Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Samenvatting

Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.

Samenvatting

Geacetyleerde histoneiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt in Escherichia coli die codeert voor een mutant, N^ε-acetyl-lysine (AcK)-specifieke Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) en zijn cognate tRNA (tRNA^Pyl) om gereconstitueerde mononucleosomen te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. MmAcKRS1 en tRNA^Pyl leveren AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om AcK op H3 lysine sites op te nemen. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) kan ook gemakkelijk worden geëvolueerd om andere niet-canonische aminozuren (ncAAs) op te nemen voor sitespecifieke eiwitmodificatie of functionalisatie. Hier beschrijven we een methode om AcK met behulp van het MmAcKRS1-systeem in histon H3 op te nemen en acetylated H3-eiwitten te integreren in gereconstitueerde mononucleosomen. Geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen kunnen worden gebruikt bij biochemische en bindende assays, structuurbepaling en meer. Het verkrijgen van gemodificeerde mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van experimenten met betrekking tot het ontdekken van nieuwe interacties en het begrijpen van epigenetica.

Inleiding

We hebben PylRS en tRNA^Pyl gebruikt om gereconstitueerde mononucleosomen te synthetiseren en te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. PylRS is van onschatbare waarde gebleken als een genetische code-uitbreidingstool om eiwitten te produceren met post translationele modificaties (PTM's) en is genetisch geëvolueerd om ongeveer 200 verschillende NCA's op te nemen. PylRS neemt op bij een amber stop codon, waardoor concurrentie van andere aminozuren tijdens de vertaling wordt verwijderd. PylRS werd voor het eerst ontdekt in methanogene archaea en is sindsdien gebruikt in de chemische biologie om nieuwe reactieve chemische groepen op te nemen in ....

Protocol

1. Plasmide bouw

1. Begin met te beslissen welk histoneiwit zal worden geacetyleerd en op welke lysineplaats. Muteer de site naar de amber stop codon (TAG) met behulp van site directed mutagenesis.
   OPMERKING: Er zijn vier eerder ontworpen plasmiden die worden gebruikt voor de expressie van histoneiwitten. Alle vier histoneiwitten werden gekloond in de pETDuet-1 vector met een N-terminale histidine tag. Histone H4 bevat ook een SUMO-tag, de oorsprong van replicatie colE1 met een kopienummer van ongeveer 40, ampicillinebestendig en een T7-promotor.
   1. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers die een TAG-mutatie op de gewenste plaats bevatten (ee....

Resultaten

Dimers, tetrameren en octameren kunnen worden beoordeeld door een 12% SDS PAGE gel te gebruiken (figuur 1 en figuur 2). Hier kunt u zien dat sommige van de geacetyleerde tetrameren een lagere opbrengst hebben dan andere (Figuur 1). In feite, hoe dichter bij het kerngebied, hoe lager de waargenomen opbrengst. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de acetylatie interfereren met de assemblage van de tetra.......

Discussie

Het is essentieel om dit protocol in elk detail te volgen tijdens een experiment. Nucleosomen zijn niet erg stabiel en er is veel vallen en opstaan gegaan bij het bepalen van dit protocol. Het is belangrijk om neerslag bij elke stap (of wanneer waargenomen) te verwijderen, omdat deeltjes gemakkelijk de assemblageprocessen kunnen verstoren. Hou zijn toonmonsters altijd op ijs. Als nucleosomen te lang bij 4 °C worden bewaard, kunnen ze spontaan uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat u monsters van Native PAGE controleert als d.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 M TE Buffer	NA	NA	0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl			6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer	NA	NA	6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazool pH 7.8
Elution Buffer	NA	NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin			6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazool, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Pellet Wash Buffer	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Storage Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler