Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een in vitro systeem om de trombolytische werkzaamheid van histotripsie en een lytisch medicijn te meten

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62133

⸱

4 juni 2021

 ,  , 
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Histotripsy-aided lytic delivery of lysotripsy is in ontwikkeling voor de behandeling van diepe veneuze trombose. Een in vitro procedure wordt hier gepresenteerd om de werkzaamheid van deze combinatietherapie te beoordelen. Belangrijke protocollen voor het stolselmodel, beeldbegeleiding en beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling worden besproken.

Samenvatting

Diepe veneuze trombose (DVT) is een wereldwijd gezondheidsprobleem. De primaire benadering om vaatrekanalisatie voor kritieke obstructies te bereiken, is kathetergerichte trombolytica (CDT). Om bijtende bijwerkingen en de lange behandelingstijd geassocieerd met CDT te verminderen, zijn adjuvante en alternatieve benaderingen in ontwikkeling. Een van die benaderingen is histotripsy, een gerichte ultrasone therapie om weefsel te aborteren via bubbelwolknucleatie. Preklinische studies hebben een sterke synergie aangetoond tussen histotripsie en trombolytica voor stolselafbraak. Dit rapport schetst een benchtop-methode om de werkzaamheid van histotripsy-aided trombolytische therapie of lysotripsie te beoordelen.

Stolsels vervaardigd uit vers menselijk veneus bloed werden geïntroduceerd in een stroomkanaal waarvan de afmetingen en acousto-mechanische eigenschappen een iliofemorale ader nabootsen. Het kanaal was doordrenkt met plasma en de lytische recombinante weefseltype plasminogeen activator. Bubbelwolken werden gegenereerd in het stolsel met een gerichte ultrasone bron ontworpen voor de behandeling van femorale veneuze stolsels. Gemotoriseerde positioners werden gebruikt om de bronfocus langs de stolsellengte te vertalen. Op elke insonatielocatie werden akoestische emissies van de bellenwolk passief geregistreerd en straalgevormd om passieve cavitatiebeelden te genereren. Metrieken om de werkzaamheid van de behandeling te meten, omvatten stolselmassaverlies (algehele werkzaamheid van de behandeling) en de concentraties van D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) in het perfusaat. Er zijn beperkingen aan dit in vitro ontwerp, waaronder een gebrek aan middelen om in vivo bijwerkingen of dynamische veranderingen in de stroomsnelheid te beoordelen naarmate het stolsel lyseert. Over het algemeen biedt de opstelling een effectieve methode om de werkzaamheid van op histotripsy gebaseerde strategieën voor de behandeling van DVT te beoordelen.

Inleiding

Trombose is de toestand van stolselvorming in een verder gezond bloedvat dat de bloedsomloop belemmert1,2. Veneuze trombo-embolie heeft een jaarlijkse gezondheidszorgkost van $ 7-10 miljard, met 375.000-425.000 gevallen in de Verenigde Staten3. Longembolie is de obstructie van de longslagader en is het ernstigste gevolg van veneuze trombo-embolie. De primaire bron van longobstructie is diepe veneuze trombi, voornamelijk van iliofemorale veneuze segmenten4,5,6. Diepe veneuze trombose (DVT) heeft inherente gevolgen naast pulmonale obstructies, met complicaties op lange termijn die resulteren in pijn, zwelling, beenzweren en ledemaat amputaties7,8,9. Voor kritieke obstructies zijn kathetergerichte trombolytica (CDT) de eerstelijnsbenadering voor vatrekanalisatie10. De uitkomst van CDT hangt af van een aantal factoren, waaronder trombusleeftijd, locatie, grootte, samenstelling, etiologie en patiëntrisicocategorie11. Bovendien wordt CDT geassocieerd met vasculaire schade, infecties, bloedingscomplicaties en lange behandelingstijd10. Apparaten van de volgende generatie zijn gericht op het combineren van mechanische trombectomie met trombolytica (d.w.z. farmacomechanische trombectomie)12,13. Het gebruik van deze apparaten verlaagt de lytische dosering, wat leidt tot verminderde bloedingscomplicaties en verkorte de behandelingstijd12,13,14 in vergelijking met CDT. Deze apparaten hebben nog steeds problemen met hemorragische bijwerkingen en onvolledige verwijdering van chronische trombi15. Er is dus een adjuvante strategie nodig die de trombus volledig kan verwijderen met lagere bloedingscomplicaties.

Een mogelijke benadering is histotripsy-aided trombolytische behandeling, aangeduid als lysotripsy. Histotripsy is een niet-invasieve behandelingsmodaliteit die gerichte echografie gebruikt om bubbelwolken in weefsels te nucleeren16. Bubbelactiviteit wordt niet gegenereerd via exogene kernen, maar door de toepassing van ultrasone pulsen met voldoende spanning om kernen te activeren die intrinsiek zijn aan weefsels, waaronder stolsel17,18. De mechanische oscillatie van de bellenwolk geeft spanning aan het stolsel, waardoor de structuur uiteenvalt in acellulair puin19. Histotripsy bubbelactiviteit zorgt voor een effectieve afbraak van ingetrokken en niet-teruggetrokken bloedstolsels, zowel in vivo als in vitro20,21,22. Eerdere studies hebben23,24 aangetoond dat de combinatie van histotripsie en de lytische recombinante weefseltype plasminogeenactivator (rt-PA) de werkzaamheid van de behandeling aanzienlijk verhoogt in vergelijking met lytisch alleen of histotripsie alleen. Er wordt verondersteld dat twee primaire mechanismen geassocieerd met histotripsy bubbelactiviteit verantwoordelijk zijn voor de verbeterde werkzaamheid van de behandeling: 1) verhoogde fibrinolyse als gevolg van verbeterde lytische afgifte en 2) hemolyse van rode bloedcellen in het stolsel. Het grootste deel van de stolselmassa bestaat uit rode bloedcellen24en daarom is het volgen van de afbraak van erytrocyten een goed surrogaat voor ablatie van het monster. Andere gevormde stolselelementen zijn waarschijnlijk ook gedesintegreerd onder histotripsy bubbelactiviteit, maar worden niet in dit protocol overwogen.

Hier wordt een benchtop-benadering geschetst om DVT in vitro met lysotripsie te behandelen. Het protocol beschrijft kritische operationele parameters van de histotripsiebron, beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling en beeldbegeleiding. Het protocol omvat het ontwerpen van een stroomkanaal om een iliofemoraal veneus segment na te bootsen en het produceren van menselijke volbloedstolsels. De experimentele procedure schetst de positionering van de histotripsiebron en beeldvormingsarray om histotripsy-blootstelling te bereiken langs het stolsel dat in het stroomkanaal is geplaatst. Relevante insonatieparameters om stolselverstoring te bereiken en off-target bubbelactiviteit te minimaliseren, worden gedefinieerd. Het gebruik van echografie voor begeleiding en beoordeling van bubbelactiviteit wordt geïllustreerd24. Statistieken om de werkzaamheid van de behandeling te kwantificeren, zoals stolselmassaverlies, D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) worden geschetst23,24,25,26,27. Over het algemeen biedt de studie een effectief middel voor het uitvoeren en beoordelen van de werkzaamheid van lysotripsy om DVT te behandelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor de hier gepresenteerde resultaten werd veneus menselijk bloed getrokken om stolsels te vormen na goedkeuring van de lokale interne beoordelingscommissie (IRB # 19-1300) en schriftelijke geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren24. Deze sectie schetst een ontwerpprotocol om de werkzaamheid van lysotripsie te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op een eerder werk van Bollen et al.24.

1. Stolsel modellering

OPMERKING: Bereid de stolsels binnen 2 weken maar meer dan 3 dagen voorafgaand aan de dag van het experiment om de stabiliteit van het stolsel te garanderen en de terugtrekking te maximaliseren28. Bereid het stolsel voor na de goedkeuring van de lokale institutionele beoordelingscommissie.

