Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62104

⸱

21 januari 2021

 ,  , 
1Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Universidad Nacional de Colombia

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), een contactloze scanning probe-techniek die beeldvorming op nanoschaal van stereocilia-bundels in levende auditieve haarcellen mogelijk maakt.

Samenvatting

Binnenoorhaarcellen detecteren door geluid geïnduceerde verplaatsingen en transduceren deze stimuli in elektrische signalen in een haarbundel die bestaat uit stereocilia die zijn gerangschikt in rijen van toenemende hoogte. Wanneer stereocilia worden afgebogen, trekken ze aan kleine (~ 5 nm in diameter) extracellulaire tiplinks die stereocilia met elkaar verbinden, die krachten overbrengen naar de mechanosensitieve transductiekanalen. Hoewel mechanotransductie al tientallen jaren wordt bestudeerd in levende haarcellen, kunnen de functioneel belangrijke ultrastructurele details van de mechanotransductiemachinerie aan de uiteinden van stereocilia (zoals tiplinkdynamica of transductie-afhankelijke stereocilia remodeling) nog steeds alleen worden bestudeerd in dode cellen met elektronenmicroscopie. Theoretisch hebben scanning probe technieken, zoals atoomkrachtmicroscopie, voldoende resolutie om het oppervlak van stereocilia te visualiseren. Echter, onafhankelijk van de beeldvormingsmodus, beschadigt zelfs het geringste contact van de atoomkrachtmicroscopiesonde met de stereociliabundel meestal de bundel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de hoppping probe ion conductance microscopy (HPICM) beeldvorming van levende knaagdier auditieve haarcellen. Deze contactloze scanning probe-techniek maakt time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen mogelijk met een complexe topografie, zoals haarcellen, met een resolutie van enkele nanometers en zonder fysiek contact met het monster te maken. De HPICM maakt gebruik van een elektrische stroom die door de glazen nanopipette gaat om het celoppervlak in de nabijheid van de pipet te detecteren, terwijl een piëzo-elektrisch systeem met 3D-positionering het oppervlak scant en zijn beeld genereert. Met HPICM waren we in staat om stereociliabundels en de verbindingen die stereocilia met elkaar verbinden in live auditieve haarcellen gedurende enkele uren in beeld te brengen zonder merkbare schade. We verwachten dat het gebruik van HPICM directe verkenning van ultrastructurele veranderingen in de stereocilia van levende haarcellen mogelijk zal maken voor een beter begrip van hun functie.

Inleiding

Ondanks het feit dat stereociliabundels in de auditieve haarcellen groot genoeg zijn om te worden gevisualiseerd door optische microscopie en afgebogen in levende cellen in een patchklemexperiment, konden de essentiële structurele componenten van de transductiemachinerie zoals tiplinks alleen worden afgebeeld met de elektronenmicroscopie in dode cellen. In de auditieve haarcellen van zoogdieren bevindt de transductiemachinerie zich aan de onderkant van de tiplinks, d.w.z. aan de uiteinden van de kortere rij stereocilia1 en lokaal geregeld door de signalering aan de uiteinden van stereocilia2,3. Toch is labelvrije beeldvorming van de oppervlaktestructuren op deze locatie in levende haarcellen niet mogelijk vanwege de kleine afmetingen van stereocilia.

Het slakkenhuis van zoogdieren heeft twee soorten auditieve sensorische cellen: binnenste en buitenste haarcellen. In de binnenste haarcellen zijn stereocilia langer en dikker in vergelijking met die in de buitenste haarcellen4. De eerste en tweede rij stereocilia hebben een diameter van 300-500 nm in binnenste haarcellen van muizen of ratten. Door de diffractie van licht is de maximale resolutie die haalbaar is met een labelvrije optische microscopie ongeveer 200 nm. Vandaar dat visualisatie van individuele stereocilia binnen de eerste en tweede rij van de binnenste haarcelbundel relatief eenvoudig is met optische microscopie. Daarentegen hebben kortere rijen stereocilia in de binnenste haarcellen en alle stereocilia van de buitenste haarcellen diameters rond 100-200 nm en kunnen niet worden gevisualiseerd met optische microscopie5. Ondanks de recente vooruitgang in superresolutiebeeldvorming, blijft deze fundamentele beperking bestaan in elke optische labelvrije beeldvorming. Alle huidige commercieel verkrijgbare superresolutietechnieken vereisen een soort fluorescerendemoleculen 6, wat hun toepassingen beperkt. Naast beperkingen als gevolg van de behoefte aan specifieke fluorescerend gelabelde moleculen, is aangetoond dat blootstelling aan intense lichtbestraling cellulaire schade veroorzaakt en cellulaire processen kan beïnvloeden, wat een groot nadeel is bij het bestuderen van levende cellen7.

Onze huidige kennis van de ultrastructurele details van haarcel stereocilia bundels is meestal verkregen met verschillende elektronenmicroscopie (EM) technieken, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM), transmissie elektronenmicroscopie (TEM), freeze-fracture EM, en onlangs met 3D-technieken zoals seriële sectie met gerichte ionenbundel of cryo-EM tomografie8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Helaas vereisen al deze EM-technieken chemische of cryofixatie van het monster. Afhankelijk van de tijdschaal van de verschijnselen, maakt deze vereiste een studie van de dynamische processen aan de uiteinden van stereocilia onmogelijk of zeer arbeidsintensief.

