Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

Samenvatting

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Samenvatting

Deze nieuwe op fluorescentie gebaseerde test op basis van totale interne reflectie vergemakkelijkt de gelijktijdige meting van de lengte van de katalytische cyclus voor honderden individuele restrictie-endonuclease (REase) -moleculen in één experiment. Deze test vereist geen eiwitetikettering en kan worden uitgevoerd met een enkel beeldvormingskanaal. Bovendien kunnen de resultaten van meerdere individuele experimenten worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren. Analyse van de resulterende verblijftijdverdelingen kan helpen het DNA-splitsingsmechanisme op te helderen door de aanwezigheid van kinetische stappen te onthullen die niet direct kunnen worden waargenomen. Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze test met het goed bestudeerde REase, EcoRV - een dimeer Type IIP-restrictie-endonuclease dat de palindroomsequentie GAT↓ATC splitst (waarbij ↓ de snijplaats is) - komen overeen met eerdere studies. Deze resultaten suggereren dat er ten minste drie stappen zijn in de weg naar DNA-splitsing die wordt geïnitieerd door magnesium te introduceren nadat EcoRV DNA bindt in zijn afwezigheid, met een gemiddelde snelheid van 0,17 ^s-1 voor elke stap.

Inleiding

Restrictie-endonucleasen (REases) zijn enzymen die sequentiespecifieke dubbelstrengsbreuken in DNA veroorzaken. De ontdekking van REases in de jaren 1970 leidde tot de ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie, en deze enzymen zijn nu onmisbare laboratoriuminstrumenten voor genetische modificatie en manipulatie. Type II REases zijn de meest gebruikte enzymen in deze klasse, omdat ze DNA op een vaste locatie splitsen, hetzij binnen of in de buurt van hun herkenningssequentie. Er is echter veel variatie tussen de Type II REases, en ze zijn onderverdeeld in verschillende subtypen op basis van bepaalde enzymatische eigenschappen in plaats van te worden geclassificeerd op basis van hun evolutionaire relaties. Onder elk subtype zijn er frequente uitzonderingen op het classificatieschema en veel enzymen behoren tot meerdere subtypen². Er zijn duizenden Type II-REases geïdentificeerd en honderden daarvan zijn in de handel verkrijgbaar.

Ondanks de diversiteit onder de Type II REases zijn er echter maar heel weinig REases in detail bestudeerd. Volgens REBASE, de restrictie-enzymendatabase die in 1975 door Sir Richard Roberts werd opgericht³, zijn gepubliceerde kinetische gegevens beschikbaar voor minder dan 20 van deze enzymen. Bovendien, hoewel sommige REases direct zijn waargenomen op het niveau van één molecuul terwijl ze langs het DNA diffundeerden voordat ze hun herkenningssequentie 4,5,6,7 tegenkwamen en eraan bonden, zijn er zeer weinig studies met één molecuul naar hun kinetiek van de splitsingsreactie. De bestaande studies rapporteren ofwel geen adequate statistieken om een gedetailleerde analyse uit te voeren van de variatie in de tijdstippen waarop enkelvoudige splitsingen plaatsvinden ^8,9,10 of zijn niet in staat om de volledige verdeling van splijtingstijden¹¹ vast te leggen. Dit type analyse kan de aanwezigheid van relatief langlevende kinetische tussenproducten aan het licht brengen en kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen van REase-gemedieerde DNA-splitsing.

Op het niveau van één molecuul zijn biochemische processen stochastisch - de wachttijd voor een enkel exemplaar van het proces, τ, is variabel. Van veel metingen van τ kan echter worden verwacht dat ze gehoorzamen aan een kansverdeling, p(τ), die een indicatie geeft van het soort proces dat plaatsvindt. Bijvoorbeeld, een proces in één stap, zoals de afgifte van een productmolecuul uit een enzym, zal gehoorzamen aan de Poisson-statistieken, en p(τ) zal de vorm aannemen van een negatieve exponentiële verdeling:

waarbij β de gemiddelde wachttijd is. Merk op dat de snelheid van het proces, k, gelijk zal zijn aan 1/β, het omgekeerde van de gemiddelde wachttijd. Voor processen die meer dan één stap vereisen, zal p(τ) de convolutie zijn van de enkelvoudige exponentiële verdelingen voor elk van de afzonderlijke stappen. Een algemene oplossing voor de convolutie van N enkelvoudige exponentiële vervalfuncties met identieke gemiddelde wachttijden, β, is de gamma-kansverdeling:

waarin Γ(N) de gammafunctie is, die de interpolatie van de faculteit van N-1 naar niet-gehele waarden van N beschrijft. Hoewel deze algemene oplossing bij benadering kan worden gebruikt wanneer de gemiddelde wachttijden van individuele stappen vergelijkbaar zijn, moet worden begrepen dat de aanwezigheid van relatief snelle stappen zal worden gemaskeerd door stappen met aanzienlijk langere wachttijden. Met andere woorden, de waarde van N vertegenwoordigt een ondergrens voor het aantal stappen¹². Met een adequaat aantal wachttijdmetingen kunnen de parameters β en N worden geschat door de gebeurtenissen samen te voegen en de gammaverdeling aan te passen aan het resulterende histogram of door gebruik te maken van een benadering op basis van maximale waarschijnlijkheid. Dit type analyse kan daarom de aanwezigheid van kinetische stappen aan het licht brengen die niet gemakkelijk kunnen worden opgelost in ensemble-assays en vereist een groot aantal observaties om parameters nauwkeurig te schatten^12,13.

