490 nm, emissie 520 nm), volgens de instructies van de fabrikant en gepubliceerde protocollen33. Bereken de FITC-concentratie op basis van de standaardcurve of de huidige permeabiliteitswaarden als vouwverandering genormaliseerd naar de experimentele controlegroep.

5. Kwantitatieve beoordeling van gemigreerd PMN in het darmlumen na intraluminale stimulatie met chemokinen

OPMERKING: Er bevinden zich zeer weinig PMN in het darmslijmvlies op basisniveau. Voorbehandeling van dieren met pro-inflammatoire cytokines resulteert in een ontstekingsomgeving die PMN-rekrutering uit de bloedbaan naar het darmslijmvlies vergemakkelijkt.

  1. Voer met een spuit van 1 ml met een naald van 30 G intraperitoneale (i.p.) injectie uit met een steriele oplossing van 100 ng tumornecrosefactor-α (TNFα) en 100 ng interferon-γ (INFγ) in 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Voer na 4 - 24 uur voorbehandeling met pro-inflammatoire cytokinen een ileale lus of pcLoop uit (zoals hierboven beschreven).
  3. Injecteer met een spuit van 1 ml met een naald van 30 G in het darmlumen 250 μL (ileum - stap 2.13) of 200 μL (dikke darm - stap 3.7) chemoattractantoplossing Leukotrieen B4 (LTB4) 1 nM bij HBSS.
    OPMERKING: Leukotrien B4 (LTB4) wordt in dit protocol gebruikt als een krachtig chemoattractant voor PMN. Andere chemoattractanten zoals N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLF) of chemokine (C-X-C motief) ligand 1 (CXCL1/KC) kunnen ook worden gebruikt om significante rekrutering van PMN in het colonlumen te induceren30.
  4. Volg voor de ileale lus de stappen 2.14 tot en met 2.16. Volg voor de pcLoop de stappen 3.8 tot en met 3.10. Plaats kort organen en iLoop terug op zijn plaats in de buikholte, sluit de buikwand.
  5. Plaats het dier gedurende 60 minuten in een verwarmde anesthesiekamer.
  6. Verzameling van het darmlusgehalte
    1. Bereid oplossingen voor en bewaar op ijs: Voor de ileale lus en pcLoop, bereid een wasbuffer voor die 2 mM Ethyleenaminetetraazijnzuur (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) en 2% FBS in steriel PBS zonder calcium en magnesium bevat.
    2. Open na de incubatieperiode en onder narcose onderhoud de buikwand en trek de iLoop (ileale lus of pcLoop) eruit. Euthanaseer dieren wanneer ze onder narcose zijn met behulp van een fysieke methode zoals onthoofding of cervicale dislocatie, en in overeenstemming met het goedgekeurde dierenprotocol.
    3. Spoellus met koude PBS om eventuele resterende bloedverontreiniging te verwijderen en overtollig PBS te absorberen met tissuedoekjes. Verzamel de lusinhoud zorgvuldig in een centrifugebuis van 1,7 ml (ongeveer 250 μL voor ileale lus en 200 μL voor pcLoop). Spoel de lus door met een koude wasbuffer van 500 μL en plaats de buis onmiddellijk na het opvangen op ijs.
      OPMERKING: DTT helpt bij het oplossen van slijm. Als het luminale gehalte van iLoop erg stroperig is (afhankelijk van de genetische achtergrond van de muis), verdun het dan 1:2 of 1:3 met wasbuffer met DTT.
    4. Breng de luminale inhoudsoplossing door een nylon meshfilter van 35 μm met behulp van een buis met ronde bodem van 5 ml met celzeefdop. Deze stap helpt bij het verwijderen van weefselfragmenten en celaggregaten. Spoel de celzeef af met 1 ml wasbuffer.
    5. Centrifugeerbuis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi supernatant weg, spoel pellet af met 500 μL - 1 ml wasbuffer en centrifugeer vervolgens op 400 x g gedurende 5 min, 4 °C.
    6. Resuspend iLoop luminal cell pellet in 200 μL flow cytometrie buffer (FCB) met 2% FBS in steriel PBS zonder calcium en magnesium. Cellen kunnen in een buis worden bewaard of worden overgebracht naar een 96-put ronde bodemplaat voor stromingcytometriekleuring en analyse.
  7. Flow Cytometrie kleuring en analyse
    1. Compensatiecontroles: witte bloedcellen
      1. Bereid een spuit van 1 ml voor met een naald van 25 G, voorgevuld met steriele 0,5 M EDTA (pH 8,0). 10% EDTA per verwacht bloedvolume (100 μL EDTA voor 1 ml bloed).
      2. Verzamel bloed onder narcose door een hartpunctie. Breng bloed over in een buis van 1,7 ml en centrifugeer vervolgens bij 400 x g gedurende 10 min, 4 °C.
        OPMERKING: Terwijl de muis onder narcose is, gebruikt u een fysieke methode om de dood te bevestigen in overeenstemming met het goedgekeurde dierprotocol (zoals cervicale dislocatie).
      3. Aspireer de supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer voor de lysis van rode bloedcellen. Incubeer gedurende 3 min - 5 min op ijs. Centrifugeer 400 x g gedurende 5 min, 4 °C. Als de pellet nog steeds rood is, herhaal dan deze ACK-lysisbufferstap totdat de pellet wit wordt.
      4. Resuspendeer de pellet in 1 ml FCB en plaat 0,5 x 106- 1 x 106 cellen per put. Bereid vijf putten van een 96-well round-bottom plaat. Leg de plaat op ijs.
        OPMERKING: Gebruik dezelfde 96-putplaat die de lussen bevat (zie stap 5.6.6).
    2. Flow cytometrie kleuring
      1. Centrifugeer de 96-putplaat gedurende 5 min bij 400 x g, 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellets met 50 μL purified rat anti-mouse CD16/CD32 als een Fc-Block (1 μg per 100 μL FCB). Incubeer gedurende 5 min - 10 min op ijs.
      2. Immunostaining van het iLoop luminale gehalte: Bereid een mengsel voor dat alle fluorchrome geconjugeerde antilichamen bevat (1:50 verdunning in FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE en anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Voeg 50 μL van de combinatie per put toe, voor een eindvolume van 100 μL.
      3. Immunostaining van de witte bloedcellen voor compensaties (1:50 verdunning in FCB): Gebruik alleen 50 μL FCB (niet-besmet monster, put 1), 50 μL van elk individueel fluorochrome geconjugeerd antilichaam (putten 2 - 4), 50 μL van de combinatie van alle fluorochrome geconjugeerde antilichamen (put 5). Eindvolume van 100 μL.
      4. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht.
      5. Centrifugeer de plaat gedurende 5 min bij 400 x g, 4 °C. Gooi het supernatant weg en was met 200 μL FCB. Herhaal deze wasstap twee keer.
      6. Voeg FCB 150 μL/well toe aan de bloedmonsters.
      7. Voeg 100 μL/well FCB toe aan het iLoop luminal content sample. Dan 50 μL/put fluorescerende telparels.
    3. Flow cytometrie analyse
      1. Poort voor CD45 positieve gebeurtenissen en voor de uitdrukking van Ly-6G-/Gr-1 en CD11b30.
      2. Gebruik 100 μL van het monstervolume als stopconditie.
      3. Bereken het absolute aantal PMN dat naar het iLoop lumen is gemigreerd volgens de informatie van de fabrikant van de fluorescerende telparels.
        OPMERKING: Gegevens kunnen worden gepresenteerd als (1) totaal aantal PMN in het lumen30,34,35, (2) aantal PMN per gram weefsel en (3) aantal PMN per mm3 met behulp van de formule voor het volume van een cilinder: V = π(pi) r 2 h (V voor volume, r voor radius en h voor hoogte).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische weergave van de ileale lus- en pcLoop-modellen is weergegeven in respectievelijk figuur 1 en figuur 2. De anatomische afbeeldingen tonen de kritieke stappen van de procedure, waaronder exteriorisatie van het darmsegment (figuur 1B en figuur 2B), identificatie van een geschikte locatie voor ligaties die minimale verstoring van de bloedtoevoer mogelijk maakt (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontregeling van de darmbarrièrefunctie en de rekrutering van immuuncellen onder pathologische aandoeningen zoals IBD worden onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een robuust in vivo murien model dat een goed gevasculariseerd exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt en het mogelijk maakt om de darmpermeabiliteit, neutrofiele migratiestudies en andere toepassingen te beoordelen.