Er zijn beperkte inspanningen geleverd om haarbundels van levende haarcellen in beeld te brengen met atoomkrachtmicroscopie (AFM)17,18. Omdat AFM in fysiologische oplossingen werkt, zou het in theorie dynamische veranderingen in de stereociliabundels van levende haarcellen in de loop van de tijd kunnen visualiseren. Het probleem ligt in de principes van hoge resolutie AFM, wat een zeker fysiek contact tussen de AFM-sonde en het monster impliceert, zelfs in de minst schadelijke "tapmodus"19. Wanneer de AFM-sonde een stereocilium tegenkomt, crasht deze er meestal tegenaan en beschadigt de structuur van de haarbundel. Als gevolg hiervan is deze techniek niet geschikt voor het visualiseren van levende of zelfs vaste haarcellenbundels17,18. Het probleem kan gedeeltelijk worden verlicht door een grote balvormige AFM-sonde te gebruiken die alleen hydrodynamische krachten oplegt aan het oppervlak van het monster20. Hoewel een dergelijke sonde bij uitstek geschikt is om de mechanische eigenschappen van het monster21te testen, biedt deze slechts een resolutie van minder dan een micrometer bij het afbeelden van het orgaan van Corti22 en past het nog steeds een kracht toe op het monster die aanzienlijk kan zijn voor de zeer gevoelige stereociliabundels.

Scanning ion conductance microscopie (SICM) is een versie van scanning probe microscopie die gebruik maakt van een glazen pipet sonde gevuld met een geleidende oplossing23. SICM detecteert het oppervlak wanneer de pipet de cel nadert en de elektrische stroom door de pipet afneemt. Omdat dit gebeurt ruim voordat de cel wordt aangeraakt, is de SICM bij uitstek geschikt voor contactloze beeldvorming van levende cellen in fysiologische oplossing24. De beste resolutie van SICM is in de orde van enkele nanometers, waarmee individuele eiwitcomplexen kunnen worden opgelost bij het plasmamembraan van een levende cel25. Net als bij andere scanning probe-technieken is SICM echter in staat om alleen relatief vlakke oppervlakken in beeld te brengen. We hebben deze beperking overwonnen door het uitvinden van de hoppende sonde ionengeleidingsmicroscoop (HPICM)26, waarbij de nanopipette het monster op elk beeldvormingspunt nadert (Figuur 1A). Met behulp van HPICM konden we stereociliabundels in levende auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie27 inbeeld brengen.

Een ander fundamenteel voordeel van deze techniek is dat HPICM niet alleen een imaging tool is. In tegenstelling tot andere scanning probe technieken, is de HPICM/SICM probe een elektrode die veel gebruikt wordt in de celfysiologie voor elektrische opnames en lokale afgifte van verschillende stimuli. Ionkanaalactiviteit interfereert meestal niet met HPICM-beeldvorming, omdat de totale stroom door de HPICM-sonde enkele ordes van grootte groter is dan de extracellulaire stroom die wordt gegenereerd door de grootste ionkanalen25. HPICM maakt echter een nauwkeurige positionering van de nanopipette over een interessante structuur en daaropvolgende eenkanaals patch-clamp-opname van deze structuurmogelijk 28. Dit is hoe we de eerste voorlopige opnames van eenkanaalsactiviteit aan de uiteinden van de buitenste haarcel stereocilia29verkregen . Het is vermeldenswaard dat zelfs een grote stroom door de nanopipette geen significante veranderingen van het potentieel over het plasmamembraan kan veroorzaken als gevolg van enorme elektrische shunt van het extracellulaire medium. Individuele ionkanalen kunnen echter mechanisch worden geactiveerd door vloeistofstroom door de nanopipette30 of chemisch door lokale toepassing van een agonist31.

In HPICM wordt het beeld gegenereerd wanneer een nanopipette het monster op een bepaald punt achtereenvolgens nadert, zich terugtrekt en vervolgens in laterale richting beweegt om de benadering te herhalen (Figuur 1A). Een patchklemversterker past constant spanning toe op een AgCl-draad in de pipet(figuur 1B)om een stroom van ~ 1 nA in de badoplossing te genereren. De waarde van deze stroom wanneer de pipet zich van het oppervlak van de cel bevindt, wordt bepaald als een referentiestroom (Iref, Figuur 1C). Vervolgens beweegt de pipet in de Z-as om het monster te benaderen totdat de stroom wordt verminderd met een hoeveelheid die vooraf is gedefinieerd door de gebruiker (instelpunt), meestal 0,2% -1% van de Iref (figuur 1C, bovenste trace). Het systeem slaat vervolgens de Z-waarde op dit moment op als de hoogte van het monster, samen met X- en Y-coördinaten van dit beeldpunt. Vervolgens wordt de pipet weggetrokken van het oppervlak(figuur 1C,onderste spoor) met een snelheid die door de gebruiker is gedefinieerd, meestal 700-900 nm / ms. Na intrekking wordt de pipet (of, in ons geval, het monster - zie figuur 1B) zijdelings naar het volgende beeldvormingspunt verplaatst, wordt een nieuwe referentiestroomwaarde verkregen en nadert de pipet opnieuw het monster en herhaalt het proces. De X-Y-beweging van de pipet heeft de voorkeur in een rechtopstaande microscoopopstelling die meestal wordt gebruikt voor opnames van de mechanotransductiestromen van de haarcel. In deze instelling benadert de HPICM-sonde de haarcelbundels niet van bovenaf, maar onder een hoek32. De beste resolutie van HPICM-beeldvorming wordt echter bereikt in een omgekeerde microscoopopstelling(Figuur 1A,B),waarbij de beweging van het monster in X-Y-richtingen wordt ontkoppeld van Z-beweging van de nanopipette, waardoor potentiële mechanische artefacten worden geëlimineerd.