Dit artikel beschrijft een methode om quantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie te gebruiken om honderden individuele REase-gemedieerde DNA-splitsingsgebeurtenissen parallel te observeren. Het ontwerp van de test maakt het mogelijk om de resultaten van verschillende experimenten samen te voegen en kan dwell-time-verdelingen maken die duizenden gebeurtenissen bevatten. De hoge fotostabiliteit en helderheid van kwantumdots maken een tijdresolutie van 10 Hz mogelijk zonder dat dit ten koste gaat van het vermogen om splitsingen waar te nemen die zelfs vele minuten na het begin van het experiment plaatsvinden. Goede temporele resolutie en een breed dynamisch bereik, gecombineerd met de mogelijkheid om een grote dataset te verzamelen, maken een nauwkeurige karakterisering van de verblijftijdverdelingen mogelijk om de aanwezigheid van meerdere kinetische stappen in de splitsingspaden van REases aan het licht te brengen, die omloopsnelheden hebben in het bereik van 1 ^min-1 . In het geval van EcoRV kunnen drie kinetische stappen worden opgelost, die allemaal op een andere manier zijn geïdentificeerd, wat bevestigt dat de test gevoelig is voor de aanwezigheid van dergelijke stappen.

Duplex-DNA-substraten die de herkenningssequentie van belang bevatten, worden geproduceerd door een gebiotinyleerd oligonucleotide te gloeien aan een complementaire streng die is gelabeld met een enkele, covalent gehechte halfgeleider nanokristal kwantumpunt. Deze substraten worden ingebracht in een stroomkanaal dat is gebouwd op een glazen dekglaasje met een gazon van polyethyleenglycol (PEG)-moleculen met een hoog moleculair gewicht die covalent aan het oppervlak zijn bevestigd. De DNA-substraten worden gevangen via een biotine-streptavidine-biotine-binding door een fractie van de PEG-moleculen die een biotine aan hun vrije uiteinde hebben. In TIRF-microscopie zorgt een vluchtige golf die exponentieel vervalt met de afstand tot de glas-vloeistofinterface voor verlichting; De penetratiediepte is in de orde van grootte van de golflengte van het gebruikte licht. Onder deze omstandigheden zullen alleen kwantumdots die aan het oppervlak zijn vastgemaakt door een DNA-molecuul dat op het gefunctionaliseerde glazen oppervlak is vastgelegd, worden opgewonden. Quantum dots die vrij in oplossing zijn, worden niet beperkt binnen het verlichte gebied en zullen daarom niet oplichten. Als het DNA dat een kwantumdot aan het oppervlak bindt, wordt gesplitst, zal die kwantumdot vrij zijn om weg te diffunderen van het oppervlak en zal het uit het fluorescentiebeeld verdwijnen.

Hoewel van veel Type II REases bekend is dat ze DNA binden in afwezigheid van magnesium¹⁴, hebben ze allemaal magnesium nodig om DNA-splitsing te mediëren¹⁵. Deze REases kunnen het aan het oppervlak geïmmobiliseerde DNA binden in afwezigheid van magnesium. Wanneer magnesiumhoudende buffer door een kanaal wordt gestroomd met REase vooraf gebonden aan het DNA, begint de splitsing onmiddellijk, zoals aangegeven door het verdwijnen van kwantumdots. De synchronisatie die wordt bereikt door de REase-moleculen voor te binden en vervolgens de DNA-splitsing te initiëren door magnesium te introduceren, vergemakkelijkt het meten van de vertragingstijd tot de voltooiing van de DNA-splitsing onafhankelijk voor elk molecuul in de populatie enzymen die in een experiment zijn waargenomen. Fluoresceïne wordt als tracerkleurstof opgenomen in de magnesiumhoudende buffer om de aankomst van magnesium in het gezichtsveld aan te geven. Aangezien er geen enzym is opgenomen in de magnesiumhoudende buffer, geeft de vertragingstijd vanaf de aankomst van de magnesiumhoudende buffer tot het verdwijnen van elke kwantumpunt de tijd aan die nodig is voor een REase die al aan het DNA is gebonden om het DNA te splitsen en de kwantumpunt van het glasoppervlak los te laten. Het verdwijnen van de kwantumdot gebeurt snel en resulteert in een scherpe afname van het intensiteitstraject, wat een duidelijke indicatie geeft van het tijdstip waarop een bepaald DNA-molecuul wordt gesplitst. De bepaling van gebeurtenistijden wordt bereikt door wiskundige analyse van intensiteitstrajecten, en een typisch experiment resulteert in honderden identificeerbare splitsingsgebeurtenissen. De resultaten van meerdere experimenten kunnen worden samengevoegd om adequate statistieken te verschaffen om een schatting van de parameters, N en β, mogelijk te maken door middel van niet-lineaire kleinste kwadraten of maximale waarschijnlijkheidsanalyse.

