Methodenartikel

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/62109

⸱

6 juli 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Betrouwbare genexpressiecontrole in zoogdiercellen vereist hulpmiddelen met een hoge vouwverandering, weinig ruis en bepaalde input-to-output overdrachtsfuncties, ongeacht de gebruikte methode. In de richting van dit doel hebben optogenetische genexpressiesystemen het afgelopen decennium veel aandacht gekregen voor spatiotemporale controle van eiwitniveaus in zoogdiercellen. De meeste bestaande circuits die lichtgeïnduceerde genexpressie regelen, variëren echter in architectuur, worden uitgedrukt uit plasmiden en maken gebruik van variabele optogenetische apparatuur, waardoor de noodzaak ontstaat om karakterisering en standaardisatie van optogenetische componenten in stabiele cellijnen te onderzoeken. Hier biedt de studie een experimentele pijplijn van betrouwbare gencircuitconstructie, integratie en karakterisering voor het beheersen van licht-induceerbare genexpressie in zoogdiercellen, met behulp van een negatieve feedback optogenetisch circuit als voorbeeld. De protocollen illustreren ook hoe het standaardiseren van optogenetische apparatuur en lichtregimes op betrouwbare wijze gencircuitkenmerken kan onthullen, zoals genexpressieruis en eiwitexpressiegrootheid. Ten slotte kan dit artikel van nut zijn voor laboratoria die niet bekend zijn met optogenetica en die dergelijke technologie willen toepassen. De hier beschreven pijplijn zou van toepassing moeten zijn op andere optogenetische circuits in zoogdiercellen, waardoor een betrouwbaardere, gedetailleerdere karakterisering en controle van genexpressie op transcriptioneel, proteomisch en uiteindelijk fenotypisch niveau in zoogdiercellen mogelijk is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Net als andere technische disciplines heeft synthetische biologie tot doel protocollen te standaardiseren, waardoor hulpmiddelen met zeer reproduceerbare functies kunnen worden gebruikt voor het verkennen van vragen die relevant zijn voor biologische systemen1,2. Een domein in de synthetische biologie waar veel controlesystemen zijn gebouwd, is het gebied van genexpressieregulatie3,4. Genexpressiecontrole kan zich richten op zowel eiwitniveaus als variabiliteit (ruis of variatiecoëfficiënt, CV = σ/μ, gemeten als de standaarddeviatie over het gemiddelde), die cruciale cellulaire kenmerken zijn vanwege hun rol in fysiologische en pathologische cellulaire toestanden5,6,7,8. Veel synthetische systemen die eiwitniveaus en ruis4,9,10,11,12 kunnen regelen, zijn ontworpen, waardoor mogelijkheden ontstaan om protocollen voor alle tools te standaardiseren.

Een nieuwe set hulpmiddelen die gennetwerken kunnen besturen die onlangs zijn ontstaan, is optogenetica, waardoor het gebruik van licht mogelijk is om genexpressie te regelen13,14,15,16,17. Net als hun chemische voorgangers kunnen optogenetische gencircuits in elk celtype worden geïntroduceerd, variërend van bacteriën tot zoogdieren, waardoor elk stroomafwaarts gen van belang kan worden uitgedrukt18,19. Vanwege de snelle generatie van nieuwe optogenetische hulpmiddelen zijn er echter veel systemen ontstaan die variëren in genetische circuitarchitectuur, expressiemechanisme (bijv. Plasmide-gebaseerde versus virale integratie) en lichtleverende controleapparatuur11,16,20,21,22,23,24,25 . Daarom laat dit ruimte voor standaardisatie van optogenetische kenmerken zoals gencircuitconstructie en -optimalisatie, methode van systeemgebruik (bijv. Integratie versus voorbijgaande expressie), experimentele hulpmiddelen die worden gebruikt voor inductie en analyse van resultaten.

Om vooruitgang te boeken bij het standaardiseren van optogenetische protocollen in zoogdiercellen, beschrijft dit protocol een experimentele pijplijn om optogenetische systemen in zoogdiercellen te engineeren met behulp van een negatief feedback (NF) gencircuit geïntegreerd in HEK293-cellen (menselijke embryonale niercellijn) als voorbeeld. NF is een ideaal systeem om standaardisatie aan te tonen, omdat het zeer overvloedig aanwezig is26,27,28 in de natuur, waardoor eiwitniveaus kunnen worden afgestemd en ruisminimalisatie kan optreden. Kortom, NF maakt nauwkeurige genexpressiecontrole mogelijk door een repressor die zijn eigen expressie voldoende snel vermindert, waardoor elke verandering weg van een steady state wordt beperkt. De steady state kan worden veranderd door een inductor die de repressor inactiveert of elimineert om meer eiwitproductie mogelijk te maken totdat een nieuwe steady state is bereikt voor elke inductorconcentratie. Onlangs is een ontwikkeld NF-optogenetisch systeem gecreëerd dat een breed-dynamische respons van genexpressie kan produceren, lage ruis kan behouden en kan reageren op lichtstimuli, waardoor het potentieel voor ruimtelijke genexpressiecontrole11. Deze hulpmiddelen, bekend als licht-induceerbare tuners (LITers), werden geïnspireerd door eerdere systemen die genexpressiecontrole in levende cellen mogelijk maakten4,10,29,30 en werden stabiel geïntegreerd in menselijke cellijnen om langdurige genexpressiecontrole te garanderen.

