Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62113

⸱

26 december 2020

 , 
1Department of Chemistry, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.

Samenvatting

Geacetyleerde histoneiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt in Escherichia coli die codeert voor een mutant, Nε-acetyl-lysine (AcK)-specifieke Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) en zijn cognate tRNA (tRNAPyl) om gereconstitueerde mononucleosomen te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. MmAcKRS1 en tRNAPyl leveren AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om AcK op H3 lysine sites op te nemen. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) kan ook gemakkelijk worden geëvolueerd om andere niet-canonische aminozuren (ncAAs) op te nemen voor sitespecifieke eiwitmodificatie of functionalisatie. Hier beschrijven we een methode om AcK met behulp van het MmAcKRS1-systeem in histon H3 op te nemen en acetylated H3-eiwitten te integreren in gereconstitueerde mononucleosomen. Geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen kunnen worden gebruikt bij biochemische en bindende assays, structuurbepaling en meer. Het verkrijgen van gemodificeerde mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van experimenten met betrekking tot het ontdekken van nieuwe interacties en het begrijpen van epigenetica.

Inleiding

We hebben PylRS en tRNAPyl gebruikt om gereconstitueerde mononucleosomen te synthetiseren en te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. PylRS is van onschatbare waarde gebleken als een genetische code-uitbreidingstool om eiwitten te produceren met post translationele modificaties (PTM's) en is genetisch geëvolueerd om ongeveer 200 verschillende NCA's op te nemen. PylRS neemt op bij een amber stop codon, waardoor concurrentie van andere aminozuren tijdens de vertaling wordt verwijderd. PylRS werd voor het eerst ontdekt in methanogene archaea en is sindsdien gebruikt in de chemische biologie om nieuwe reactieve chemische groepen op te nemen in eiwitten1,2.

MmAcKRS1 is geëvolueerd uit Methanosarcina mazei PylRS en wordt vaak gebruikt in ons laboratorium voor de synthese van geacetyleerde eiwitten3,4,5,6. MmAcKRS1 levert AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is eerder gebruikt om AcK op K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 en K79 histon H3 lysine sites te bestuderen om de activiteit van Sirtuin 1, 2, 6 en 7 op geacetyleerde mononucleosomen4,5,6te bestuderen . Hier beschrijven we deze methode om geacetyleerde histonen uit te drukken en geacetyleerde nucleosomen te reconstitueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Plasmide bouw

  1. Begin met te beslissen welk histoneiwit zal worden geacetyleerd en op welke lysineplaats. Muteer de site naar de amber stop codon (TAG) met behulp van site directed mutagenesis.
    OPMERKING: Er zijn vier eerder ontworpen plasmiden die worden gebruikt voor de expressie van histoneiwitten. Alle vier histoneiwitten werden gekloond in de pETDuet-1 vector met een N-terminale histidine tag. Histone H4 bevat ook een SUMO-tag, de oorsprong van replicatie colE1 met een kopienummer van ongeveer 40, ampicillinebestendig en een T7-promotor.
    1. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers die een TAG-mutatie op de gewenste plaats bevatten (een bestaande lysinecodon vervangen door de amberstopcodon) in een van de vier histoneiwitplasmiden.
    2. Gebruik whole-plasmid PCR om de TAG met plasmide te versterken. Bepaal een geschikte gloeitemperatuur voor de primers. Over het algemeen is de smelttemperatuur (Tm) van de primers minus 5 °C voldoende. Als er problemen zijn bij het verkrijgen van een PCR-product, kan een temperatuurgradiënt rond Tm - 5 °C worden gebruikt om de gloeitemperatuur voor versterking te optimaliseren.
      OPMERKING: In dit experiment werd gedurende 30 cycli een in-house uitgedrukt PFU-polymerase gebruikt met de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 30 s (denaturatie), gloeitemperatuur gedurende 30 s en 72 °C gedurende 6 min (of 1 min per kilobase-paar). Voor meer informatie over dit type PCR-methode zie Liu en Naismith7.
    3. Ruim het PCR-product op met een PCR-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer het PCR-product door agarosegelelektroforese en daaropvolgende ethidiumbromidekleuring.
    4. Ligateer de plasmide door 's nachts bij 16 °C te broeden met T4-ligase.
  2. Transformeer eerst de TAG met plasmide (AmpR) in chemisch competente Escherichia coli. Kies minimaal 4 kolonies uit de transformatie en zuiver de plasmide. Maak celvoorraden van elk met glycerol met behulp van standaardmethoden en bewaar bij -80 °C. Stuur voor sequencing om de gewenste TAG-mutatie te bevestigen.
  3. Zodra de sequentie is bevestigd, co-transformeert u de TAG-bevattende plasmide (AmpR) met pEVOL-AckRS (ChlR) in chemisch competente CobB (de enige histon lysine deacetylase bekend in E. coli.) deletie BL21 cellen met behulp van de hitteschokmethode. pEVOL is een plasmide met een mid-copy-number naar low-copy-number p15A origin.
    OPMERKING: De pEVOL-reeks plasmiden werd geconstrueerd op basis van eerdere studies waaruit bleek dat een verhoogde expressie van het orthogonale aaRS/tRNATyr-paar effectief was bij het verminderen van eiwitafkaping en bij het verhogen van de totale opbrengsten van gemuteerde eiwitten8. Als CobB-deletiecellen niet toegankelijk zijn, gaat u verder met chemisch competente BL21-cellen. CobB is een Sirtuin-achtige histonlysine deacetylase en Nicotinamide kan worden toegevoegd bij een 5 mM eindconcentratie tijdens histon eiwitexpressie om CobB te remmen als alternatieve benadering9.
  4. Maak een celvoorraad en bewaar bij -80 °C.