Met behulp van HPICM verkregen we topografische beelden van muis en rat binnen- en buitenste haarcel stereocilia bundels, en visualiseerden zelfs de verbindingen tussen de stereocilia die ongeveer 5 nm in diameter26,27zijn. Het succes van beeldvorming van haarcellenbundels met deze techniek is afhankelijk van verschillende factoren. Ten eerste moet de ruis (variantie) van de nanopipettestroom zo klein mogelijk zijn om het laagst mogelijke instelpunt voor HPICM-beeldvorming mogelijk te maken. Een laag instelpunt stelt HPICM-sonde in staat om het stereocilia-oppervlak op een grotere afstand en onder elke hoek ten opzichte van de sondebenadering te "detecteren" en verbetert verrassend genoeg de X-Y-resolutie van HPICM-beeldvorming (zie discussie). Ten tweede moeten de trillingen en driften in het systeem worden verminderd tot minder dan 10 nm, omdat ze direct bijdragen aan de beeldvormingsartefacten. Ten slotte, hoewel de HPICM-sonde en de monstertrap in Z- en X-Y-assen worden verplaatst door de gekalibreerde feedbackgestuurde piëzo-actuatoren met een nauwkeurigheid van een enkele nanometer of beter, bepaalt de diameter van de nanopipettepunt de spreiding van de stroom (detectievolume) en dus de resolutie(figuur 1A). Daarom is het van vitaal belang om, voordat u levende haarcellen in beeld brengt, de juiste pipetten te trekken, de gewenste resolutie te bereiken met kalibratiemonsters en een laag geluidsniveau in het opnamesysteem te bereiken.

Al minstens een paar decennia is de SICM-techniek niet commercieel beschikbaar en is deze door slechts enkele laboratoria ter wereld ontwikkeld met het toonaangevende laboratorium van Prof. Korchev in het Imperial College (VK). Onlangs zijn verschillende SICM-systemen commercieel beschikbaar geworden (zie Tabel met materialen),die allemaal zijn gebaseerd op de oorspronkelijke HPICM-principes. Het afbeelden van stereociliabundels in de haarcellen vereist echter verschillende aangepaste aanpassingen die technisch uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten "ready-to-go" -systemen. Daarom is enige componentintegratie nodig. Aangezien HPICM-opstelling een patchkleminstallatie vertegenwoordigt met strengere trillings- en driftvereisten en een piëzo-aangedreven beweging van de HPICM-sonde en het monster(figuur 1D),is deze integratie relatief eenvoudig voor elke onderzoeker, die bekwaam is in patchklemmen. Een wetenschapper zonder de juiste achtergrond zou echter zeker eerst enige training in elektrofysiologie nodig hebben. Ondanks resterende uitdagingen zoals het verhogen van de snelheid van beeldvorming (zie Discussie),zijn we in staat geweest om stereocilia-bundels in levende haarcellen met nanoschaalresolutie in beeld te brengen zonder ze te beschadigen.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol om succesvolle HPICM-beeldvorming uit te voeren van de levende auditieve haarcelbundels in jonge postnatale rat- of muiscochleaire explantaten met behulp van ons aangepaste systeem. De geïntegreerde componenten zijn opgenomen in de tabel met materialen. Het artikel beschrijft ook veelvoorkomende problemen die kunnen worden ondervonden en hoe u deze kunt oplossen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky (protocol 00903M2005).