Hier, met behulp van de LITer als voorbeeld, wordt een protocol geschetst voor het creëren van lichtresponsieve gencircuits, het induceren van genexpressie met een Light Plate Apparatus (LPA, een optogenetische inductiehardware)31, en het analyseren van reacties van de gemanipuleerde, optogenetisch bestuurbare cellijnen op aangepaste lichtstimuli. Met dit protocol kunnen gebruikers de LITer-tools gebruiken voor elk functioneel gen dat ze willen verkennen. Het kan ook worden aangepast voor andere optogenetische systemen met verschillende circuitarchitecturen (bijv. Positieve feedback, negatieve regulatie, enz.) door de hieronder beschreven methoden en optogenetische apparatuur te integreren. Vergelijkbaar met andere synthetische biologieprotocollen, kunnen de video-opnames en optogenetische protocollen die hier worden beschreven, worden toegepast in eencellige studies op verschillende gebieden, waaronder maar niet beperkt tot kankerbiologie, embryonale ontwikkeling en weefseldifferentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ontwerp van gencircuits

  1. Selecteer genetische componenten om te combineren tot een enkel gencircuit/plasmide (bijv. DNA-integratiesequentiemotieven van zoogdieren32, lichtgevoelige elementen33 of functionele genen34).
  2. Gebruik genetische manipulatie en/of moleculaire kloonsoftware, sla de DNA-sequenties op voor later gebruik en referentie, annoteer elke sequentie en onderzoek alle noodzakelijke kenmerken (bijv. START-codons, regulerende of vertaalde sequenties)35.
  3. Ontwikkel of adopteer onderdelen volgens het algemene ontwerp van het gencircuit36. Als voorbeeld, voor optogenetische repressoren zoals in de LITers11, fuseer een gensequentie die codeert voor een domein dat in staat is tot lichtinduceerbare degradatie37,38 of inactivatie van het DNA-bindingsvermogen van een repressor39, grenzend aan en in het kader van het repressorgen (bijv. TetR)4.
    1. Zorg voor optogenetische activatoren voor de aanwezigheid van een activatordomein40 dat genexpressie bevordert op lichtgeïnduceerde DNA-binding41. Zorg voor negatieve of positieve autoregulatie voor de aanwezigheid van een regulerende bindingsplaats in of vóór de promotor van het regulatorgen (bv. tetO-locaties in of vóór de TetR-expressiepromotor)42.
  4. Ontwerp de primers voor DNA-sequentieversterking of sequencing van het plasmide met behulp van de moleculaire kloonsoftware voor elk gencircuit.
  5. Valideer de primers computationeel voor plasmideconstructie door middel van de ingebouwde smeerwaren van moleculaire kloonsoftware (bijv. sequentie-uitlijning).
  6. Bestel oligonucleotide primers bij de fabrikant. Plasmiden geconstrueerd en gebruikt in dit werk zijn te vinden in het originele ondersteunende materiaal11 samen met de primers ontworpen en gebruikt.
  7. Verdun de primers tot een voorraadconcentratie van 100 mM in dubbel gedestilleerd water (ddH2O).
  8. Verdun de voorraad van 100 mM stockprimers tot een concentratie van 10 mM voor PCR.
  9. Bereid het PCR-mengsel voor met 1 μL voorwaartse primer, 1 μL omgekeerde primer, 1 μL sjabloon-DNA tot een totale massa van 0,5-500 ng voor genomisch of 0,5 pg-5 ng voor plasmide of viraal DNA, 12,5 μL DNA-polymerase 2x mastermix (of het volume dat voldoet aan de verdunningsfactor van de fabrikant) en 9,5 μL ddH2O voor een totaal reactievolume van 25 μL.
  10. Incubeer het PCR-mengsel in een thermocycler op de juiste instellingen, afhankelijk van het gekozen enzym43. Voorgestelde reactiecycli omvatten:
    Stap 1: Eén cyclus van 30 s initiële denaturatiestap bij 95 °C.
    Stap 2: 40 cycli van 5 s denaturatiestap bij 98 °C.
    Stap 3: Eén cyclus van 30 s gloeistap bij 65 °C (bepaald door eerder ontworpen primers).
    Stap 4: Een cyclus van 1 minuut verlenging bij 72 °C (~1 kilobase (kb) template fragment lengte).
    Stap 5: Eén cyclus van een verlenging van 2 minuten bij 72 °C.
    Houd de reactie op 4 °C totdat deze kan worden getest via gel-elektroforese. Dit protocol zal variëren afhankelijk van de gebruikte reagentia (bijv. Polymerase en buffers).
  11. Herhaal stap 1.9 om alle fragmenten te versterken die moeten worden gebruikt in een DNA-assemblagereactie die nodig is voor het koppelen van lineaire PCR-producten in een enkele circulaire DNA-vector.
  12. Voer de PCR-producten uit op een 1% agarose-gel, gevolgd door het zuiveren van de banden van de gewenste lengte.
  13. Bereid de mastermix voor op een DNA-assemblagereactie (tabel 1).
    OPMERKING: In dit voorbeeld wordt de moedervector in twee fragmenten gesplitst om de efficiëntie van de PCR-stappen te verhogen zonder significante veranderingen in het algehele assemblageresultaat te veroorzaken.
  14. Incubeer het DNA-assemblagereactiemastermengsel in een thermocycler bij 50 °C gedurende 1 uur (tenzij anders gespecificeerd in het DNA-assemblagereagensprotocol) en bewaar de reactie bij 4 °C om het reactieproduct te gebruiken voor bacteriële transformatie.
  15. Stel bacteriële transformatie (chemisch of elektroporatie) in met behulp van competente E. coli (Escherichia coli) cellen en het bijbehorende bacteriële transformatieprotocol. Gebruik na de transformatie de bacteriële Luria-Bertani (LB) agarplaten met de gekozen bacteriële selectiemarker (bijv. Ampicilline) om het transformatiemengsel te vergulden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C44.
  16. Controleer de platen de volgende dag. Om de kolonies te enten, pluk je individuele kolonies van de platen en resuspend ze in een vloeibare LB-bouillon met de bijbehorende bacteriële selectiemarker in kweekbuizen. Incubeer in een schudderincubator bij 37 °C, 300 rpm 's nachts.
  17. Voer plasmidepreparaatprotocol uit om het plasmide-DNA uit de bacteriecultuur te extraheren.
  18. Valideer het circuit in twee stappen. Voer eerst een testvertering uit met behulp van restrictie-enzymen als een ruwe verificatie om te zien of het geschatte plasmideproduct is verkregen. Ten tweede, als de testvertering is geslaagd / bevestigd, dient u het plasmide in bij een Sanger-sequencingfaciliteit (of proces met behulp van de beschikbare apparatuur) om de precieze DNA-sequentie te verkrijgen om deze later te vergelijken met de verwachte sequentie in de ontwerpsoftware.
    1. Om de testvertering uit te voeren, selecteert u ten minste twee restrictie-enzymen die ten minste twee fragmenten produceren, op basis van de gebruikte moleculaire kloonsoftware. Zodra de enzymen zijn geselecteerd, bereidt u de testmonsters voor door 1 μL van elk enzym, 5 μL van het gegenereerde DNA en 13 μL water met geschikte zouten en buffers toe te voegen, afhankelijk van de gebruikte enzymen. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur, of zoals de enzymfabrikant suggereert. Voer de testverteringsproducten uit op een 1% agarose-gel en bepaal of de banden correct zijn.
      OPMERKING: Als de banden correct zijn, gaat u verder met sequencing.
    2. Om sequencing uit te voeren, genereert u primers op basis van het DNA dat in de software is opgeslagen, zodat de gloeigebieden van de primers ongeveer 500 bp (basenparen) uit elkaar liggen en het interessante fragment (gencircuitcomponent) of het volledige plasmide bedekken. Verdun de primers met zuiver nucleasevrij water (NF-H2O) tot een concentratie van 10 mM. Bereid de sequencingmonsters voor door 1 μL 10 ng/μL DNA, 1 μL primer en 8 μL NF-H2O toe te voegen aan een buis van 0,2 ml. Herhaal dit voor elke primer.
      OPMERKING: Wanneer monsters zijn voorbereid, geeft u ze af bij de sequencingfaciliteit en vergelijkt u de resultaten met plasmidesequentie met behulp van moleculaire kloonsoftware.
  19. Genereer in deze stap ongeveer 100-1000 ng / μL DNA-monster voor het integreren van de plasmiden die gencircuits bevatten in de juiste cellijn.