Protocol

1. Algemene informatie

1. Oligonucleotide ontwerp
   OPMERKING: Het 60 basenparen (bp) lange DNA-substraat wordt gevormd uit een paar complementaire oligonucleotiden met een duplexsmelttemperatuur van 75 °C in 100 mM NaCl.
   1. Bestel een oligonucleotide gesynthetiseerd met een enkele 5' biotinemodificatie en de andere met een 5'-thiolmodificatie (met een spacer met zes koolstofatomen). Plaats de herkenningsplaats in het midden van het duplexgebied.
      OPMERKING: De oligonucleotidesequenties voor gebruik met EcoRV worden hieronder weergegeven (herkenningsplaats vetgedrukt).
      5' biotine - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AACGG G ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG CCG - 3'
      5' thiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Gebruik ultrapuur water met een weerstand van 18 MOhm voor alle stappen.
3. Bescherm alle oplossingen die kwantumdots bevatten tegen licht om fotobleken te voorkomen.
4. Gebruik een persluchtbron om dit protocol te voltooien.

2. Bereiding van kwantum-dot-gelabelde DNA-substraatmaterialen

OPMERKING: Naast de hierboven beschreven oligonucleotiden, zie de Tabel van Materialen voor andere materialen en Tabel 1 voor buffers die nodig zijn voor de bereiding van kwantum-dot-gelabelde DNA-substraten.