1. Productie en testen van de nanopipettes

  1. Maak een programma in de micropipette-trekker om pipetten te verkrijgen met een weerstand tussen 200 en 400 MΩ, wat overeenkomt met binnenste tipdiameters van ongeveer 50-70 nm. De parameters zijn afhankelijk van de micropipette-trekker. Om korte pipetten met niet-flexibele fijne tips te verkrijgen, raadpleegt u de bedieningshandleiding van de trekker.
  2. Gebruik borosilicaatglascapillairen met buiten-/binnendiameters van 1/0,58 mm en een binnenfilament om het vullen te vergemakkelijken. De lengte van de pipet is cruciaal omdat deze de frequentie van de laterale mechanische resonantie van de pipet bepaalt. Hoe langer de pipet is, hoe lager de resonantiefrequentie en hoe moeilijker het is om deze resonantie te vermijden.
    OPMERKING: De gebruiker moet proberen de kortste pipet te maken die de houder kan accepteren. De lengte van nanopipettes in dit experiment is meestal 15-25 mm(figuur 2A).
  3. Vul de nanopipette tot het middelste punt(figuur 2A)met een badoplossing, ofwel Leibovitz's L-15 of met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 20 mM D-glucose (om de osmolariteit aan te passen). Om mogelijke artefacten te voorkomen, gebruikt u dezelfde oplossing die in het bad wordt gebruikt voor opnames.
  4. Controleer met behulp van een optische microscoop met een vergroting van 10x op eventuele bellen aan de punt van de pipet(figuur 2B). De bubbels zouden de stroom verhinderen. Het is moeilijker om bubbels in de pipetten te verwijderen die enkele uren voor het experiment zijn getrokken. Daarom wordt aanbevolen om bij elk experiment nieuwe pipetten te trekken.
  5. Zodra de pipet vrij is van bubbels, monteert u deze in de HPICM pipethouder(figuur 2C).
  6. Plaats het monster (weefsel of kalibratiestandaard) op de op maat gemaakte kamer en voeg 4 ml van de bovengenoemde badoplossing toe.
  7. Plaats de op maat gemaakte kamer op het HPICM-podium en introduceer de aardelektrode in de oplossing.
  8. Zorg ervoor dat de spanning die door de patchklemversterker op de pipet wordt toegepast nul is.
  9. Beweeg de pipet in Z totdat deze de vloeistof raakt.
  10. Stel de offset van de versterker in op nul en voeg vervolgens +100 mV toe om de pipetstroom te controleren.
  11. Bereken de weerstand en de diameter van de pipet, gebaseerd op de wet van Ohm:
    R = V/I
    waarbij R de weerstand is (MOhm), V de spanning die wordt toegepast op de nanopipette (mV) en I de stroom is die door de nanopipette (nA) stroomt.
    1. Bereken de binnendiameter van de pipet zoals elders beschreven volgens de volgende formule12:
      IDTip = 1000/ √R
      OPMERKING: De ideale weerstandswaarde ligt tussen 200 en 400 MΩ. Pipetten met een weerstand hoger dan 400 MΩ kunnen leiden tot een onstabiele stroom vanwege hun kleine formaat (< 50 nm binnendiameter). Integendeel, pipetten met weerstanden kleiner dan 200 MΩ zijn te groot (> 70 nm binnendiameter) en zouden kleine kenmerken niet oplossen. Het wordt aanbevolen om te beginnen met het maken van afbeeldingen met de pipetten met een weerstand van 200 MΩ, omdat ze gemakkelijker te vervaardigen zijn en de neiging hebben om minder elektrisch geluid te leveren.

2. Minimaliseren van monsterdriften en trillingen

OPMERKING: Om de mechanische ruis in het systeem tijdens het fotograferen te verminderen, monteert u de monsters op de op maat gemaakte kamers die dikke glasplaten (~ 1,2 mm) gebruiken:

  1. Verwijder het glazen gedeelte van een 50 mm glazen schaal, laat de plastic wanden intact.
  2. Lijm het plastic gedeelte van de celkweekschaal bovenop de dikke glasplaat met siliconenlijm.
  3. Monteer het kalibratiemonster in het midden van de kamer (bovenop de glasplaat) met siliconenlijm of dunne dubbelzijdige tape.
  4. Bevestig de kamer stevig op het HPICM-podium met dubbelzijdige tape.
  5. Sluit tijdens het fotograferen de kooi van Faraday en bedek deze met een deken om elektrische interferentie en thermische drift dienovereenkomstig te minimaliseren.

3.De resolutie testen met AFM-kalibratiestandaarden

OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om AFM-normen in beeld te brengen (zie Tabel met materialen)voordat u levende cellen in beeld brengt om problemen met het systeem op te lossen en de resolutie ervan in de X-Z-Y-assen te testen. De kalibratiestandaarden hebben siliciumdioxidepijlers en gaten van verschillende vormen, maar vaste hoogtes / diepten (d.w.z. 20 of 100 nm) op een siliciumchip van 5 x 5 mm. Beginnen met de 100 nm kalibratiestandaard wordt aanbevolen, om te garanderen dat de Z-resolutie lager is dan 100 nm. Na het bereiken van een succesvol hoge-resolutie beeld van de pilaren of gaten in dit kalibratiemonster(figuur 3A),gaat u naar de 20 nm-standaard. Als de beeldvorming van de laatste standaard succesvol is(figuur 3B),is de resolutie in de Z-as gegarandeerd lager dan 20 nm en geschikt voor de beeldvorming van de haarcelstereociliabundels12. De volgende stappen worden gebruikt om beide kalibratiestandaarden in beeld te brengen.