2. Stabiele cellijn engineering

  1. Bestel een zoogdiercellijn die is ontworpen voor het snel genereren van stabiele sublijnen die zorgen voor een expressie op hoog niveau van het eiwit van belang van een zoogdierexpressievector. Het celtype en het gemak van cellijntechniek kunnen variabel zijn, afhankelijk van wat de gebruikers verkiezen of willen bereiken.
    1. Als gebruikers bijvoorbeeld de voorkeur geven aan cellijntechniek met minimale tussenstappen, bestelt u de cellen die een enkele stabiele integratiesite bevatten (bijv. FRT) op een transcriptioneel actieve genomische locus. Als meer genuanceerde celtechnologie de voorkeur heeft, maak dan integratielocaties op voorkeurslocaties met behulp van genetische manipulatietools zoals CRISPR / Cas9.
  2. Kweek cellen in 5% CO2 in bevochtigde lucht bij 37 °C. Pas de groeiomstandigheden indien nodig aan voor het celtype.
  3. Transfecteer de hierboven ontworpen gencircuits in de gewenste cellen die zijn verkregen uit de vorige stappen om een stabiel cellijngeneratieproces te starten. Gebruik hiervoor een liposoommengsel45 van het gencircuit-DNA met geschikte recombinase (bijvoorbeeld Flp-recombinase voor Flp-FRT-recombinatie) of via andere methoden zoals elektroporatie.
  4. Twee dagen na transfectie, splits de cellen tot 25% confluency.
  5. Zes uur na het splitsen van de cellen, begin met de selectie van antibiotica door de media uit te wisselen naar een vers medium met 50 μg / ml hygromycine-antibioticum (of een ander antibioticummiddel dat overeenkomt met het antibioticaresistentiegen van zoogdieren dat tijdens de plasmideconstructie is gekozen).
    OPMERKING: Er zijn verschillende antibioticaresistentiegenen van zoogdieren die worden gebruikt in de constructie van gencircuits, die elk een andere kill-curve hebben. Daarom, welk antibioticaresistentiegen voor zoogdieren ook wordt gekozen voor circuitconstructie, een goede kill-curve moet worden bestudeerd in de cellen van belang. Deze stap zorgt ervoor dat cellen die de lading van het gencircuit bevatten, worden verrijkt, terwijl cellen zonder het systeem worden gedood.
  6. Laat de cellen groeien in de antibioticaselectiemedia, verander om de 2-3 dagen in verse media totdat de plaat of kolf enkele tientallen foci heeft. Passage-adherente culturen wanneer ze zich in de logfase bevinden voordat ze samenvloeiing bereiken.
  7. Zodra er voldoende foci zijn, trypsiniseren de cellen met 1 ml 0,25% trypsine, 0,1% EDTA in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium, magnesium en natriumbicarbonaat gedurende enkele minuten. Neutraliseer de trypsine met verse media en geef alle cellen door aan een verse container.
  8. Zodra de cellen in de verse container 80% -100% confluent zijn, vriest u ze in een mix van 45% oude media, 45% verse media en 10% DMSO. Breng de resterende cellen over naar een steriele buis en voer eencellige sortering uit om monoklonale cellen te isoleren in een 96-well plaat.
  9. Ongeveer 2-3 weken na monoklonaal sorteren moeten putten in de 96-putplaat foci hebben. Wanneer ongeveer 50% -60% confluent, splits de cellen in een 12-well plaat.
  10. Zodra de 12-well plaat 80%-100% confluent is, gesplitst in een met weefselkweek behandelde T-25 kolf. Zodra de cellen in de T-25-kolf 80% -100% confluent zijn, vriest u de cellen in en behoudt u een doorgang voor karakterisering en testen van monoklonale cellijnen.
    1. Karakteriseer de monoklonale cellijnen door microscopie en flowcytometrie-assays om genexpressieprofielen te rapporteren op basis van de geïnduceerde fluorescerende reporterproductie. Controleer de functionele eiwitproductie via fluorescerende antilichaametikettering en immunofluorescentietest. Test de genexpressie-inductie op transcriptioneel niveau via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Valideer de genetische sequentie en integratienauwkeurigheid via lokale en volledige genoomsequencing van de klonen.