2. Geacetyleerde histon eiwitexpressie

  1. Bereid 1 L autoclaaf 2YT-media (of volume naar keuze) in een kweekkolf.
  2. Ent 20 ml 2YT-media met de juiste antibiotica met de co-getransformeerde celvoorraad met de TAG-bevattende plasmide (AmpR) en pEVOL-AckRS (ChlR) en groei bij 37 °C tot OD = 0,6 (4-6 uur).
  3. Voeg de juiste antibiotica toe aan de 1 L autoclaaf 2YT-media en inenteer met de 20 ml startcultuur. Groeien bij 37 °C tot OD = 0,6-0,8 (2-3 uur).
  4. Voeg inducerende middelen en acetyllysine (AcK) toe aan de eindconcentraties van IPTG 1 mM, 0,2% arabinose en AcK 5 mM.
  5. Kweek de cultuur bij 37 °C gedurende 6-8 uur.
  6. Pelletcellen op 2.700 x g gedurende 15 min.
  7. Bewaar de celkorrel 's nachts bij -80 °C.
  8. Houd vanaf deze stap het monster altijd op ijs. Los de celkorrel op in 50 ml histonlysebuffer per 1 L cultuur.
  9. Sonicaat volgens de volgende cyclus: 1 s aan, 1 s uit, totaal op tijd: 3 min bij 60% amplitude.
  10. Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 45 min.
  11. Gooi de supernatant en resuspend inclusie lichamen in 30 ml histon lysis buffer. Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 30 min.
  12. Gooi de supernatant en resuspend inclusielichamen weg in 30 ml pelletwasbuffer. Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 30 min.
  13. Gooi het supernatant weg en los inclusielichamen op in 25 ml 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl) buffer. Incubeer met agitatie bij 37 °C gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Indien nodig kunnen inclusielichamen 's nachts bij 4 °C worden geïncubeerd met agitatie.
  14. Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 45 min. Incubeer het supernatant met 1 ml Ni-NTA hars geëquilibreerd met 6 M GuHCl buffer gedurende 2 uur.
  15. Ga verder met Ni-NTA zuivering onder gedenatureerde omstandigheden. Was de kolom met 3 kolomvolumes kolomwasbuffer. Elute acetylated histon eiwit met 10 ml elutie buffer.
    OPMERKING: Proberen om het eiwit hier te concentreren is een optie, maar geacetyleerde histonen zijn zeer onvoorspelbaar en kunnen gemakkelijk neerslaan. Het wordt niet aanbevolen om zich te concentreren voorbij 2 ml in het totale volume.
  16. Dialyzeer het geacetyleerde histoneiwit uitgebreid tegen 5% azijnzuurbuffer om zouten te verwijderen. Dialyze gedurende 3 uur per keer bij 4 °C, minimaal 6 keer inwisselen voor verse buffer.
    OPMERKING: Voor een betere eiwitzuiverheid is er een optie om te dialyseren tegen zuiver water. Dit veroorzaakt echter aanzienlijke neerslag en vermindering van de opbrengst, wat ongewenst kan zijn voor laagproductieve geacetyleerde histoneiwitten.
  17. Aliquot en lyophilize eiwit, en bewaren voor onbepaalde tijd bij -80 °C. Wild type histon eiwitten leveren over het algemeen 10-50 mg/L, terwijl geacetyleerde histon eiwitten minder dan 10 mg/L opleveren, afhankelijk van de specifieke lysine site. H3K79Ac is bijvoorbeeld gemiddeld 5 mg/L.