1. Verminder 5' thiolgroepen op het oligonucleotide om te worden gekoppeld aan kwantumdots.
   1. Resuspendeer elk gethioleerd oligonucleotide in water met een concentratie van 100 μM.
   2. Pipetteer 650 μL water in een grootte-uitsluiting spinkolom voor elk oligonucleotidemonster en vortex gedurende ~15 s. Laat de kolom 30 minuten inpakken.
   3. Bereid onmiddellijk voor elk gebruik een verse 100 mM dithiothreitol (DTT)-oplossing, aangezien DTT snel in de oplossing wordt afgebroken. Open voorzichtig één injectieflacon met 7,7 mg DTT en spuit 500 μl natriumfosfaatbuffer in de injectieflacon; draaikolk om grondig te mengen.
   4. Bereid voor elke geresuspendeerde oligonucleotide een verse buis voor en voeg 50 μl van de oligonucleotide en 50 μl DTT-oplossing toe aan de buis. Pipet op en neer om te mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de disulfidebindingen tussen de geoxideerde thiolgroepen aan het 5'-uiteinde van de oligonucleotiden te verminderen.
   5. Verwijder de doppen van de spinkolom en plaats elke kolom in de opvangbuis. Centrifugeer de centrifugeerkolommen bij 750 × g gedurende 2 minuten en gooi het eluaat weg.
   6. Breng de spinkolommen over in verse centrifugebuisjes. Pipetteer het volledige volume (100 μl) van één DNA/DTT-monster voorzichtig op elke voorbereide kolom. Centrifugeer bij 750 × g gedurende 2 minuten en meet de extinctie van het eluaat bij 260 nm om te bevestigen dat de concentratie ongeveer 40 μM is.
   7. Bewaar monsters die niet onmiddellijk worden gebruikt bij -20 °C om oxidatie van de thiolgroepen en de vorming van disulfidebindingen te voorkomen.
2. Koppeling van DNA aan quantum dots
   1. Pipetteer een aliquot van 50 μl van de kwantumdotvoorraad in een dialyseapparaat voor elke constructie die moet worden gemaakt, en zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt met de pipetpunt. Dialyze tegen een volume N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (CHES) buffer dat ten minste 1000x het monstervolume is met roeren op ~100 tpm gedurende 15 minuten.
   2. Bereid onmiddellijk voor elk gebruik een verse 6 mM-oplossing van sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) in CHES-buffer. Open voorzichtig een injectieflacon met 2 mg sulfo-SMCC en spuit 800 μl CHES-buffer in de injectieflacon. Vortex om grondig te mengen.
   3. Haal met behulp van een pipettor voorzichtig de zwevende kwantumdots uit het dialyseapparaat en breng ze over in een verse buis met een gelijk volume van de sulfo-SMCC-oplossing; Pipet op en neer om te mengen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 1000 tpm om de sulfo-SMCC te laten reageren met de primaire aminen op de kwantumdots.
   4. Breng met behulp van een pipettor elk monster voorzichtig over in een nieuw dialyseapparaat. Om overtollig sulfo-SMCC te verwijderen, dialyseert u gedurende 15 minuten tegen een volume CHES-buffer dat ten minste 1000x het volume in het/de dialyseapparaat/de dialyseapparaten is, onder roeren. Vervang de buffer 2x en voer in totaal 3x dialyse uit met verse CHES-buffer, zodat de dialyse 15 minuten na elke bufferwisseling kan doorgaan.
   5. Om de buffer ter voorbereiding op de tweede reactie te vervangen, brengt u de dialysehulpmiddelen over in een bekerglas met een volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) dat ten minste 1000x het volume in het apparaat of de apparaten is. Dialyse met roeren gedurende 15 minuten, vervang de buffer 2x en voer in totaal 3x dialyse uit met verse PBS, zodat de dialyse na elke bufferwissel 15 minuten kan doorgaan.
   6. Gebruik een pipettor om de oplossing met de kwantumdots voorzichtig uit het (de) dialyseapparaat(en) te halen en elk monster over te brengen in een vers buisje met een equimolaire hoeveelheid gethioleerd oligonucleotide verdund in PBS. Combineer een gelijk volume PBS en een 1/^10e van het volume van het gereduceerde en gezuiverde oligonucleotidemonster (ongeveer 40 μM-concentratie), aangezien de kwantumdotconcentratie op dit punt ~4 μM is. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, met schudden bij 1000 tpm.
   7. Voeg runderserumalbumine (BSA, 10 mg/ml) toe aan elk monster om de uiteindelijke BSA-concentratie van 0,5 mg/ml te verkrijgen. Breng met behulp van een pipettor elk monster voorzichtig over in een nieuw dialyseapparaat en dialyseer tegen een opslagbuffer die ten minste 1000x het volume in het (de) dialyseapparaat(en) is. Vervang de buffer 2x en voer in totaal 3x dialyse uit met een verse opslagbuffer, zodat de dialyse na elke bufferwisseling 15 minuten kan doorgaan.
   8. Gebruik een pipettor om elk monster voorzichtig te herstellen, plaats het in een verse buis en bewaar het bij 4 °C.
      OPMERKING: Niet bewaren bij -20 °C, aangezien quantum dots worden beschadigd door bevriezing.
3. Gloeien van quantum-dot-gelabeld oligonucleotide tot gebiotinyleerd oligonucleotide
   1. Resuspendeer elk gebiotinyleerd oligonucleotide in de opslagbuffer bij een concentratie van 100 μM. Bewaar ongebruikte monsters bij -20 °C.
   2. Combineer een monster van kwantumdot-gelabeld oligonucleotide met een 10-voudige molaire overmaat aan gebiotinyleerd oligonucleotide. Aangezien de geschatte concentratie van DNA in het met kwantumdots gelabelde monster 2 μM is, voegt u 0,2 μL gebiotinyleerd oligonucleotide toe voor elke 10 μL van dit monster.
   3. Verwarm het mengsel in een warmteblok tot 75 °C (de smelttemperatuur voor het complementaire gebied). Houd 5 minuten op die temperatuur. Zet het warmteblok uit en laat langzaam afkoelen. Bewaar de voltooide constructie bij 4 °C; Niet in de vriezer bewaren.

3. Oppervlaktefunctionalisering van dekglaasjes

OPMERKING: Dit proces is eerder beschreven in andere JoVE-videoprotocollen^16,17. Dit protocol beschrijft een aangepaste versie van de procedure met kleine wijzigingen om plaats te bieden aan een kleiner glasplaatje. Zie de Tabel met materialen voor andere materialen die nodig zijn voor de oppervlaktefunctionalisering van dekglaasjes.