3. Inductietests voor lichtplaatapparatuur

  1. Bouw een LPA-apparaat31,46 voor gebruik voor lichtinductie van gemanipuleerde cellen. Kortom, verschillende brede stappen zijn cruciaal voor het creëren van LPA om te gebruiken voor het beheersen van genexpressie. Deze omvatten 3D-printen van LPA-framecomponenten, printplaatconstructie, het programmeren van het circuit via microcontrollerprogrammeur, het assembleren van de componenten tot een definitieve LPA, het programmeren van de geheugenkaart via IRIS-software en het kalibreren van het voltooide apparaat. Voor een meer grondige uitleg, zie de bovenstaande referenties.
    1. Print de 3D-onderdelen zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)31,46.
    2. Monteer de printplaat zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)31,46.
    3. Voeg de firmware toe aan het geassembleerde LPA-circuit met behulp van microcontrollerprogrammeur zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)31,46.
    4. Combineer 3D-geprinte onderdelen en de geassembleerde printplaat zoals beschreven in Gerhardt et al. (2016 en 2019)31,46. Dit omvat het nemen van de montageplaat, de printplaat, de LED-afstandhouder (light-emitting diodes), de plaatadapter, een 24-well plaat, een plaatdeksel, montagebouten en vleugelmoeren en stapelcomponenten zoals getoond in de gefilmde video en figuur 2.
    5. Volg de onderstaande stappen voor het programmeren en kalibreren van de geheugenkaart van het apparaat.
  2. Gebruik de IRIS-software die beschikbaar is op de website van Tabor Lab47 om een SD-kaart voor het Light Plate Apparatus (LPA)31 te programmeren en de juiste lichtomstandigheden te onderzoeken die nodig zijn om een optogenetisch experiment te starten.
    OPMERKING: De IRIS-software is een webgebaseerde applicatie voor het programmeren van de optogenetische elektronische hardware, bekend als de LPA, ontwikkeld door het Tabor Lab. De software maakt het programmeren van relatieve IRIS-waarden mogelijk die de individuele lichtgevende diodes (LED's) in elke put van de LPA-hardware regelen.
  3. Kies de vervolgkeuzelijst LPA (4 x 6), gevolgd door op de juiste verlichtingsaanpak te klikken (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    OPMERKING: Voor dit manuscript zullen alle testen zich richten op de steady-state voorbeelden. De geavanceerde instellingsvoorbeelden kunnen echter worden gebruikt voor pulsduur en duty cycle-regimes.
  4. Kies of de bovenste of onderste LED's worden verlicht door waarden in te voeren in de cellen die overeenkomen met de putjes van de plaat. Voor de LPA's die in dit werk werden gebruikt, werden in alle experimenten blauwe LED's gebruikt die op de bovenste positie waren geplaatst. Elke LED kan, eenmaal geprogrammeerd, continue lichtblootstelling bieden met een constante lichtintensiteit. De IRIS-software maakt 4096 intensiteitsniveaus mogelijk die kunnen worden geprogrammeerd.
  5. Zodra de LED-locaties zijn gekozen, voert u intensiteitswaarden in voor het gewenste experimentele overzicht. Voer bijvoorbeeld 8 verschillende lichtintensiteiten (of pulsduur of duty cycles) in met drie technische replicaties per plaat (tabel 2). G.s. verwijst naar grijswaardeneenheden - de meetwaarden van het lichtintensiteitsniveau die worden gebruikt voor LPA-programmering in de IRIS-software.
    1. Houd bij het ontwerpen van IRIS experimentele bestanden rekening met randeffecten van aangrenzende putten op het LPA-apparaat, lichttoxiciteit door toenemende intensiteiten van blootstelling aan blauw licht en het bepalen van het gewenste type dosisrespons (bijv. Monotonisch versus niet-monotoon).
    2. Als gebruikers cellen in de LPA programmeren in oplopende / dalende volgorde van een bepaalde lichtparameter (bijvoorbeeld intensiteit), kunnen putten randeffecten van lichtoverspraak of zelfs warmte produceren die aangrenzende putten kunnen beïnvloeden. Dit kan onbedoeld de uitkomst van gemeten outputs beïnvloeden wanneer experimenten zijn voltooid. Om dit te verlichten, kunnen gebruikers een randomisatiematrix op de IRIS-software implementeren om putlocaties te versleutelen, waardoor randeffecten worden geminimaliseerd. Een voorbeeld wordt beschreven in de representatieve resultaten hieronder (figuur 4A-B).
    3. Bovendien is gebleken dat hogere intensiteiten van blauw licht de cellulaire groei en levensvatbaarheid verstoren48. Daarom is het, om de lichttoxiciteit te verminderen, belangrijk om een lichtintensiteit, pulsduur of duty cycle response curve te produceren, afhankelijk van de modaliteit die wordt onderzocht.
      1. Programmeer bijvoorbeeld 8 lichtintensiteitswaarden met drie replicaties per 24-well plaat, met een bereik van geen licht tot een maximale intensiteit van de LPA. Voer deze monsters vervolgens uit op een flowcytometer met een SSC-FSC-poort of een levende vlek zoals propidiumjodide om de overleving van de populatiecel (levende cellen in vergelijking met totale gebeurtenissen inclusief dode cellen / cellulair puin) bij elke lichtwaarde te kwantificeren.
      2. Bepaal vervolgens de ideale hoeveelheid populatieoverleving voor de experimentele opstelling, omdat elke stimulus de proliferatie, genexpressie of overleving nadelig kan beïnvloeden (bijvoorbeeld het instellen van 80% celoverleving als een geschikte afweging). Bijvoorbeeld, in dit werk, eenmaal gekalibreerd, was de intensiteit niet hoger dan 3000 g.s. eenheden (~ 3/4 de maximale intensiteit van het LPA-apparaat). Een voorbeeld hiervan wordt beschreven in de representatieve resultaten hieronder.
    4. Naast het beperken van lichtwaarden vanwege toxiciteit, kunnen gebruikers lichtwaarden beperken om een bepaald deel van de dosis-respons te karakteriseren, zoals het bereik van de monotone respons.