  1. Bereid borosilicaat Pasteur pipet voor het opslaan van het bloed (zie Tabel met materialen voor specificaties van de pipet). Borosilicaatbuizen worden gebruikt vanwege de hydrofiele aard van het materiaal dat de activering van bloedplaatjes en de terugtrekking van het stolsel bevordert29. Sluit de punt van de pipet af via verhitting boven een Bunsen-brander.
  2. Trek vers menselijk veneus bloed. Aliquot het totale bloed dat wordt afgenomen in stappen van 2 ml per gewenst stolsel. Breng elke 2 ml aliquot over in één Pasteur pipet.
    OPMERKING: Voer stap 1.2 uit binnen ongeveer 3 minuten na de bloedafname, zodat het bloed niet stolt voordat het in pipetten wordt overgebracht. Zorg er ook voor dat de vrijwillige donor geen medicijnen gebruikt die de stollingscascade kunnen veranderen (bijv. bloedverdunners of bloedplaatjesremmers).
  3. Incubeer de bloedgluts in de pipetten (gelijk aan het aantal benodigde stolsels) in een waterbad gedurende 3 uur bij 37 °C.
  4. Bewaar de pipetten minimaal 3 dagen bij 4 °C om het intrekken van stolsels mogelijk te maken28. Naarmate de stolsels zich terugtrekken, zal worden waargenomen dat serum zich ophoopt aan de bovenkant van het stolsel in de pipet. De rt-PA respons van stolsels blijft stabiel gedurende 2 weken na retractie28.

2. Voorbereiding van het waterreservoir

  1. Vul het waterreservoir met omgekeerd osmosewater. Bekleed het bodemoppervlak van de tank met een akoestisch absorberend materiaal om reflectie van de therapie of echografiepulsen te verminderen. Gebruik een waterbehandelingssysteem om het water te ontgassen en te filteren om bubbelkernen te minimaliseren.
    OPMERKING: Een manier om het water te filteren is met behulp van een inline filter. De specificaties van de zak die wordt gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten worden gegeven in de tabel met materialen.
  2. Plaats twee verwarmingselementen op het onderste oppervlak van de tank. Verwarm het water tot 37,3 °C om de maximale lytische enzymatische activiteit te bereiken30.
  3. Stel een stroomkanaal in zoals weergegeven in figuur 1A. Het stroomkanaal bestaat uit buizen, een modelvat met materiaal- en geometrische eigenschappen die representatief zijn voor een iliofemorale ader, een reservoir voor plasma en een spuit aan het distale uiteinde van het reservoir(Tabel met materialen). De spuit is aangesloten op een pomp om een stroom door het kanaal tijdens het experiment te regelen.
  4. Dompel het stroomkanaal handmatig onder in de watertank om het kanaal op fysiologische temperatuur te brengen tijdens de ontgassings-/filter-/verwarmingsfase (stappen 2.1 en 2.2).

3. Bereiding van plasma en rt-PA mengsel

  1. Voorafgaand aan de experimenteerdag
    OPMERKING: Bij opslag bij -80 °C is plasma ten minste 2,5 jaar31 stabiel en rt-PA is ten minste 7 jaarstabiel 32. Voer daarom stap 3.1 op elk gewenst moment binnen deze perioden uit om de stabiliteit van de twee componenten te garanderen.
    1. Verdun de rt-PA verkregen van een fabrikant in poedervorm tot 1 mg/ml in steriel water.
    2. Aliquot 100 μL verdunde rt-PA in centrifugebuizen van 0,5 ml en bewaar ze bij -80 °C.
    3. Aliquot 35 ml menselijk vers ingevroren type O plasma in centrifugebuizen van 50 ml. Bewaar de buizen bij -80 °C.
  2. Op de experimentele dag
    1. Haal plasma aliquots uit de vriezer. Haal evenveel aliquots op als het aantal stolsels dat die dag moet worden getest. Dompel de bevroren aliquots onder in een waterbad bij 37 °C om te ontdooien (~10 min).
    2. Zodra het plasma is ontdooid, giet het in een bekerglas dat drieduel wordt gespoeld met ultrapijn water. Bedek de mond van het bekerglas lichtjes met aluminiumfolie om besmetting te voorkomen en plaats het bekerglas in het waterbad. Laat de folie los genoeg zitten om lucht in contact te laten met het plasma.
    3. Laat het plasma bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur in evenwicht brengen met de atmosferische druk.
    4. Haal de bevroren rt-PA injectieflacons eruit en plaats op ijs totdat het nodig is, met één injectieflacon voor elke experimentrun.
    5. Maak lage geleer agarose (2%) in een kolf van 50 ml, door agarose op te lossen in ultrapijn water. Kies de totale hoeveelheid agarose-oplossing zodanig dat ongeveer 2 ml beschikbaar is voor elk te analyseren monster. Verwarm de oplossing in de kolf in een magnetron tot het bubbels is. Zet de kolf vast met een waterdicht schroefdeksel erop. Dompel de kolf onder in het waterbad naast het plasma.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat agarose beschikbaar is om blootgestelde stolselsegmenten veilig te stellen voor histologische analyse na histotripsie-insonatie.

4. Histotripsy source en imaging array instellen

  1. Zorg ervoor dat de gemotoriseerde positioners kunnen worden bestuurd vanuit de runtime-omgeving van een programmeerplatform, met behulp van aanwijzingen en opdrachten van de fabrikant. Controleer of de motoren van het systeem zijn aangesloten op de juiste poort van de computer met de runtime-omgeving.
  2. Monteer de histotripsybron op het gemotoriseerde positioneringssysteem zoals weergegeven in figuur 1B.
  3. Sluit de histotripsy-bron aan op de aandrijfelektronica (bijv. eindversterker en functiegenerator) via de juiste connectoren (bijv. BNC-kabels) zoals gespecificeerd door de fabrikant.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de aandrijfelektronica van de histotripsybron kan worden bediend via de runtime-omgeving die in stap 4.1 wordt gebruikt.
  4. Bedek de beeldarray met een sondedeksel en bevestig de array coaxiaal in het diafragma van de histotripsiebron zoals weergegeven in figuur 2. Zorg ervoor dat u de oriëntatie van het beeldvlak begrijpt ten opzichte van de oriëntatie van de histotripsybron.
  5. Sluit de beeldarray aan op een echografiescansysteem. Zorg ervoor dat dit systeem de werking en activering van de beeldarray kan regelen en beeldgegevens kan verzamelen volgens de opdrachten van de fabrikant van de scanner.
  6. Dompel de histotripsy bron/imaging array onder in de tank tijdens het ontgassen zoals weergegeven in figuur 1A. Verwijder voorzichtig alle luchtbellen met behulp van een spuit van het oppervlak van de histotripsy bron of imaging array.
    OPMERKING: Dompel de histotripsiebron en beeldvormingsarray volledig onder in water voordat u wordt gebruikt. Vermijd het aanraken van het oppervlak van de histotripsy bron.
  7. Verkrijg B-modus beelden met een snelheid van 20 frames per seconde met behulp van de imaging array en de ingebouwde commando's van de scanner. Pas het beeldvenster aan om de focus van de histotripsy-bron in deze realtime beelden te visualiseren.
    OPMERKING: Er wordt aangenomen dat de dimensies van het focale gebied van de therapeutische bron bekend zijn.
  8. Stel de bedrijfsparameters van de histotripsiebron in, inclusief de fundamentele frequentie (bijvoorbeeld 1,5 MHz), de pulsherhalingsfrequentie (bijvoorbeeld 20-100 Hz), de pulsduur (bijvoorbeeld 1-20 cycli per puls) en het totale aantal pulsen per locatie (bijvoorbeeld 100-2.000)18,23,24,33. Wijzig deze parameters als er niet voldoende stolsellysis wordt bereikt of als de belactiviteit verder reikt dan het lumen van het modelvat. Als u deze parameters wilt instellen, gebruikt u het protocol van de fabrikant van de bron of gebruikt u een programmeerplatform dat met de bron kan communiceren (stap 4.3).
  9. Gebruik het protocol of het programmeerplatform van de fabrikant dat in stap 4.8 wordt gebruikt, voer de histotripsybron uit op de ingestelde parameters alleen in ontgast water, zonder enige belemmering in de omgeving. Verhoog de spanning die op de histotripsybron wordt toegepast totdat een bellenwolk is gevormd.
  10. Pas met behulp van de real-time beeldvorming van stap 4.7 de positie van de beeldarray in de opening van de confocale transducer aan totdat de bellenwolk zich ongeveer in het midden van het afbeeldingsvenster bevindt. De bellenwolk is het gebied van hyperechoïsche pixels in het beeldvlak (Figuur 3). Draai de schroeven aan om de beeldarray stevig in de opening van de transducer te houden.
    OPMERKING: Als de array goed is uitgelijnd, moet de azimutale positie van de bellenwolk ongeveer op 0 mm in het beeldvlak liggen. De beeldvormende array kan enigszins projecteren vanaf het binnenoppervlak van de therapiebron, en daarom kan de bereikpositie van de bellenwolk verschillen van de brandpuntsafstand van de bron.
  11. Identificeer de locatie van de bellenwolk in het beeldvlak. Wijs de focus van de histotripsybron toe als het midden van de bellenwolk (Figuur 3).
  12. Noteer de gedetecteerde focale locatie (stap 4.11) in het beeldvormingsvenster(Figuur 3). Een mogelijke manier om de focuspositie te markeren, is het plaatsen van een cursor om de locatie in het beeldvenster te noteren, indien beschikbaar met het beeldvormingsplatform.
  13. Stop met insonatie en stel de spanning die wordt toegepast op de histotripsybron in op 0 V.