  1. Bevestig de kalibratiestandaard met siliconenlijm aan de kamer.
  2. Voeg 4 ml HBSS toe aan de kamer om het kalibratiemonster af te dekken. Bevestig vervolgens de kamer aan de XY-fase van de HPICM-opstelling met dubbelzijdige tape.
  3. Klem de magnetische houder van de aardelektrode vast aan het podium in de buurt van de kamer en dompel de elektrode onder in de badoplossing(figuur 1B).
  4. Monteer de nanopipette in de houder, dompel hem onder in de badoplossing en stel de stroom in op ~1 nA volgens de stappen beschreven in sectie 1.
  5. Plaats de nanopipette ongeveer boven het midden van de kalibratiestandaard met behulp van een course patch-clamp manipulator. Visuele inspectie is meestal voldoende voor deze positionering, omdat het gebied bedekt met siliciumdioxidestructuren relatief groot is (1 x 1 mm). In tegenstelling tot het orgaan van Corti explants (zie hieronder), is de kalibratiestandaard niet transparant en daarom is een nauwkeurigere positionering geleid door optische beeldvorming niet mogelijk voor dit monster.
  6. Verhoog het instelpunt terwijl u het signaal van de sensor van de Z-piëzo-actuator op een oscilloscoop in realtime bewaakt. Na het vaststellen van een stabiele herhaalbare Z-benaderingscyclus (zoals in figuur 1C, onder), verlaagt u het instelpunt tot de waarde die net boven het instabiliteitspunt ligt. Deze procedure zou zorgen voor het optimale instelpunt voor deze specifieke nanopipette.
  7. Beweeg de pipet met een snelheid van ~5 μm/s met een patchklem micromanipulator naar beneden totdat deze het monster bereikt. Op dit moment zal het onderste niveau van het real-time Z-positioneringssignaal(figuur 1C)toenemen, wat aangeeft dat de nanopipette wordt teruggetrokken als gevolg van het "detecteren" van het monsteroppervlak. Elke verdere beweging van de nanopipette zal resulteren in een verdere positieve verschuiving van het Z-positioneringssignaal.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de bovengrens van Z piëzo-actuatorbeweging niet overschrijdt.
  8. Begin met het afbeelden bij lage resolutie (zie tabel 1). Door ongelijke montage van de AFM-norm kan het hoogste punt van het interessegebied onbekend zijn. Stel daarom de amplitude van pipetterugtrekking (hopamplitude) in op ten minste 200-500 nm.
    1. Zodra het hoogste punt van het monster in het beeldvormingsgebied is geïdentificeerd, verlaagt u de hopamplitude. Een kleinere hopamplitude maakt sneller scannen mogelijk, wat de voorkeur heeft voor beeldvorming met hoge resolutie vanwege verminderde effecten van de drifts en verminderde trillingen.
  9. Voordat u de pipet naar een nieuwe X-Y-locatie verplaatst, trekt u deze ongeveer 200 μm in de Z-as in om ongewenste botsingen met het monster te voorkomen.
    OPMERKING: In gevallen waarin de nanopipette niet is uitgelijnd met het midden van de kalibratiestandaard, is het mogelijk dat het scannen net buiten het oppervlak begint.
  10. Nadat het interessegebied is gevonden, begint u met beeldvorming met een hogere resolutie (zie tabel 1).

4. Het maken van op maat gemaakte kamers om de cochleaire explants te beveiligen

OPMERKING: Monteer de cochleaire explants in de kamers met op maat gemaakte klemsystemen die gebruik maken van flexibele glazen pipetten (stap 4.1) (figuur 4A) of tandzijde (stap 4.2) (figuur 4B). De glazen pipetkamer kan worden gesteriliseerd en gebruikt voor de gekweekte organen van Corti, terwijl de tandzijdekamer zorgt voor een veiligere opslag van het monster en een controle over de oriëntatie van de stereociliabundel tijdens de montage. Deze op maat gemaakte kamers moeten van tevoren worden voorbereid, maar ze kunnen worden gereinigd en hergebruikt in verschillende beeldvormingssessies.

  1. Maak een kamer met flexibele glazen pipetten
    1. Trek twee dunne en flexibele glasvezels uit glazen haarvaten met behulp van een pipettrekker. Onze getrokken glasvezels zijn meestal 1 tot 2 cm lang en zijn redelijk flexibel.
    2. Plaats een klein druppeltje van het siliconenelastomeer op een glazen afdekplaat. Gebruik coverslips met een diameter van 2 cm.
    3. Plaats de uiteinden van twee glasvezels op de siliconendruppel en rangschik de vezels om een kleine mate van scheiding tussen hen te hebben(Figuur 4A).
    4. Leg de coverslip op een hete plaat om het elastomeer snel uit te harden (1 tot 3 min).
    5. Lijm de dekplaat op de glazen bodem van de kamer zoals beschreven in sectie 2 met behulp van een kleine hoeveelheid (1-3 μL) siliconenelastomeer en laat het een nacht uitharden.
  2. Een kamer maken met behulp van tandzijde:
    1. Verwijder het glazen gedeelte van een 50 mm glazen schaal en laat de plastic wanden intact. Lijm vervolgens het plastic gedeelte van de celkweekschaal bovenop een 1,2 mm dikke glasplaat met siliconenlijm.
    2. Monteer één plastic afdekplaat (6,5 x 6,5 mm) met dezelfde lijm in het midden van de kamer. Herhaal vervolgens het proces met een ander coverslipje bovenop de vorige.
    3. Monteer twee kleine wolfraam- of vergulde draden (12 mm lang en ~ 0,5 mm in diameter) met siliconenlijm, elk aan weerszijden van de afdekplaten. Lijm ze ver genoeg (> 10-15 mm) van de afdekplaten(figuur 4B).
    4. Scheid twee tandzijdestrengen en plaats ze bovenop de afdekschuifsels en bevestig ze aan de draden door een knoop te maken. Laat een kleine opening tussen beide strengen(figuur 4B,korte pijlen).
  3. Reinig de kamers na elk gebruik
    1. Verwijder het weefsel voorzichtig uit de kamer met een fijn pincet en schraap eventuele achtergebleven weefselresten lichtjes.
    2. Spoel de kamer eerst af met 70% ethanol en daarna met gedestilleerd water.
    3. Herhaal de spoelcyclus indien nodig.
    4. Plaats de kamer ondersteboven op een filterpapier om het te laten drogen tot het volgende experiment. De kamers hoeven niet te worden gesteriliseerd, tenzij het kweken van het orgaan van Corti na de beeldvorming is gepland.