1. Plaats 5 dekglaasjes in elke dekglaasjeshouder. Zorg ervoor dat u tussen elk paar dekglaasjes één spatie overslaat, zodat ze niet aan elkaar plakken. Plaats de dekglaasjes in hun houder in een pot met een deksel, voeg ethanol toe aan de pot totdat de dekglaasjes bedekt zijn en schroef de dop stevig vast. Plaats de hele pot in het water in de badsonicator, zonder deze volledig onder te dompelen, en sonificeer gedurende 30 minuten.
2. Vul een schoon bekerglas of potje met ultrapuur water. Gebruik een metalen pincet om de dekglaasjes in de houder van de ethanol te verwijderen en dompel ze onder in water om af te spoelen. Breng vervolgens de dekglaasjes en de houder over in een pot met een 1 M kaliumhydroxide (KOH)-oplossing. Schroef de dop stevig vast, plaats de pot in het sonicatorbad en sonicaat gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: Wees voorzichtig bij het hanteren van de KOH-oplossing, aangezien deze bijtend en irriterend is.
3. Herhaal de sonicatie in ethanol en KOH-oplossing en spoel de dekglaasjes tussen elke stap af in water zoals hierboven beschreven.
4. Doe de dekglaasjes in hun houder in een schone pot gevuld met pure aceton. Voltooi de reiniging door de pot zoals hierboven beschreven gedurende 30 minuten te soniceren. Spoel na deze stap niet af met water.
5. Doe de dekglaasjes in de houder met een metalen pincet in een schoon bekerglas van 100 ml met 80 ml verse aceton en een roerstaaf op microschaal. Plaats het bekerglas op een magnetische roerplaat die op minimaal 1.000 tpm is ingesteld. Terwijl de aceton krachtig wordt geroerd, spuit je 1,6 ml 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in het bekerglas om een 2% v/v-oplossing te maken.
   OPMERKING: Wees voorzichtig bij het pipetteren van APTES, aangezien dit corrosief is.
6. Laat de dekglaasjes 2 minuten in de oplossing incuberen en gebruik vervolgens een metalen pincet om de dekglaasjes in de houder over te brengen in een beker water om de reactie te doven. Spoel de dekglaasjes nog twee keer af en vervang het water in het bekerglas.
7. Laat het silanized glas 75 minuten uitharden in de oven op 120 °C. Als u niet onmiddellijk doorgaat naar de volgende stap, bewaar de dekglaasjes dan maximaal een paar dagen onder vacuüm.
8. Los N-hydroxysuccinimide (NHS) ester-afgeleide polyethyleenglycolen (PEG's) op in 100 mM natriumbicarbonaat (pH 8,2). Gebruik een verhouding van 10:1 van methoxy-gebeëindigde PEG tot biotine-gebeëindigde PEG, met ~100 mg/ml methoxy-geïnterneerde PEG.
9. Pipetteer 100 μL van de PEG-oplossing op de helft van de droge gesilaniseerde dekglaasjes en bedek ze met een tweede dekglaasje. Gebruik kleine stukjes parafilm die op elke hoek zijn geplaatst als afstandhouders om te voorkomen dat de dekglaasjes aan elkaar blijven plakken.
10. Incubeer de dekglaasjes gedurende 3,5 uur in een vochtige omgeving. Scheid de beleggingen van het dekglaasje. Gebruik een spuitfles om elk dekglaasje met veel water te wassen en droog het af met perslucht.
11. Bewaar gefunctionaliseerde dekglaasjes onder vacuüm. Zorg ervoor dat u de met PEG behandelde kant naar boven houdt, omdat de andere kant het DNA-substraat niet zal opvangen.

4. Constructie van microfluïdisch apparaat

NOTITIE: Zie de materiaaltabel voor andere materialen die nodig zijn voor de constructie van het microfluïdische apparaat.

1. Boor met behulp van een draagbare roterende multitool die is uitgerust met een taps toelopende diamantpuntschijf twee gaten in tegenoverliggende hoeken van de kwartsslede om als in- en uitlaat te dienen. Zorg ervoor dat u de schuif op zijn plaats houdt, het bit smeert en tijdens het boren constant met water glijdt. Herstel na elk experiment het voorbereide kwartsglaasje voor hergebruik door een gebruikt apparaat in aceton te weken om de lijm en epoxy op te lossen; Gooi de resterende onderdelen weg.
   OPMERKING: Het boren kan met de hand worden uitgevoerd, maar het gebruik van een pershouder voor de multitool maakt het proces eenvoudiger.
2. Combineer 25 μl streptavidine-oplossing met 80 μl PBS en 20 μl blokkeerbuffer. Smeer een met PEG behandelde dekglaasje in met dit mengsel en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige omgeving.
3. Bereid tijdens de incubatie van het dekglaasje de beeldvormingsafstandhouder voor om een stroomkanaal te creëren. Snijd een vierkant stuk afstandsmateriaal van 1 inch en markeer vervolgens een kanaal van 2 mm breed dat is uitgelijnd met de uiteinden van de gaten die in het kwartsglaasje zijn geboord (Figuur 2). Snijd het kanaal met een scalpel uit het afstandsmateriaal.
4. Trek een kant van de achterkant van de afstandhouder van de afbeelding en plaats deze voorzichtig op de kwartsgeleider, zorg ervoor dat u de inlaat- en uitlaatgaten niet bedekt. Zorg ervoor dat u het kwartsglaasje grondig reinigt met aceton om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen.
5. Was het dekglaasje met water en droog het af met perslucht. Verwijder de andere kant van de achterkant van de afstandhouder en klem deze tussen het kwartsglaasje en het gefunctionaliseerde, met streptavidine beklede dekglaasje, met behulp van het plastic pincet om het geheel samen te drukken en luchtbellen van de lijm te verwijderen.
6. Steek een 30 cm lange polyethyleen slang in elk gat in het kwartsglaasje. Zorg ervoor dat u de uiteinden van de slang schuin afsnijdt om een vrije doorstroming van de oplossing te garanderen. Gebruik een buizenrek of andere ondersteuning om de buizen op hun plaats te houden en dicht de buizen op hun plaats en de randen van het gemonteerde apparaat af met epoxy.
   OPMERKING: Het werkt goed om het apparaat op een stuk parafilm te bouwen, dat gemakkelijk van de bodem kan worden afgepeld als de epoxy is uitgehard.
7. Zodra de epoxy is uitgehard, steekt u de stompe naald op de lege spuit in de uitlaatslang van het apparaat en dompelt u het uiteinde van de inlaatslang onder in een container gevuld met blokkeerbuffer. Trek de zuiger van de spuit naar achteren om het apparaat te vullen met een blokkeerbuffer. Laat het apparaat voor gebruik ten minste 30 minuten incuberen.