5. Stolselpreparaat

  1. Verwijder het stolsel uit de pipet door het verzegelde uiteinde met een tang door te snijden. Laat het stolsel samen met het serum in een petrischaaltje glijden. Als het stolsel niet losraakt, oefen dan voorzichtig druk uit vanaf het andere uiteinde van de pipet via zoutoplossingspoeling om het stolsel te verwijderen.
  2. Snijd het stolsel tot 1 cm lengte met behulp van een scalpel, gericht op een uniform stuk vanuit het midden (d.w.z. weg van delen van het stolsel gevormd aan de boven- of onderkant van de pipet).
  3. Gebruik een reinigingsdoekje om het gesneden deel van het stolsel voorzichtig te deppen om overtollig vocht te verwijderen.
  4. Plaats met een pincet het stolselgedeelte voorzichtig op een weegschaal en noteer het gewicht.
  5. Til het stroomkanaal handmatig uit de watertank en verwijder het modelvat uit het stroomkanaal.
  6. Plaats het stolsel met een pincet in het modelvat en bevestig het modelvat opnieuw aan het stroomkanaal.
    OPMERKING: Een nylon staaf kan in het modelvat worden geplaatst om te voorkomen dat het stolsel stroomafwaarts beweegt als gevolg van de stroom.
  7. Laat het stroomkanaal in de tank zodanig zakken dat het proximale uiteinde van het stadium ten opzichte van het reservoir laag is in vergelijking met de distale kant. Het op deze manier hengelen van het podium voorkomt het vangen van bellen in het modelvat wanneer plasma door het stroomkanaal wordt getrokken in stap 6.1.
  8. Voeg met een pipet 30 ml plasma toe aan het reservoir en controleer de temperatuur totdat deze ten minste 36 °C bereikt.
  9. Gebruik een pipet om de rt-PA (80,4 μg in 30 ml plasma, 2,68 μg/ml) in het plasmareservoir te spuiten. Roer het plasma met de pipet om een uniforme rt-PA-verdeling in het reservoir te garanderen.

6. Het stroomkanaal prikken

  1. Trek plasma via de spuitpomp in het stroomkanaal van het reservoir totdat het plasma het modelvat vult.
    OPMERKING: Als het stolsel niet gelijk is met de nylon staaf, gebruik dan korte pomptrekkingen bij 60 ml / min om te proberen het plasma stroomafwaarts van het stolsel te dwingen of handmatig door de spuit te trekken. Beperk de hoeveelheid plasma die in dit proces wordt getrokken of vul het reservoir bij met extra plasma/rt-PA om ervoor te zorgen dat 30 ml oplossing in het stroomkanaal zit.
  2. Lijn met behulp van de gemotoriseerde positioners de beeldarray parallel aan de lengte van het stolsel uit met behulp van het beeldvormingsscript (stap 4.7). De parallelle uitlijning stelt de gebruiker in staat om visueel te zorgen voor een juiste plaatsing van het stolsel en de afwezigheid van bubbels in het modelvat.
  3. Egaliseert het modelvat handmatig en visueel zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn met behulp van het beeldvormingsvenster (stap 4.7).