      1. Om dit te bereiken, scant u in eerste instantie een breed scala aan lichtintensiteiten, pulsduur of duty cycles, afhankelijk van de modaliteit die wordt geanalyseerd bij het bepalen van de gewenste dosis-respons (tabel 2) om het lichtregime van belang te beperken, bijvoorbeeld waar genexpressie positief correleert met toenemende lichtwaarden voor een monotone dosis-respons.
      2. Om het lichtbereik van belang te bepalen, programmeert u een enkele LPA met maximaal 24 putten van verschillende intensiteit / pulsduur / duty cycle / etc. of meer putten (bijv. 48, 72, 96, enz.), Afhankelijk van of meerdere LPA's zijn gekalibreerd om gelijkwaardige lichthoeveelheden te leveren en doorgaan met het celkweekwerk of de hieronder beschreven testen. Begin daarom met de karakterisering van een optogenetisch systeem met een breed dosisbereik van lichtstimuli om het bereikinterval te bepalen dat de gewenste genexpressie geeft en voer vervolgens experimenten uit in dat verfijnde dosisbereik.
      3. In dit werk werd bijvoorbeeld ooit 3000 g.s. eenheden bepaald als de drempel voor toxische lichtintensiteit; deze drempel werd gebruikt als de bovengrens van licht voor de hieronder beschreven testen (bijv. immunofluorescentie).
        OPMERKING: De bovenstaande stappen zijn onafhankelijk van de optische kalibratie van de LPA en verwijzen naar een kalibratie op moleculair niveau voor elk optogenetisch systeem.
  6. Zodra de juiste lichtintensiteitswaarden in IRIS zijn geprogrammeerd, plaatst u een geheugenkaart met het USB 3.0-stopcontact in de LPA om de bestanden te downloaden en over te dragen.
  7. Als de kalibratie van de LPA is voltooid31, ga dan verder met celkweekwerk voor het starten van een lichtinductietest. Als de kalibratie niet is uitgevoerd, kalibreert u de LPA met behulp van een beeldanalysemethode (stappen 3.7.1-3.7.3) zodra de LPA is geprogrammeerd met de microcontrollerprogrammeur.
    1. Programmeer de LPA kort om hetzelfde IRIS-niveau te hebben als beschreven door Gerhardt et al. (2016)31.
      OPMERKING: Voor kalibratie is de LPA geprogrammeerd om een waarde van 2000 g.s te hebben.
    2. Zodra het apparaat is geprogrammeerd met de geheugenkaart en de resetknop (fysieke knop op de LPA) is ingedrukt, krijgt u een afbeelding van het hele apparaat (bijv. gel station imager, scannerapparaat, enz.). Voor de kalibratie maakt u twee beelden met het apparaat 180° gedraaid.
    3. Gebruik vervolgens open-source software ontworpen door Gerhardt et al. (2016)31 om de variabiliteit in LED-intensiteit op de LPA-plaat te tonen en de LED-compensatiewaarden te berekenen om de intensiteit gelijk te maken over putten. Een voorbeeld hiervan wordt beschreven in de onderstaande resultaten (figuur 3). Zodra deze kalibratie is voltooid, gaat u verder met celkweekwerk voor het starten van een lichtinductietest.
  8. Verkrijg kolven van gemanipuleerde monoklonale cellen uit de vorige sectie om lichtinductie-effecten op genexpressie te onderzoeken.
  9. Verwijder de oude media uit de kolf.
  10. Voeg 1 ml trypsine toe aan de cellen en incubeer gedurende 5 minuten.
  11. Neutraliseer na 5 minuten trypsine door toevoeging van 4 ml Dulbecco-gemodificeerd Eagle's medium (DMEM of andere gewenste media) aangevuld met de nodige chemicaliën (dit werk gebruikte 50 μg / ml hygromycine, 1% penicilline / streptomycine-oplossing, 10% foetaal runderserum, FBS).
  12. Voeg ~75.000 cellen per put toe in een zwarte plaat met 24 putten in een totaal volume van 500 μL. Het aantal gezaaide cellen kan variëren afhankelijk van de duur van het gewenste experiment en het gebruikte celtype.
    OPMERKING: Houd er bovendien rekening mee dat de celzaaidichtheid van invloed is op het cultuuronderhoud en mogelijk de duur van het experiment. Beginnen bij een lager aantal cellen per put zorgt voor een langere tijdsduur voordat de kweek samenvloeiing bereikt. Bovendien zal het type optogenetische componenten dat in de interessante gencircuits is geïntegreerd, van invloed zijn op wanneer genexpressie een stabiele toestand bereikt en daarom de duur van de experimenten beïnvloeden. Andere factoren die kunnen worden overwogen zijn cellijnspecifieke groeisnelheden, mediasamenstelling en voorwaardelijke groei-effecten (d.w.z. licht).
  13. Plaats de cellen na het platen in een bevochtigde incubator met 5% CO2 om ze 2-6 uur te laten bezinken.
  14. Breng na de incubatie de cellen over naar een weefselkweekkap, verwijder het plastic deksel en voeg een kleeffoliestrip toe aan de bovenkant van de plaat (figuur 2D). Deze stap maakt minimale lichtoverdracht tussen putten mogelijk, omdat de bovenkant en de zijkanten van de putten zijn gecoat en het licht nu alleen kan binnenkomen vanaf de onderkant van de put waar de LED is geplaatst.
  15. Plaats de plaat in de gemonteerde 3D-delen van de LPA. Bedek vervolgens de plaat met het 3D-geprinte LPA-deksel, dat over de apparaatschroeven op elke hoek past.
  16. Sluit het apparaat aan op de voedingsbron en druk op de resetknop op het LPA-apparaat om ervoor te zorgen dat de bijgewerkte LPA-experimentinstellingen worden toegepast.
  17. Incubeer de cellen in het experimentele systeem gedurende een geschikte hoeveelheid tijd, afhankelijk van de oorspronkelijke zaaidichtheid, cellijnspecifieke groeisnelheid en groeiomstandigheden. In dit voorbeeld werden de cellijnen gedurende 3 dagen continu geïnduceerd om genexpressie een steady state te laten bereiken. Er moet echter worden opgemerkt dat veel optogenetische systemen (bijv. VVD) veel eerder steady-state genexpressie kunnen bereiken (bijv. 24 uur), en daarom kunnen experimentele inductietijden indien nodig worden verminderd of verlengd.
  18. Gebruik aan het einde van het lichtinductie-experiment de monsters voor een van de volgende vier testen om de gemanipuleerde cellijnen te karakteriseren (secties 4-7).