5. Oppervlaktebinding van kwantum-dot-gelabeld DNA-substraat

OPMERKING: Naast het microfluïdische apparaat, het DNA-substraat en de blokkeerbuffer zoals hierboven beschreven, zie de Tabel met materialen voor andere materialen en Tabel 1 voor buffers die nodig zijn voor de oppervlaktebinding van kwantum-dot-gelabelde DNA-substraten.

1. Bevestig het microfluïdische apparaat met tape aan de plaat van de microscooptafel, breng het objectief in contact met de onderkant van het apparaat en plaats het objectief zo dat het gezichtsveld zich binnen het microfluïdische kanaal bevindt.
2. Spoel het microfluïdische kanaal door met een verse blokkeerbuffer door de zuiger van de spuit terug te trekken nadat u de uitlaatslang op de spuitpomp hebt aangesloten. Controleer of er geen luchtbellen in de slang of in het kanaal vastzitten.
   NOTITIE: Zorg er vanaf dit punt voor dat de inlaatslang zich in vloeistof bevindt, zodat er geen luchtbellen in het apparaat terechtkomen.
3. Verdun 1 μL van het bereide DNA-substraat tot 1 ml blokkeerbuffer. Plaats de inlaatbuis in het verdunde DNA-substraat en laat 800 μL van de substraatoplossing door het kanaal stromen met een snelheid van 200 μL/min. Laat de DNA-oplossing ongestoord in het kanaal incuberen gedurende 15 minuten nadat de stroom is gestopt.
4. Laat ten minste 800 μL blokkeerbuffer door het kanaal stromen met een snelheid van 200 μL/min om het ongebonden DNA uit het kanaal te spoelen.
5. Pas het laservermogen, de microscoopfocus en de TIRF-hoek aan zodat de aan het oppervlak gekoppelde kwantumdots duidelijk zichtbaar zijn.
   OPMERKING: Hoewel quantum dots niet snel bleken, is het het beste om het vermogen zo laag mogelijk te houden om knipperen te minimaliseren.

6. REase-gemedieerde DNA-splitsing

OPMERKING: Zie de Tabel met materialen voor materialen en Tabel 1 voor buffers die nodig zijn voor REase-gemedieerde DNA-splitsing.

1. Zorg ervoor dat de camera is gekoeld tot de optimale bedrijfstemperatuur en is ingesteld voor high-speed streaming met een belichtingstijd van 0.10 s. Wees voorbereid om gegevens te verzamelen gedurende ~4 minuten.
2. Spoel het microfluïdische apparaat met 800 μL experimentele buffer zonder magnesium met een stroomsnelheid van 200 μL/min.
3. Voeg de REase toe aan een aliquot (1 ml) experimentele buffer zonder magnesium en meng voorzichtig door te pipetteren. Gebruik 4 μL van 100.000 eenheden/ml voorraad, wat overeenkomt met 400 eenheden/ml EcoRV. Laat 800 μL van het verdunde enzym door het kanaal stromen met een stroomsnelheid van 200 μL/min.
4. Begin het experiment door een experimentele buffer met magnesium en fluoresceïne te laten stromen met een stroomsnelheid van 200 μL/min. Begin direct na het starten van de spuitpomp met het vastleggen van gegevens. Nadat u 800 μL buffer hebt laten stromen, stopt u met gegevensverzameling.

7. Analyse van de gegevens

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de gegevensanalysesoftware die voor dit protocol wordt gebruikt en maak aanpassingen als u een ander analyseplatform gebruikt.

