Methodenartikel

Accumulatie en distributie van fluorescerende microplastics in de vroege levensfasen van zebravissen

5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62117

⸱

4 juli 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Environment, Zhejiang University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Zebravisembryo's/larven ontwikkelen zich extern en zijn optisch transparant. De bioaccumulatie van microplastics in vissen in vroege levensfasen wordt gemakkelijk beoordeeld met fluorescerend gelabelde microbeads.

Samenvatting

Als nieuw type milieuverontreinigende stof is microplastic op grote schaal aangetroffen in het aquatisch milieu en vormt het een grote bedreiging voor in het water levende organismen. De bioaccumulatie van microplastics speelt een sleutelrol in hun toxische effecten; als deeltjes verschillen hun bioaccumulaties echter van veel andere verontreinigende stoffen. Hier beschreven is een haalbare methode om de accumulatie en distributie van microplastics in zebravisembryo's of larven visueel te bepalen met behulp van fluorescerende microplastics. Embryo's worden gedurende 120 uur blootgesteld aan verschillende concentraties (0,1, 1 en 10 mg/L) fluorescerende microplastics met een diameter van 500 nm. In de resultaten is aangetoond dat microplastics op een concentratieafhankelijke manier kunnen bioaccumuleren in zebravisembryo's/larven. Vóór het uitkomen wordt sterke fluorescentie gevonden rond het embryonale koraal; terwijl in zebravislarven de dooierzak, het pericard en het maagdarmkanaal de belangrijkste geaccumuleerde locaties van microplastics zijn. De resultaten tonen de opname en internalisering van microplastics in zebravissen in vroege levensfasen aan, wat de basis zal vormen voor een beter begrip van de impact van microplastics op waterdieren.

Inleiding

Sinds de eerste synthetiseren in de jaren 1900, kunststoffen worden veel gebruikt op verschillende gebieden, wat resulteert in een snelle groei van de wereldwijde productie1. In 2018 werd wereldwijd ongeveer 360 miljoen ton kunststoffen geproduceerd2. De kunststoffen in de natuurlijke omgeving zullen afbreken tot fijne deeltjes als gevolg van chemische, fysische of biologische processen3. Over het algemeen worden fijne plastic deeltjes <5 mm groot gedefinieerd als microplastics4. Microplastics zijn ook ontworpen voor specifieke toepassingen, zoals microbeads uit cosmetische producten5. Als bijna permanente verontreinigingen worden microplastics opgehoopt in het milieu en hebben ze steeds meer aandacht getrokken van wetenschappers, beleidsmakers en het publiek1,6. Eerdere studies documenteerden dat microplastics nadelige effecten bij vissen kunnen veroorzaken, zoals gastro-intestinale schade7, neurotoxiciteit8, hormoonontregeling9, oxidatieve stress10 en DNA-schade11. De toxiciteit van microplastics is tot nu toe echter niet volledig aangetoond12,13.

Zebravisembryo's bieden veel experimentele voordelen, waaronder kleine afmetingen, externe bevruchting, optische transparantie en grote koppelingen, en worden beschouwd als een ideaal modelorganisme voor het in vivo bestuderen van de effecten van verontreinigende stoffen op vissen in vroege levensfasen. Bovendien zijn slechts beperkte hoeveelheden teststoffen nodig voor de evaluatie van biologische reacties. Hier worden zebravisembryo's gedurende 5 dagen blootgesteld aan verschillende concentraties microplastics (0,1, 1, 10 mg/L) en worden de bioaccumulatie en distributie van microplastics in zebravisembryo's/larven geëvalueerd. Dit resultaat zal ons begrip over de toxiciteit van microplastics voor vissen bevorderen, en de hier beschreven methode kan mogelijk worden gealdaliseerd om de accumulatie en distributie van andere soorten fluorescerende materialen in de vroege levensfasen van zebravissen te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Volwassen zebravissen zijn afkomstig van het China Zebrafish Resource Center (Wuhan, China). De experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de nationale gids "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).

1. Embryo's verzamelen

  1. Houd vissen in glazen tanks van 20 L met recirculerend koolstofgefilterd leidingwatersysteem (pH 7,0 ± 0,2) bij een constante temperatuur (28 ± 0,5 °C) op een fotoperiode van 14:10 uur licht: donker.
  2. Voer vis tweemaal daags met Artemia nauplii. Het wordt aanbevolen dat het voedsel wordt gegeven met maximaal 3% visgewicht per dag en moet binnen 5 minuten per keer worden gegeten14.
  3. Breng goed ontwikkelde volwassen zebravissen (met een lichaamslengte van 3-4 cm) over in de paaitank in een verhouding van één mannetje tot twee vrouwtjes de nacht voor de fokkerij.
    OPMERKING: De volgende ochtend beginnen de vissen te spawnen na het begin van de lichtcyclus.
  4. Verzamel eieren met een Pasteur pipet. Spoel meerdere keren met de oplossing van 10% Hank en controleer vervolgens met een microscoop op bevruchting. Bevruchte eieren ondergaan de decolletéperiode na ongeveer 2 uur na de bevruchting (hpf) en kunnen duidelijk worden geïdentificeerd15.
  5. Incubeer de bevruchte embryo's in een bekerglas van 500 ml met 200 ml 10% Hanks oplossing met 1% methyleenblauw voor desinfectie bij 28 °C. Beladingssnelheid van 1 embryo/2 ml oplossing niet overschrijden.
    OPMERKING: 10% Hank's oplossing bestaat uit 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 en 4,2 mM NaHCO3.