3. Wild-type histon eiwitexpressie

  1. Om volledige nucleosomen te assembleren, drukt u alle 4 histoneiwitten uit. Bij het uitdrukken en zuiveren van histonen van het wilde type is het protocol hetzelfde als de geacetyleerde histonen, behalve de volgende:
    1. Voer geen co-transformatie uit. Gebruik pEVOL-AcKRS niet voor wild type histon expressie. Pas antibiotica dienovereenkomstig aan.
    2. Gebruik geen CobB-deletiecellijn en voeg geen Nicotinamide, AcK of arabinose toe tijdens inductie van cellulaire expressie.

4. Voorbereiding van 601 DNA

OPMERKING: Een eerder ontworpen geoptimaliseerde DNA-sequentie om nucleosoompositionering te sturen, wordt geassembleerd met histonocomeren om mononucleosoom met een hoog rendement te produceren. Deze sequentie wordt 601 DNA of de Widom-sequentie genoemd. Deze sequentie is de standaard DNA-sequentie geworden voor in vitro studies van nucleosomen van chromatineremodelleringstesten tot metingen met één molecuul10.

  1. Om aanzienlijke hoeveelheden van 601 DNA voor nucleosoomassemblage te bereiden, transformeert u pGEM-3z/601 in Top 10-cellen en kweekt u 10 ml cultuur voor plasmideversterking en extractie. Gebruik een plasmide-extractiekit en volg de aanbeveling van de fabrikant op.
  2. Gebruik een in-house uitgedrukte PFU polymerase (efficiënter) voor dit versterkingsprotocol. Stel een PCR-reactie in: Gebruik voor een reactie van 250 μL 207,5 μL autoclaaf MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL. We voeren meestal 60 reacties tegelijk uit om genoeg DNA te krijgen om te assembleren.
  3. Gebruik een gloeitemperatuur van 52 °C gedurende 30 s en een verlengingstijd van 30 s bij gebruik van PFU-polymerase. Volg anders de door de fabrikant aanbevolen voorwaarden.
  4. Zodra PCR klaar is, gebruikt u een PCR-opruimkit naar keuze om het PCR-product te zuiveren.

5. Assemblage van histone octamer

  1. Los aliquots van histon eiwitkorrels H2A, H2B, H3 en H4 op, zodat er een aparte voorraad van elk histoneiwit in GuHCl Buffer is met een totaal volume van 100 μL.
  2. Bereken de concentratie van elk histoneiwit door de A280-absorptie te meten.
  3. Als de absorptie groter is dan 1 voor elk eiwit, verdun dan met guhcl buffer om een nauwkeurigere concentratie te krijgen.
  4. Combineer H2A- en H2B-eiwitten in een molaire verhouding van 1:1 en verdun tot een totale eiwitconcentratie van 4 μg/μL. Herhaal dit voor H3 en H4.
  5. Dialyseer 's nachts bij 4 °C tegen 2 M TE-buffer, 1 M TE-buffer gedurende 2 uur en 0,5 M TE-buffer gedurende 5 uur.
    OPMERKING: De tweede en derde stap van dialyse zorgt ervoor dat onstabiele conformaties van eiwitten neerslaan. Er wordt verwacht dat er bij deze stappen zware neerslag zal vallen.
  6. Verwijder neerslag door centrifugeren bij 16.800 x g bij 4 °C.
  7. Bereken nogmaals de concentratie histon dimers (H2A/H2B mengsel) en tetrameren (H3/H4 mengsel) die de A280 absorptie meten.
  8. Meng dimers en tetrameren in een molaire verhouding van 1:1 en stel NaCl in op 2 M door toevoeging van vaste NaCl.
  9. Histon octameer kan worden bewaard bij 4 °C en is stabieler dan dimers en tetrameren. Bevries nooit zijn toonoctameer, omdat dit demontage kan veroorzaken.
  10. Als u zich assembleert met geacetyleerde histonen, vervangt u gewoon het wilde type eiwit door het geacetyleerde eiwit in de procedure.