De iLoop is een niet-hersteloperatie di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Dr. Sven Flemming van de Universiteit van Wuerzburg voor zijn bijdragen aan de totstandkoming van het proximale colon loop model, Sean Watson voor het beheer van de muizenkolonies en Chithra K. Muraleedharan voor het helpen bij de aanschaf van de foto's van het iLoop model. Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) aan KB, R01DK079392, R01DK072564 en R01DK061379 aan C.A.P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting en materiaal
BD Alcohol SwabsBD326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"BD305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"BD305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without NeedleBD309659
15ml Centrifuge TubeCorning14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene MicroplateFisherScientific07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
Cotton Tip Applicator (wattenstaafje), 6", sterieleFisherScientific25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, inclusief verwarmingseenheden)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml VWR21008-940
Fisherbrand Colored Labeling TapeFisherScientific15-901-10R
Halsey Needle Holder (naaldhouder) FST12001-13
Kimwipes, klein (weefseldoekje)FisherScientific06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes Thomas Scientific c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serumklon activatorbuis)Sarstedt 41.1501.105
Moria Fine ScissorsFST14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube met Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)Falcon352235
Puralube Vet Ointment, steriele oculaire smeermiddelDechra12920060
Ring Forceps (blunde weefseltweezers)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (anatomische pincet)FST1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Naald 19mm lengte 3/8 cirkel omgekeerde snede HenryScheinSS694
Student Fine Forceps, GebogenFST91110-10
10ml Spuit PP/PE zonder naaldMillipore Sigma Z248029
96 Well Cell Culture PlateCorning3799
Gele voedingsbuisjes voor knaagdieren 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Oplossingen en buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing BufferBioWhittaker10-548E
Hanks' Balanced Salt SolutionCorning21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline zonder calcium en magnesiumCorning21-040-CV
Reagentia
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)BioLegend127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivatedR&D Systems511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, gemiddeld moleculair gewicht 4.000Sigma60842-46-8
IsofluraneHalocarbon12164-002-25
Leukotriene B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)BD Bioscience553142
Recombinant Murine IFN-γPeprotech315-05
Recombinant Murine TNF-αPeprotech315-01A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157(2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98(2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037(2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095(2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024(2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606(2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709(2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392(2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49(2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neutrofielenmigratieepitheliale barri retight junctionsFITC dextran assayinflammatoire darmziekteflowcytometrieJAM A eiwit

Gerelateerde artikelen