1. Bepaling van het nultijdstip
   1. Trek achtergrondfluorescentie af van elk frame van de experimentele film met behulp van de imtophat-functie , een ingebouwde morfologische top-hat-filterfunctie in de Image Processing Toolbox. Selecteer een schijf met een straal van drie pixels als structureringselement. Verkrijg de achtergrondintensiteit door de gefilterde afbeelding af te trekken van de originele afbeelding.
      OPMERKING: Het filter behoudt alleen afbeeldingskenmerken die helderder zijn dan de achtergrond en kleiner dan het structureringselement.
   2. Neem het gemiddelde van de afgetrokken achtergrond over elk filmframe. Gebruik een traject van deze waarde om het nulpunt voor het experiment te bepalen (Figuur 3A). Bepaal de starttijd door het eerste frame te vinden waarbij de toenamesnelheid groter is dan 3x de standaarddeviatie van de veranderingssnelheid tijdens de dode volumestroom.
      OPMERKING: Een sterke toename van de veranderingssnelheid van de gemiddelde waarde van de afgetrokken achtergrond voor elk filmframe geeft het tijdstip aan waarop de uiteindelijke experimentele buffer met de tracerkleurstof de stroomcel binnenkwam (Figuur 3B).
2. Berekening en analyse van het traject van de kwantumdotintensiteit
   1. Bereken een projectie met maximale intensiteit voor de set achtergrondgecorrigeerde filmframes die zijn opgenomen vóór de komst van de tracerkleurstof. Bepaal de locaties van kwantumdots tot op één pixel nauwkeurig in dit projectiebeeld met behulp van een piekbepalingsfunctie zoals pkfnd.
   2. Genereer intensiteitstrajecten voor individuele kwantumdots door de gemiddelde intensiteit in elk filmframe te berekenen van een vierkant gebied met drie pixels per zijde rond de locatie die wordt geretourneerd door de piekbepalingsfunctie.
      OPMERKING: De hierboven beschreven achtergrondcorrectie verwijdert de artefacten die door de tracerkleurstof zijn geïntroduceerd. De resulterende intensiteitstrajecten zouden relatief vlak moeten zijn, maar nog steeds natuurlijk voorkomende intensiteitsfluctuaties moeten omvatten (figuur 4).
   3. Identificeer kwantumdot-verdwijningsgebeurtenissen door statistische analyse van de intensiteitstrajecten. Bereken voor elk traject van de kwantumpuntintensiteit een drempelintensiteit die boven de minimumwaarde ligt met een passende fractie van het verschil tussen de maximum- en minimumwaarden voor dat traject, afhankelijk van de ruis die in de trajecten wordt waargenomen.
      OPMERKING: De intensiteitsfluctuatie voor de quantum dot is doorgaans veel groter dan de achtergrondfluctuatie. Door deze waarden te vergelijken, kan een geschikte waarde worden bepaald: de geselecteerde drempel moet hoger zijn dan de hoogste achtergrondwaarde, maar idealiter lager dan de laagste waarde voor quantum dot-fluorescentie. Voor de gepresenteerde gegevens werd de gebruikte drempel berekend om boven de minimumwaarde voor elk traject te liggen, plus een derde van het verschil tussen de maximum- en minimumwaarden voor dat traject. Een quantum dot kan worden geacht te zijn verdwenen op het laatste tijdstip dat de waargenomen intensiteit op de locatie boven deze drempel lag.
   4. Bevestig vermeende verdwijningen. Neem alleen gebeurtenissen mee in de uiteindelijke analyse als de waargenomen intensiteit boven het middelpunt ligt tussen de minimale en maximale intensiteitswaarden voor het traject gedurende meer dan de helft van de filmframes voorafgaand aan het tijdstip van verdwijning en de standaarddeviatie van het intensiteitstraject na de gebeurtenis is afgenomen.
      OPMERKING: Andere statistische tests kunnen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat alleen geldige verdwijningsgebeurtenissen worden geregistreerd.

Resultaten

De flowcel is direct gekoppeld aan een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur en een vergroting van 60x op een omgekeerde microscoop die is uitgerust met laserverlichting voor TIRF-beeldvorming door middel van objectieven (Figuur 5A). Na het introduceren van het DNA-substraat en het wegspoelen van overtollig DNA en kwantumdots, zijn er doorgaans duizenden individuele kwantumdots in een gezichtsveld (Figuur 5B). Deze kwantumdots zijn stabiel beves...