5. Het knaagdierorgaan van Corti ontleden

  1. Voer dissectie uit van de jonge postnatale cochleaire explantaten zoals elders in detail beschreven13.
  2. Ontleed voor HPICM-beeldvorming het orgaan van Corti van muizen tussen postnatale dag 3 en 6 (P3-6) en van ratten tussen postnatale dag 3 en 8 (P3-8).
    OPMERKING: Oudere haarcellen zijn gevoeliger voor de schade tijdens dissectie en kunnen daarom niet worden gebruikt voor urenlange time-lapse HPICM-beeldvorming.
  3. Vergeet niet om het tectoriale membraan te verwijderen voordat HPICM-beeldvorming plaatsvindt.
  4. Zet het weefsel onmiddellijk na de dissectie vast in een van de in sectie 4 beschreven kamers en plaats het onder de flexibele glazen pipetten of onder de twee flosstrengen(figuur 4). Vul deze kamers vooraf met 4 ml van de badoplossing bij kamertemperatuur (om bubbelvorming te minimaliseren).

6. Beeldvorming van de auditieve haarcellen

  1. Monteer de kamer met een vers geïsoleerd orgaan van Corti op het X-Y piëzo-podium met dubbelzijdige tape en zorg ervoor dat deze stevig is bevestigd om kamerdrift in X- en Y-assen te minimaliseren(figuur 1B).
  2. Volg de stappen in sectie 1 om een nieuwe nanopipette te plaatsen en controleer op de juiste pipetweerstand.
  3. Plaats nanopipette met behulp van patchklemmicromanipulator over het haarcelgebied, terwijl u het orgaan van Corti explant in een omgekeerde microscoop observeert.
  4. Controleer of het systeem stabiel is met een instelpunt van 0,5% of lager door het real-time stroom- en Z-positioneringssignaal op de oscilloscoop te registreren (zoals in figuur 1C). Als het Z-signaal niet stabiel is, probeer dan de afsnijfrequentie van het laagdoorlaatfilter van de patchklemversterker te verlagen. Het kan echter niet lager zijn dan de responstijd van Z piëzo-actuator (om pipetbotsing met het monster als gevolg van vertraagde stroommetingen te voorkomen).
    OPMERKING: In de praktijk blijkt de 5 kHz-instelling van dit filter optimaal te zijn. Het is beter om de nanopipette te vervangen, als het Z-signaal nog steeds onstabiel is.
  5. Zodra een stabiele opname is bereikt, bepaalt u het optimale instelpunt en benadert u het monster met de HPICM-pipet zoals beschreven in de stappen 3.6-3.7 hierboven.
  6. Voer eerst beeldvorming met lage resolutie uit (zie tabel 1),met een hopamplitude van ten minste 6 tot 8 μm. Om hoge structuren zoals de haarcel stereocilia bundels in beeld te brengen, moet u ervoor zorgen dat de hopamplitude voldoende is om botsingen met deze structuren te voorkomen.
    OPMERKING: Als de hopamplitude niet voldoende is, kan de pipet niet over een stereocilium springen en zal er een dreigende botsing zijn. De botsing van de HPICM-sonde met een stereocilium kan de haarbundel beschadigen. Gebruik daarom, in gevallen waarin de hoogte van de stereociliabundel onzeker is, een grotere hopamplitude.
  7. Maak kennis met de topografie van het orgaan van Corti door eerst beelden uit te voeren en/of te bestuderen die zijn verkregen met scanning elektronenmicroscopie(Figuur 5).
    OPMERKING: Als het HPICM-beeld uniform is met de hoogten kleiner dan 1 μm in elk beeldvormingspunt, scant de pipet waarschijnlijk de glazen bodem en niet het weefsel. Als alternatief kan de pipet "landen" op een ander gebied van de cochleaire explant, weg van de haarcellen.
  8. Als de pipet naar een nieuwe X-Y-locatie moet worden verplaatst, trek deze dan ongeveer 500 nm in om botsingen met hoge functies in het weefsel te voorkomen. Herhaal HPICM-beeldvorming met lage resolutie totdat het gebied van belang met de haarcellen is gevonden.
  9. Nadat het interessegebied is gevonden, begint u met beeldvorming met een hogere resolutie (zie tabel 1). Probeer minder dan 15 minuten door te brengen bij het fotograferen van een hele haarbundel.
    OPMERKING: De haarcelbundels in het levende weefsel zijn niet stil, maar kunnen hun oriëntatie veranderen, bijvoorbeeld als gevolg van vormveranderingen in de onderliggende ondersteunende cellen. Daarom kunnen de afbeeldingen bewegingsartefacten vertonen als de beeldverwerving te langzaam verloopt.
  10. Bepaal nogmaals de hoogste functies in de afbeeldingen met een lage resolutie voordat de hopamplitude afneemt voor beeldvorming met hoge resolutie. Voor een interessegebied dat de hele haarcelbundel bedekt, vermindert u de hopamplitude tot 4-5 μm, terwijl voor een relatief klein en "vlak" gebied binnen de bundel (bijv. 2 x 2 μm) de hopamplitude nog verder wordt verlaagd, tot minder dan 1 μm, waardoor de snelheid en resolutie van beeldvorming toenemen.