4. Fluorescentiemicroscopie van door licht geïnduceerde gemanipuleerde cellen

  1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen in de LPA uit de couveuse en plaats ze in een weefselkweekkap.
  2. Verwijder de foliestrip en laat de plaat 1-2 min zitten. Dit voorkomt condensvorming op het plastic deksel, indien direct op de plaat geplaatst.
  3. Na 1-2 minuten zitten, doe het originele plastic deksel terug op het bord.
  4. Stel de cellen in beeld met de juiste fasecontrast- of fluorescentiemicroscoop.
  5. Afhankelijk van het instrument past u de belichtingstijd, lichtbronintensiteit en versterking aan voor het weergeven van gemanipuleerde cellen. In dit experiment werden de volgende parameters toegepast: 50 ms voor FITC/GFP (groen fluorescerend eiwit) blootstellingstijd van de lichtbron en 1-5 ms voor fasecontrastblootstellingstijd bij 100% intensiteit voor elk.
    OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat optimale belichtingstijden, versterkingsniveaus en lichtbronintensiteiten vaak empirisch worden afgeleid uit de ervaring van dit werk om oververzadiging in de fluorescentieverslaggever te minimaliseren, cellulaire schade te minimaliseren en voldoende beelden vast te leggen voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. Bij het bepalen van de niveaus van elk van deze parameters, omvatten de aspecten om in gedachten te houden het maximaliseren van signaal-ruisverhoudingen, het minimaliseren van fototoxiciteit, het minimaliseren van oververzadiging van fluorescentiesignalen en het vergroten van het vermogen om zwakke fluorescentiesignalen te versterken.
    1. Optimaliseer deze parameters grof ad-hoc; eerdere experimentele waarden (bijv. lichtbronintensiteit die oververzadiging van fluorescentiereporter veroorzaakt) kunnen echter toekomstige experimentele instellingen sturen, indien van toepassing. De versterkingsinstellingen, belichtingstijden en beginwaarden van de lichtintensiteit van één circuit (LITer1.0) of experimentele opstelling (bijv. Lichtintensiteit) kunnen bijvoorbeeld als uitgangspunt worden gebruikt bij het verplaatsen naar een vergelijkbaar maar ander gencircuit (LITer2.0)11 of een andere lichtmodaliteit (bijv. Lichte duty cycle).
  6. Stroomlijn plaatbeeldvorming door een coördinaatsjabloon die in de microscopiesoftware is geprogrammeerd, waardoor de volledige plaatgrootte (bijv. 24 putten) geautomatiseerde beeldacquisitie van meerdere beeldlocaties per put kan hebben.

5. Flowcytometrie van lichtgeïnduceerde gemanipuleerde cellen

  1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
  2. Als u rechtstreeks uit de LPA wordt verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat een minuut of twee zitten.
  3. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
  4. Voeg 100 μL van 0,25% trypsine toe aan elk putje, bedek de plaat met een plastic deksel en plaats deze terug in de incubator.
  5. Laat de cellen 5 min ongestoord in de couveuse.
  6. Verwijder na 5 minuten de plaat en breng deze terug naar de weefselkweekkap.
  7. Neutraliseer elke trypsine goed met 400 μL DMEM.
  8. Label een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem met celzeef (of geschikte flowcytometriebuis die kan worden gefilterd om grote klonten cellen te verwijderen die niet volledig trypsine zijn) met een naam die overeenkomt met elke put.
  9. Gebruik een P1000-pipet om de inhoud van elke put 6-8 keer op en neer te pipetten om celklonten te breken en eencellige monsters te maken voor flowcytometrie49.
  10. Breng de volledige inhoud van elke put (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen met de zeef.
  11. Breng cellen naar het juiste flowcytometrie-instrument met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
    OPMERKING: De flowcytometer die in dit werk werd gebruikt, maakte deel uit van een kernfaciliteit in het universitair ziekenhuis.
  12. Maak een voorwaartse en zijwaartse scatterpoort (respectievelijk FSC en SSC) om de afzonderlijke cellen van de juiste grootte en granulariteit vast te leggen om puin en cellulaire klonten op de flowcytometriesoftware uit te sluiten.
  13. Zodra de poort is ingesteld, vangt u ongeveer 10.000 cellen met de juiste poort. Pas dit aantal aan afhankelijk van de hoeveelheid mobiele data die de gebruikers zoeken. Herhaal dit voor elke buis die de cellen uit het experiment bevat.
  14. Zodra het experiment is voltooid, importeert u de gegevens naar de beschikbare flowcytometriegegevenssoftware voor analyse.
  15. Maak een FSC-SSC-poort (zoals eerder tijdens de acquisitie) en pas deze toe op elke batch experimentele gegevens. Een referentieput van de niet-geïnduceerde celpopulatie wordt gebruikt voor het maken van deze poort in dit manuscript, maar er bestaan andere metrieken voor poortcreatie, zoals op dichtheid gebaseerde poorten.
  16. Met de experimentele omstandigheden omheind met een FSC-SSC-poort, plot de flowcytometriegegevens als histogrammen of vertegenwoordig op andere manieren om de verkregen expressiepatronen te illustreren. In dit experiment werd de fluorescentie vastgelegd door de GFP / FITC- of PE / TexasRed-kanalen.