Discussie

Het DNA-substraat voor deze test is gelabeld met een kwantumdot met behulp van een tweestapsreactieschema met behulp van sulfo-SMCC. Deze bifunctionele crosslinker bestaat uit een NHS-estergroep die kan reageren met een primair amine en een maleimidegroep die kan reageren met een sulfhydrylgroep²⁰. De gethioleerde oligonucleotiden die worden gebruikt om het substraat voor te bereiden, worden in geoxideerde vorm verzonden. Het is belangrijk om ze te verkleinen en te zuiveren, zoals beschreven, voor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Bewaar in desiccator box
5 Minute Epoxy	Devcon	20845	Gebruik voor het afdichten van het microfluïdische apparaat
aceton	Pharmco	329000ACS	Gebruik voor het reinigen van dekglasjes
bath sonicator	Fisher Scientific	CPXH Model 2800	catalogusnummer 15-337-410
Beker, glas, 100 mL
Benchtop centrifuge
Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5.000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Succinimidyl valerate heeft een langere halfwaardetijd dan succinimidyl carbonaat
gebiotinyleerd oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	custom - zie protocol voor ontwerpoverwegingen	Verzoek om 5' Biotin modificatie en HPLC zuivering
Bovine Serum Albumine (BSA)	VWR	0903-5G	Bereid een 10 mg/mL oplossing (aq) en verwarm tot 95 °C voor gebruik
Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns	Princeton Separations	CS-100 of CS-101	Gebruikt voor het zuiveren van thiolerde oligonucleotiden na het reduceren van de disulfidebinding
Centrifuge tubes 1,5 mL
dekglasjes, 1 inch vierkant glas
dekglashouders
diamond point wheel	Dremel	7134	Gebruik voor het boren van gaten in quartz flow cell topper
dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7,7 mg/flesje
drill press rotary tool workstation stand	Dremel	220-01	maakt quartz boren mogelijk
EcoRV (REase gebruikt om voorbeeldgegevens te genereren)	New England Biolabs	R0195T of R0195M	Gebruik 100.000 eenheden/mL stockoplossing om overtollig glycerol toe te voegen Check REBASE voor leveranciers van andere REases
ethanol	diverse	CAS 64-17-5	gedenatureerd of 95% zijn acceptabel, gebruik voor het reinigen van dekglasjes
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, watervrij, bewaar in desiccator box
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	3 mm x 10 mm grootte om onder het dekglasrek te passen
fluoresceine	Acros Organics	17324	Gebruik om experimentele buffers te maken
zwaartekrachtconvectieoven	Binder	9010-0131
handheld rotary multitool	Dremel	8220	Gebruik voor het boren van gaten in quartz flow cell topper
ImagEM X2 EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-23B	luchtkoeling is voldoende voor dit experiment, gebruik HCImage software of soortgelijk om te besturen
Beeldruimte, dubbelzijdig, kleefbaar
Pot, glas met schroefdop, (ongeveer 50 mm diameter bij 50 mm hoog)
magnesiumchloride hexahydraat	Fisher Bioreagents	BP214-500	Gebruik om experimentele buffer met magnesium te maken
MATLAB software			Data-analyse
metalen pincet	Fisher Brand	16-100-110
methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5.000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Beide PEG's moeten dezelfde NHS-ester hebben, zodat de reactiesnelheid consistent is
microcentrifuge	Eppendorf	5424
multipositie magnetische roerder	VWR	12621-022
N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, gebruik om CHES-buffer te maken
orbitale shaker en verwarming voor microcentrifugebuizen	Q Instruments	1808-0506	met 1808-1061 adapter voor 24 x 2,0 mL of 15 x 0,5 mL buizen
Parafilm
PE60 Polyethyleen buis (binnendiameter 0,76 mm, buitendiameter 1,22 mm)	Intramedic	6258917	22 G stompe naalden passen goed bij deze buisgrootte
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Gebruik bij 1x sterkte
kaliumhydroxide	VWR Chemicals BDH	BDH9262	Gebruik een 1 M oplossing om dekglasjes te reinigen
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Kwarts Slide, 1 inch vierkant, 1 mm dik	Electron Microscopy Sciences	72250-10	Er moeten gaten in de hoeken worden geboord voor het inbrengen van inlaat- en uitlaatbuisjes
versterkte plastic pincet	Rubis	K35a	Gebruik voor het hanteren van dekglasjes en het bouwen van microfluïdisch apparaat
SecureSeal Adhesive Sheets	Grace Biolabs	SA-S-1L	Snijd om een ruimtevormer voor microfluïdisch apparaat te maken
Single channel spuitpomp voor microfluïdica	New Era Pump Systems	NE-1002X-US	uitgerust met een spuit van 50 mL en een 22 G stompe naald
Slide-a-Lyzer MINI Dialyse Devices, 10 kDa MWCO, 0,1 mL	Thermo Scientific	69570 of 69572	Gebruikt voor bufferuitwisseling tijdens het koppelen van quantum dots aan DNA
natriumbicarbonaat	EMD Millipore	SX0320	Gebruik om buffer voor oppervlaktefunctionalisatie te maken; 100 mM, pH 8
natriumchloride	Macron	7581-12	Gebruik voor het maken van experimentele buffers
Natriumfosfaat dibasische oplossing (BioUltra, 0,5 M in water)	Sigma Aldrich	94046	Gebruik voor het maken van 100 mM natriumfosfaat