2. Bereiding van microplastic suspensussingen

  1. Soniceer de stamoplossing van groene fluorescerend gelabelde polystyreenparels (10 mg/ml) met een nominale diameter van 500 nm (excitatie/emissie: 460/500 nm) gedurende 10 minuten.
  2. Verdun de stamoplossing met de oplossing van 10% Hank om de gewenste belichtingsoplossingen (0,1, 1 en 10 mg/L) te produceren.
  3. Bereid altijd de belichtingsoplossingen van microplastics voor op de blootstelling.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het beoordelen van de toxische effecten van microplastics, omdat de aanwezigheid van conserveermiddelen, zoals natrium azide, in de commerciële deeltjesformuleringen giftig kan zijn voor verschillende organismen 16. Daarom moeten deze additieven worden verwijderd of verantwoord in de controles voordat een toxiciteitsexperiment wordt uitgevoerd.

3. Blootstelling aan microplastics

  1. Selecteer willekeurig 6 nieuw bevruchte embryo's (4 hpf) en breng vervolgens over in elke put van 6-putplaat met 5 ml microplastic-oplossingen met verschillende concentraties. Neem de controlegroepen op die de oplossing van 10% Hank bevatten.
    1. Gebruik drievoudputten (met in totaal 18 embryo's) voor elke behandeling.
  2. Incubeer de embryo's onder hetzelfde licht: donkere cyclus en temperatuur als volwassenen (zie 1.2) en observeer elke 12 uur. Verwijder de doden onmiddellijk.
  3. Vernieuw de microplastic oplossingen 90% om de 24 uur. Tijdens de blootstellingsperiode worden de vissen niet gevoerd.
    OPMERKING: Over het algemeen begint het uitkomen van embryo bij 48 hpf en voltooit het bij ongeveer 72 hpf.

4. Beoordeling van de verdeling van microplastics

  1. Selecteer bij 24, 48, 72, 96 en 120 uur na de bevruchting willekeurig de embryo's/larven (één van de drie replica's) en spoel met 10% Hanks oplossing.
  2. Breng de larven over in een petrischaal en stel bloot aan 0,016% tricaine voor anesthesie.
    1. Bereid de stamoplossing van tricaïne: 4 mg tricaïnepoeder wordt opgelost in 100 ml dubbel gedestilleerd water en stel de pH in op 7,0 met Tris-HCl (pH 9,0). Bewaar de voorraadoplossing in de vriezer.
    2. Bereid de werkoplossing voor. Verdun de stamoplossing tot de gewenste concentratie (0,016%) met 10% Hank's oplossing bijkamertemperatuur 14.
  3. Schik de embryo's/larven en bereid je voor op observatie.
  4. Observeer de vis met een fluorescentiemicroscoop en beeld met beeldvormingssoftware.
  5. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit bij vissen met ImageJ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De verdeling en accumulatie van fluorescerende microplastics zijn weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Er wordt geen zichtbare fluorescentie waargenomen in de onbelichte groep (controle). Er wordt echter een opeenhoping van fluorescentie gevonden rond het koraal na blootstelling aan verschillende concentraties microplastics (24 hpf). Groene fluorescentie wordt ook gedetecteerd bij larven en de fluorescentieniveaus lijken op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier toe te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Volgens het richtsnoer voor de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, zoals EU-richtlijn 2010/63/EU, is toestemming voor dierethiek niet verplicht voor een experiment met vroege levensfasen van zebravissen totdat het stadium van onafhankelijke voeding mogelijk is (5 dagen na bevruchting)17. Beste welzijnspraktijken zijn echter belangrijk voor het optimaliseren van het gebruik van zebravissen, en bijvoorbeeld de humane methoden van anesthesie en euthanasie moe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur verklaart geen concurrerende of financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) en het Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT_17R97).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fluorescente microscoopNikon, JapanEclipse Ti-S
Groen fluorescent gelabelde polystyreen kralenPhosphorex, USA2103A
TricaineSigma-Aldrich, USAA5040

Referenties

  1. SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
  2. Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
  3. Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).
  4. Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
  5. Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. Microplastic in aquatic ecosystems. Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).
  6. Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
  7. Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929(2020).
  8. Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24(2020).
  9. Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922(2020).
  10. Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161(2021).
  11. Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
  12. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
  13. Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089(2020).
  14. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  16. Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
  17. Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
  18. Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
  19. Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravisembryo sAccumulatie van MicroplasticsBioaccumulatie van MicroplasticsDistributie van MicroplasticsFluorescentiemicroscopieBlootstelling aan MicroplasticsPolystyreenbolletjesAquatische Toxicologie

Gerelateerde artikelen