7. Beeldverwerking

OPMERKING: Beeldartefacten komen vaak voor bij HPICM-beeldvorming. Sommigen van hen kunnen worden gecorrigeerd door beeldacquisitieparameters, terwijl andere nabewerking vereisen met een gespecialiseerde SICM-viewer of met meer algemene gegevensverwerkingsprogramma's zoals ImageJ of MatLab. Hier beschrijven we de meest voorkomende artefacten en hoe we ze repareren met SICM viewer.

  1. Hellingcorrectie uitvoeren
    OPMERKING: Het is niet duidelijk voor een beginner, maar het menselijk oog kan geen sub-micrometergroottekenmerken aan het oppervlak van een cel oplossen, als het beeldvormingsgebied een totale helling van gelijke of grotere grootte heeft(Figuur 3A,B,links). Daarom is het noodzakelijk om de gemiddelde helling van een afgebeeld gebied te bepalen (door HPICM 3D-beeldgegevens op een enkel vlak aan te passen) en deze af te trekken van de HPICM-afbeelding(figuur 3A,B,midden).
    1. Klik op Openen om een afbeelding met SICM-viewer te openen.
    2. Selecteer het tabblad Afbeeldingscorrectie.
    3. Selecteer het tabblad Juiste helling.
    4. Druk op de knop Helling corrigeren voor een automatische hellingcorrectie.
  2. Lijnuitlijning uitvoeren
    OPMERKING: Zoals eerder vermeld, vormen mechanische en/of thermische driften en artefacten voor celbewegingen een aanzienlijk probleem bij HPICM-beeldvorming. Een kleine drift met een snelheid van minder dan een micrometer per minuut is meestal niet merkbaar in een reguliere patchklemopstelling. Toch zou het artefacten van enkele tientallen nanometers kunnen produceren in HPICM-beeldvorming, die aanzienlijk groter is dan de resolutie van HPICM. Daarom is het niet ongewoon om plotselinge sprongen in de Z-as tussen twee naburige HPICM-scanlijnen tegen te komen tijdens het fotograferen. Dit kan worden gecorrigeerd door verschillen tussen beginnende (en/of eindigende) Z-waarden in deze naburige scanlijnen te analyseren.
    1. Klik op Openen om een afbeelding met SICM-viewer te openen.
    2. Selecteer het tabblad Afbeeldingscorrectie.
    3. Selecteer het tabblad Juiste helling.
    4. Kies de breedte van de lijnen die u wilt uitlijnen. Druk op de knop ButtonDestripeLineFit voor een geautomatiseerde lijnuitlijningscorrectie.
  3. Ruisonderdrukking uitvoeren
    OPMERKING: Tijdens het verkrijgen van beelden met HPICM kunnen kleine fluctuaties in de nanopipettestroom ertoe leiden dat de nanopipette ver van het oppervlak van het monster stopt, vooral bij lage instelpunten. Het resulteert in het verschijnen van kleine witte stippen in de afbeelding. Om dit beeldvormingsartefact te corrigeren, is het noodzakelijk om de beeldvormingspunten te identificeren met de Z-waarde die aanzienlijk groter is dan die van de buren en deze waarde te vervangen door een gemiddelde van de buren. Dit gebeurt door een instelbaar mediaanfilter.
    1. Klik op Openen om een afbeelding met SICM-viewer te openen.
    2. Selecteer het tabblad Beeldverwerking.
    3. Selecteer het tabblad Ruisonderdrukking.
    4. Stel het filter Drempel (μm) in voor de pixels die moeten worden verwijderd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, kan worden gebruikt om levende cellen met complexe topografie te visualiseren. Door deze stappen te volgen, verkrijgen we routinematig beelden van levende auditieve haarcelbundels van ratten(Figuur 6B,D). Ondanks het feit dat ze een lagere X-Y-resolutie hebben in vergelijking met SEM-beelden, kunnen onze HPICM-beelden met succes de verschillende rijen stereocilia, de vorm van de stereocilia-tips en zelfs de kleine links (~...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om succesvolle HPICM-beelden te verkrijgen, moeten gebruikers een geluidsarm en trillingsarm systeem opzetten en geschikte pipetten produceren. We raden ten zeerste aan om AFM-kalibratiestandaarden te gebruiken om de stabiliteit van het systeem te testen voordat u probeert live cell imaging uit te voeren. Zodra de resolutie van het systeem is getest, kunnen gebruikers overwegen om vaste organen van Corti-monsters af te beelden om vertrouwd te raken met de beeldvormingsinstellingen voordat ze live cell imaging proberen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

