Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Monoamine neurotransmitters worden geassocieerd met tal van neurologische en psychiatrische aandoeningen. Diermodellen van dergelijke omstandigheden hebben veranderingen in de afgifte en opnamedynamiek van monoamine-neurotransmitters aangetoond. Technisch complexe methoden zoals elektrofysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), beeldvorming, in vivo microdialyse, optogenetica of gebruik van radioactiviteit zijn vereist om de monoaminefunctie te bestuderen. De hier gepresenteerde methode is een geoptimaliseerde tweestapsbenadering voor het detecteren van monoamineafgifte in acute hersenplakken met behulp van een 48-well plaat met weefselhouders voor het onderzoeken van monoamineafgifte en hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met elektrochemische detectie (HPLC-ECD) voor monoamine-afgiftemeting. Kortom, rattenhersensecties met interessante gebieden, waaronder prefrontale cortex, hippocampus en dorsaal striatum, werden verkregen met behulp van een weefselsnijder of vibratome. Deze interessegebieden werden ontleed uit de hele hersenen en geïncubeerd in een zuurstofrijke fysiologische buffer. De levensvatbaarheid werd onderzocht gedurende het experimentele tijdsverloop, door middel van 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay. De acuut ontleedde hersengebieden werden geïncubeerd in verschillende medicijnomstandigheden waarvan bekend is dat ze monoamineafgifte induceren via de transporter (amfetamine) of door de activering van exocytotische vesiculaire afgifte (KCl). Na incubatie werden de vrijgekomen producten in het supernatant verzameld en geanalyseerd via een HPLC-ECD-systeem. Hier wordt basale monoamineafgifte gedetecteerd door HPLC uit acute hersenplakken. Deze gegevens ondersteunen eerdere in vivo en in vitro resultaten waaruit blijkt dat AMPH en KCl monoamineafgifte induceren. Deze methode is met name nuttig voor het bestuderen van mechanismen die verband houden met monoaminetransporterafhankelijke afgifte en biedt de mogelijkheid om verbindingen die de afgifte van monoamine beïnvloeden op een snelle en goedkope manier te screenen.
Inleiding
Een overvloed aan neurologische en psychiatrische ziekten worden geassocieerd met ontregeling of onvoldoende onderhoud van monoamine neurotransmitter (dopamine [DA], serotonine [5-HT], noradrenaline [NE]) homeostase1,2,3. Deze aandoeningen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, depressie1,2, schizofrenie2, angst2, verslaving4, menopauze5,6,7,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten, inclusief dierbehandeling en weefselverzameling, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van Florida en het City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), volgens het goedgekeurde protocol 201508873 (UF) en 1071 (CCNY). Voor reagentia en buffer verwijzen wij u naar het Aanvullend Dossier.
1. Bereid acute schijfjes rattenhersenen
OPMERKING: In dit experiment werden volwassen mannelijke ratten (250-350 g) gebruikt. Deze opstelling is echter functioneel voor verschillende ontwikkelingspunten, vrouwelijke ratten en andere soorten. Als u....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze techniek beschrijft het gebruik van hersenplakken om de afgifte van endogene monoaminen te meten met behulp van HPLC met elektrochemische detectie op basis van een 48-putplaat met een interne weefselhouder. De experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Aanvankelijk werd, om de levensvatbaarheid van het weefsel tegen het einde van het experiment te garanderen, een MTT-test (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Monoamine-afgiftemetingen worden al jaren uitgevoerd in een aantal systemen zoals heterologe cellen, neuronale culturen, hersensynaptosomen, ex vivo acute hersenplakken en hele dieren13,20,41,42,58,64,65,66,67,68
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies Fondecyt Initiation Fund N 11191049 aan J.A.P. en NIH-subsidie DA038598 aan G.E.T.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artificial Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artificial Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
Referenties
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