6. Nucleosoomassemblage

  1. Gebruik 100x TE buffer en solid NaCl om 601 DNA aan te passen aan 2M TE buffer. Voeg het 601 DNA in 2M TE buffer toe aan histon octameer in een molaire verhouding van 0,85:1 tot 0,90:1. Een lagere verhouding DNA kan worden toegevoegd als er vrij DNA aanwezig is in de gelverschuivingsanalyse.
  2. Breng het DNA-histonmengsel over in een dialysezak en plaats het in ongeveer 200 ml 2 M TE-buffer (of meer bij het samenstellen van meerdere monsters) en roer heel voorzichtig bij 4 °C.
  3. Stel een peristaltische pomp in om te zuiveren om langzaam te druppelen in geen zout TE-buffer. Wanneer het volume ongeveer verdubbeld is, giet je de helft van het volume uit. Doe dit in totaal minstens 4 keer. Bij een pomp kan dit 4-8 uur duren, afhankelijk van het startvolume. Nucleosomen vormen zich wanneer de zoutconcentratie wordt verlaagd tot 150 mM (gemeten met een zoutgehaltemeter).
  4. Nadat de zoutconcentratie is verlaagd tot 150 mM, dialyseer u 's nachts tegen een TE-buffer van 20 mM.
  5. Verwijder neerslag door centrifugeren en meet de concentratie van de nucleosomen met een260-aflezing met behulp van een plaatlezer.
  6. Voeg His-TEV protease (TEV: nucleosoom 1:30, w:w ) toe en incubeer 's nachts bij 4 °C om alle histidinetags te verwijderen. Verwijder de histidine tag onzuiverheden uit de nucleosoomoplossing door Ni-NTA hars naar beneden te trekken.
  7. Om het nucleosoom te plaatsen en het monster te homogeniseren, incubeer u gedurende 1 uur bij 60 °C.
    OPMERKING: Voor acetylated sites die bijzonder onstabiel zijn, is deze stap mogelijk niet aan te raden.
  8. Bewaar nucleosomen voor korte termijn (enkele weken) bij 4 °C.
  9. Voor langdurige opslag, dialyze nucleosomen tegen opslagbuffer en opslaan bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dimers, tetrameren en octameren kunnen worden beoordeeld door een 12% SDS PAGE gel te gebruiken (figuur 1 en figuur 2). Hier kunt u zien dat sommige van de geacetyleerde tetrameren een lagere opbrengst hebben dan andere (Figuur 1). In feite, hoe dichter bij het kerngebied, hoe lager de waargenomen opbrengst. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de acetylatie interfereren met de assemblage van de tetra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het is essentieel om dit protocol in elk detail te volgen tijdens een experiment. Nucleosomen zijn niet erg stabiel en er is veel vallen en opstaan gegaan bij het bepalen van dit protocol. Het is belangrijk om neerslag bij elke stap (of wanneer waargenomen) te verwijderen, omdat deeltjes gemakkelijk de assemblageprocessen kunnen verstoren. Hou zijn toonmonsters altijd op ijs. Als nucleosomen te lang bij 4 °C worden bewaard, kunnen ze spontaan uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat u monsters van Native PAGE controleert als d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen concurrerende financiële belangen om door een van de auteurs te verklaren.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Wesley Wang bedanken voor het leggen van de basis voor dit protocol en zijn waardevolle mentorschap. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (Grants R01GM127575 en R01GM121584) en Welch Foundation (Grant A-1715).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M TE BufferNANA0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE BufferNANA1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE BufferNANA
2 M TE BufferNANA2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE BufferNANA20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash BufferNANA6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazool pH 7.8
Elution BufferNANA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer PumpFischer Scientific15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis BufferNANA60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazool, pH 7.8
PCR Clean-Up KitEpoch Life Sicences2360050
Pellet Wash BufferNANA60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRSAddgene137976
pGEM-3z/601Addgene26656
Storage BufferNANA20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler

Referenties

  1. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  2. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  3. Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
  4. Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
  5. Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
  6. Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
  7. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).
  8. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  9. Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
  12. Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
  13. Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
  14. Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
  15. Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
  16. Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Histonacetyleringexpressie in Escherichia colisite-specifieke acetyleringassemblage van mononucleosomenniet-canonieke aminozurenpyrrolysyl-tRNA-synthetasehistonoctameerposttranslationele modificatie
Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.