We danken Prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) voor de langdurige ondersteuning en het advies in alle fasen van het project. We bedanken ook Drs. Pavel Novak en Andrew Shevchuk (Imperial College, VK) en Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rusland) voor hun hulp bij softwareontwikkeling. De studie werd ondersteund door NIDCD/NIH (R01 DC008861 en R01 DC014658 tot G.I.F.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Analog oscilloscopeB&K Precision2160CAnalog oscilloscope voor real-time monitoring van nanopipet-stroom en Z-as benadering
AFM kalibratiestandaardenTED PELLA IncHS-100MG; HS-20MGDeze 100 en 20 nm kalibratiestandaarden worden gebruikt om de prestaties van het HPICM-systeem te testen
Benchtop vibratie-isolatorAMETEK/TMCEverstill K-400Actieve vibratie-isolatie
Borosilicaat glas capillairenWorld Precision Instruments (WPI)1B100F-4Borosilicaat glas capillairen voor de nanopipetten
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Te worden toegevoegd aan de badoplossing om osmolariteit aan te passen
DigitizerNational Instruments CorporationPCI-6221Multi-kanaals input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control voor Z bewegingStandford Research SystemsSIM900, SIM960, SIM980Instrumentatiemodules geïntegreerd in een externe PID controller voor Z beweging. Het vereist een snelle respons die meestal niet wordt geïmplementeerd in commerciële piëzo versterkers.
Faraday kooiAMETEK/TMCType IIVereist voor het afschermen van elektromagnetische interferentie
Glazen bodemschaalWorld Precision Instruments (WPI)FD5040-100Gebruikt als de schaal voor de kamer voor het weefsel
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14025092Extracellulaire (bad) oplossing
Instrumentatie versterkerBrownlee PrecisionModel 440Instrumentatie versterker biedt vereiste offsets, filtering en secundaire vergroting of verzwakking
Laser-gebaseerde micropipet-trekkerSutter InstrumentP-2000/GMicropipet-trekker om de nanopipetten te fabriceren. Laser is nodig voor scherpe kwarts pipetten.
Lebovitz's L-15, zonder fenol roodGibco, Thermo Fisher Scientific21083027Extracellulaire (bad) oplossing
MicromanipulatorScientificaPatchStarGebruikt voor "grof" positionering van de Z piëzo actuator
MicroscoopNikonEclipse TS100Invers optisch microscoop
Patch versterkerMolecular DevicesAxopatch 200BDe patch clamp versterker meet de stroom door de nanopijp
Piëzo versterker (XY assen)Physik Instrumente (PI)E-500.00, E-505.00, E-509.C2AVersterking en PID controle voor XY piëzo vertaaltafel
Piëzo versterker (Z as)Piezosystem jenaENT 400 & 800Aangepaste versterker bestaande uit ENT 400 voeding en twee ENT 800 versterkers parallel om een maximale stroom van 1.6 nA te bereiken
Kunststof dekglasjesTED PELLA Inc26028Gebruikt bij de fabricage van de kamers voor het weefsel 
SICM controller & software*Ionscope, UK (ionscope.com)N/AAangepaste controller gebaseerd op SBC6711 digitale signaalverwerkingskaart van Innovative Integration Ltd
Siliconen elastomeer (Sylgard)World Precision Instruments (WPI)SYLG184Gebruikt om de flexibele glazen vezels aan de kamer voor het weefsel te bevestigen
Silicium lijmThe Dow Chemical Company734Gebruikt om de verschillende delen van de kamer voor het weefsel te lijmen
Wolfraam staafA-M Systems717500Gebruikt voor het vasthouden van de tandenstokersdraden in de kamer voor het weefsel
XY piëzo nanopositionerPhysik Instrumente (PI)P-733.2DDXY vertaaltafel met capacitieve sensoren
Z piëzo nanopositionerPiezosystem jenaRA 12/24 SGRing piëzoactuator met een spanningsmeetwerkingssensor
*Ionscope verkoopt geen afzonderlijke SICM controllers meer. Er zijn enkele andere commerciële systemen:  NX12-Bio en NX10 SICM, 
Park Systems, Korea en SICM modules van ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). Al deze systemen zijn gebaseerd op de originele 
HPICM principes. Echter, het beeldvormen van stereocilia bundels in de haarcellen vereist verschillende aangepaste modificaties die technisch 
uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten “ready-to-go” systemen zoals Ionscope of NX12-Bio/NX10. Momenteel is er slechts één 
modulaire systeem (ICAPPIC) dat de flexibiliteit heeft om geschikt te zijn voor elk SICM/HPICM experiment maar vereist enige componentenintegratie. 

Referenties

  1. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  2. Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
  3. Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
  4. Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  8. Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
  9. Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
  10. Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
  11. Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
  12. Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
  13. Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
  14. Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182(2020).
  15. Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
  16. Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
  17. Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
  18. Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
  19. Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
  20. Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
  21. Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).
  22. Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
  23. Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
  24. Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
  25. Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
  26. Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
  27. Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
  28. Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
  29. Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
  30. Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
  31. Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
  32. Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
  33. Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hopping Probe Ion ConductanceHPICM beeldvorminglive cell imagingmechanotransductie apparaattip link dynamiekpatchclampCorti orgaan
Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.