6. RNA-extractie en kwantitatieve PCR van gencircuitcomponenten

  1. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
  2. Indien rechtstreeks uit de LPA verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat een minuut of twee zitten.
  3. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
  4. Ga verder met het extraheren van RNA uit de cellen met behulp van de juiste RNA-extractiekit.
  5. Zodra de RNA-extractie is voltooid, voert u een omgekeerde transcriptiereactie van elk monster uit (tabel 3).
  6. Voer verder kwantitatieve PCR uit van elk monster (tabel 4). Gebruik een DNA-polymerase en het bijbehorende protocol om PCR-reacties in te stellen. Stel voor deze stap een gemultiplexte reactie in met een huishoudgen en een interessant gen, of creëer afzonderlijke reacties. In dit voorbeeld werden GFP-, KRAS- en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) -niveaus onderzocht. Na het voltooien van het qRT-PCR-experiment, gaat u verder met de analyse via beschikbare software om de verandering van gencircuitplooien op RNA-niveau te illustreren.

7. Immunofluorescentie van gencircuitcomponenten

  1. Gebruik een ijsbad of vriezer om methanol af te koelen.
  2. Verwijder 24-72 uur na inductie de cellen uit de LPA in de couveuse of uit de microscoop na beeldvorming en plaats ze in de weefselkweekkap.
  3. Indien rechtstreeks uit de LPA verwijderd, verwijdert u de foliestrip en laat u de plaat 1-2 minuten zitten.
  4. Zuig de media uit elke put (van de hele 24-putplaat als alle putten worden gebruikt).
  5. Voeg 100 μL van 0,25% trypsine toe aan elk putje, bedek de plaat met een plastic deksel en plaats deze terug in de incubator.
  6. Laat de cellen 5 min ongestoord in de couveuse.
  7. Verwijder na 5 minuten de plaat en breng deze terug naar de weefselkweekkap.
  8. Neutraliseer elke trypsine goed met 400 μL DMEM.
  9. Label mini-centrifugebuizen met namen die overeenkomen met elke put.
  10. Gebruik een P1000-pipet en pipetteer de inhoud van elk putje 6-8 keer op en neer om de celklonten te breken.
  11. Breng de volledige inhoud van elke put (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen.
  12. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
  13. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
  14. Resuspend de cellen (gebruik een P1000-pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken) in 750-1000 μL 4% paraformaldehyde (verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing, PBS).
  15. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur zitten.
  16. Voeg na de incubatie 750-1000 μL PBS toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
  17. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
  18. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
  19. Resuspend de cellen (gebruik een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken) in 750-1000 μL ijskoude methanol.
  20. Laat de cellen 30 minuten op ijs of in een vriezer van -20 °C zitten.
  21. Voeg na de incubatie 750-1000 μL PBS toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
  22. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
  23. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
  24. Afhankelijk van het type antilichamen dat wordt gebruikt, wijzigt u het protocol vanaf dit punt. Volg de stappen 7.24.1-7.24.14 of 7.24.15-7.24.22.
    1. Als u een primair en secundair antilichaam gebruikt, resuspendeert u de cellen met een P1000/P200-pipet en pipet 6-8 keer in elke buis op en neer om celklonten in 100 μL primair antilichaam te breken. In dit geval werd een verdunning van 1:800 voor stockantistoffen gemaakt, waaronder KRAS-antilichaam of ERK-antilichaam, en mocht deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten. Antilichamen werden verdund in een incubatiebuffer gemaakt van 1x PBS met 0,5 g BSA.
      OPMERKING: Bepaal de exacte verdunning van het antilichaam empirisch door een standaardcurve van antilichaamverdunningen versus het antigeen van belang te maken.
    2. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op gelabelde antilichamen te voorkomen.
    3. Voeg na incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    5. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
    6. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 / P200 pipet en pipet op en neer 6-8 keer in elke buis om celklonten in 100 μL secundair antilichaam te breken. In dit geval werden cellen geresuspendeerd in 100 μL secundair antilichaam bij een verdunning van 1:800 voor KRAS-antilichaam of 1:2000 voor ERK-antilichaam en 30 minuten bij kamertemperatuur laten zitten. Verdun, net als bij primaire antilichamen, de secundaire antilichamen in de incubatiebuffer zoals hierboven beschreven. Bepaal de verdunningen van de secundaire antilichamen op basis van de empirische bevindingen van een standaardcurve.
    7. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op de gelabelde antilichamen te voorkomen.
    8. Voeg na de incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    9. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    10. Als u klaar bent, gooit u het bovennatuurdier weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.
    11. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten in 500 μL PBS te breken.
    12. Breng de volledige inhoud van elke buis (~ 500 μL) over naar de gelabelde buizen met zeven.
    13. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
      OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat het hebben van verschillende controles belangrijk is voor de voortgang met flowcytometriemeting en analyse van gemanipuleerde celgenexpressie. Het hebben van volledig onbevlekte cellen, cellen gekleurd met primair antilichaam alleen en cellen gekleurd met secundair antilichaam alleen kan nuttig zijn voor het vergelijken van resultaten met achtergrondsignalen van antilichamen.
    14. Ga vervolgens verder met de analyse zoals beschreven in sectie 5.
    15. Als u alleen een primair antilichaam gebruikt, resuspendeert u de cellen met behulp van een P1000 / P200-pipet en pipetteer 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten te breken in 100 μL gelabeld primair antilichaam. Bepaal de juiste antilichaamverdunning en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bepaal empirisch de antilichaamverdunning uit de standaardcurve.
    16. Na het toevoegen van antilichamen, bedek de buisjes met een folie om lichteffecten op gelabelde antilichamen te voorkomen.
    17. Voeg na incubatie 750-1000 μL van de incubatiebuffer toe. Pipetteer meerdere keren op en neer.
    18. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
    19. Resuspend de cellen met behulp van een P1000 pipet en pipet 6-8 keer op en neer in elke buis om celklonten in 500 μL PBS te breken.
    20. Breng de volledige inhoud van elke buis (~ 500 μL) over naar gelabelde buizen met zeven.
    21. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten (kan buizen met cellen op of van ijs brengen).
      OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat het hebben van verschillende controles belangrijk is voor de voortgang met flowcytometriemeting en analyse van gemanipuleerde celgenexpressie. Het hebben van volledig onbevlekte cellen en cellen gekleurd met primair antilichaam alleen zijn nuttig voor het vergelijken van resultaten met achtergrondsignalen van antilichamen.
    22. Ga vanaf dit punt verder met de analyse zoals beschreven in rubriek 5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gencircuitassemblage en stabiele cellijngeneratie in dit artikel waren gebaseerd op commerciële, gemodificeerde HEK-293-cellen die een transcriptioneel actieve, enkele stabiele FRT-site bevatten (figuur 1). De gencircuits werden geconstrueerd in vectoren met FRT-locaties in het plasmide, waardoor de Flp-FRT-integratie in het HEK-293-celgenoom mogelijk was. Deze aanpak is niet beperkt tot Flp-In-cellen, omdat FRT-sites overal in het genoom aan elke gewenste cellijn kunnen worden toegevoegd me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lezers van dit artikel kunnen inzicht krijgen in de stappen die van vitaal belang zijn voor het karakteriseren van optogenetische gencircuits (evenals andere genexpressiesystemen), waaronder 1) ontwerp, constructie en validatie van gencircuits; 2) celtechnologie voor het introduceren van gencircuits in stabiele cellijnen (bijv. Flp-FRT-recombinatie); 3) inductie van de gemanipuleerde cellen met een op licht gebaseerd platform zoals de LPA; 4) initiële karakterisering van lichtinductietests via fluorescentiemicroscopie; e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen balázsi lab bedanken voor opmerkingen en suggesties, Dr. Karl P. Gerhardt en Dr. Jeffrey J. Tabor voor het helpen bouwen van de eerste LPA, en Dr. Wilfried Weber voor het delen van de LOV2-degron plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R35 GM122561 en T32 GM008444]; Het Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; en een National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Financiering voor open access-kosten: NIH [R35 GM122561].

Bijdragen van de auteur: M.T.G. en G.B. bedachten het project. M.T.G., D.C., en L.G., voerden de experimenten uit. M.T.G., D.C., L.G., en G.B. analyseerden de gegevens en bereidden het manuscript voor. G.B. en M.T.G. begeleidden het project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR tubesEppendorf951010006reagens voor het uitvoeren van PCR
0.25% Trypsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIreagens voor het splitsen en oogsten van zoogdiercellen
0.5-10 µL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000020gereedschap voor het pipetten van reacties
100-1000 µL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039gereedschap voor het pipetten van reacties
20-200 µL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000055gereedschap voor het pipetten van reacties
2-20 µL Adjustable Volume PipetteEppendorf3123000039gereedschap voor het pipetten van reacties
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer CapCorning352235reagens voor flowcytometrie
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 VEppendorf22628113apparatuur voor zoogdierkweekwerk
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagens voor gelelektroforese
Aluminum Foils for 96-well PlatesVWR®60941-126gereedschap voor het bedekken van platen in lichtinductie-experimenten
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Greagens voor het selecteren van bacteriën met het juiste plasmide
Analog vortex mixerThermo Fisher Scientific02215365PRgereedschap voor het uitvoeren van PCR-, transformatie- of gelextractiereacties
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010reagens voor het kweken van bacteriën
BD LSRAriaBD656700gereedschap voor het sorteren van gemanipuleerde cellijnen in monoclonale populaties
BD LSRFortessaBD649225gereedschap voor het karakteriseren van gemanipuleerde cellijnen
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagens voor IF-incubatiebuffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TCCorning353043plaat gebruikt voor het kweken van monoclonale cellen
CentrifugeVWR22628113instrument voor zoogdiercelkweek
Chemical fume hoodN/AN/Ainstrument voor het uitvoeren van IF-reacties
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lidBD353047plaat gebruikt voor het kweken van monoclonale cellen
CytoOne T25 filter cap TC flaskUSA ScientificCC7682-4825container voor het kweken van zoogdiercellen
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reagens gebruikt voor het invriezen van gemanipuleerde zoogdiercellen
Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15-585-011reagens voor gelelektroforese
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with LidCorning353072container voor het kweken van gesorteerd monoclonale cellen
FCS ExpressDe Novo Software:N/Asoftware voor het karakteriseren van flowcytometrie-gegevens
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mLCorning35-010-CVreagens voor het kweken van zoogdiercellen
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712apparatuur voor het kweken van bacteriën
Gibco DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092reagens voor het kweken van zoogdiercellen
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010reagens voor het selecteren van cellen met de juiste gencircuitintegratie
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagens voor het omzetten van RNA naar cDNA
Laboratory Freezer -20 °CVWR76210-392apparatuur voor het opslaan van experimentele reagentia
Laboratory Freezer -80 °CPanasonicMDF-U74VCapparatuur voor het opslaan van experimentele reagentia
Laboratory Refrigerator +4 °CVWR76359-220apparatuur voor het opslaan van experimentele reagentia
LB Broth (Lennox), 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greagens voor het kweken van bacteriën
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt voor het transfecteren van gencircuits in zoogdiercellen
MATLAB 2019MathWorksN/Asoftware voor het analyseren van experimentele gegevens
MethanolAcros Organics413775000reagens voor immunofluorescence reactie
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mLVWR20170-333plastic container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCapparatuur voor bacteriële transformatie
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANapparatuur voor DNA/RNA concentratiemeting
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master MixNEBM0492Sreagens voor PCR van gencircuitfragmenten
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)C3019Hbacteriecellen voor het amplificeren van gencircuit van belang
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagens voor het combineren van gencircuitfragmenten
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 cameraNikon Instruments

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetic Gene CircuitsMammalian CellsGene Expression ControlLight Inducible ExpressionStable Cell LinesFlow CytometryFluorescence MicroscopyNegative Feedback CircuitGene Expression NoiseProtein Expression Quantification

Gerelateerde artikelen