7. Experimenteerprocedure

  1. Voorbehandeling
    OPMERKING: Deze stap is om een pad te plannen voor de histotripsy bron / beeldvorming array voor uniforme histotripsy blootstelling langs stolsel lengte.
    1. Lijn de beeldarray uit met behulp van de gemotoriseerde positioners, zodat het beeldvlak evenwijdig is aan de doorsnede van het stolsel (d.w.z. loodrecht op de oriëntatie beschreven in stap 6.2).
    2. Verplaats onder begeleiding via het beeldvormingsvenster (stap 4.7) de histotripsiebron naar het proximale uiteinde van het stolsel ten opzichte van het reservoir met behulp van de gemotoriseerde positioners. Pas op dit punt de histotripsiebronpositie zodanig aan dat het gemarkeerde brandpunt in stap 4.12 wordt uitgelijnd met het midden van het stolsel.
    3. Bepaal het insonatiepad langs de stolsellengte. Om dit pad te definiëren, stelt u drie waypoints in langs de lengte van het stolsel (d.w.z. posities van de motoren waar histotripsy bubbelactiviteit zich in het stolsel bevindt) in stappen van 5 mm. Lijn de waypoints zo uit dat de totale beweging van de histotripsybron langs het pad antegrade is met de stroming in het systeem (d.w.z. het eerste waypoint bevindt zich aan het meest proximale uiteinde van het stolsel ten opzichte van het reservoir en het derde waypoint bevindt zich in de distale positie ten opzichte van het reservoir).
    4. Voordat elk waypoint wordt voltooid, vuurtestpulsen van de histotripsybron met dezelfde insonatieparameters als stap 4.8, maar verminder de totale blootstelling tot 10 totale pulsen. Pas indien nodig de positie van de histotripsybron aan met behulp van de gemotoriseerde positioners om bubbelactiviteit in het stolsel te bevatten.
    5. Sla op elk waypoint de motorposities op met behulp van de commando's van de fabrikant, vergelijkbaar met stap 4.1.
  2. Behandeling
    OPMERKING: Deze stap definieert de procedure om het stolsel over de lengte te behandelen volgens het pad dat is gedefinieerd in de voorbehandelingsstap.
    1. Zet de spuitpomp op 0,65 ml/min en wacht tot de meniscus van het plasma beweegt. Dit debiet bootst een bijna totale occlusie van de iliofemorale vasculatuur24,34na.
    2. Interpoleer het pad dat in stap 7.1.3 is gemaakt met tussenstappen tussen de vastgestelde waypoints met een vaste stapgrootte (bijvoorbeeld 0,5 mm). De stapgrootte wordt gekozen om kleiner te zijn dan de helft van de breedte van het brandpuntsgebied zoals gemeten langs de stolsellengte (hoogterichting van de beeldreeks). Verplaats de histotripsybron met gemotoriseerde positioners op elke padlocatie met insonatieparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.8.
    3. Monitor/beeldbelactiviteit tijdens het aanbrengen van de histotripsiepuls op elke padlocatie met behulp van het beeldvormingsvenster (stap 4.7). Centreer de afbeelding op de histotripsy focus met de afbeeldingsafmetingen van 15 mm in het azimut en bereik. Voorafgaand aan de toepassing van histotripsy-puls op elke locatie, verwerft u een B-modusbeeld om visualisatie van het stolsel en het modelvat te bieden, door een script in een programmeerplatform te maken. Zorg ervoor dat het script communicatie met de scanner tot stand brengt met behulp van de opdrachten van de fabrikant.
    4. Implementeer tijdens de toepassing van de histotripsiepuls de verwerving van akoestische emissies in het script in stap 7.2.3 om passieve cavitatiebeelden te vormen na hoc35. Verkrijg één passief cavitatiebeeld na elke 10 behandelingspulsen. Pas een vlakke tijdwinstcompensatie van 50 toe op 8 incrementele diepten tot het einde van de beelddiepte. Kies een geschikte grootte van het acquisitievenster, zodat het volledige signaal van het stolsel wordt opgevangen met minimaal energieverlies als gevolg van vensters35.
    5. Als er off-target bellenwolken aanwezig zijn, past u de positie van de transducer ter plaatse aan met de gemotoriseerde positioners.
      OPMERKING: Controleer op gemiste triggers van de imaging array. Pas het aantal verkregen beeldgegevenssets aan om ervoor te zorgen dat de opslag van gegevens is voltooid voordat deze vervolgens wordt geactiveerd.

8. Procedure na het experiment

  1. Til het modelvat handmatig uit de watertank om het perfusaat via de zwaartekracht af te tappen. Zorg ervoor dat het stroomkanaal waterpas blijft om te voorkomen dat het stolsel stroomafwaarts en uit het modelvat beweegt tijdens het aftappen.
  2. Verzamel het volledige perfusaat voor verdere analyse in een klein bekerglas (figuur 4A) door plasma-oplossing uit het stroomkanaal door de spuitpomp te trekken met een zeer laag debiet.
  3. Koppel het modelvat los en verwijder het stolsel. Injecteer indien nodig een kleine hoeveelheid zoutoplossing in het modelvat om het stolsel voorzichtig los te maken.
  4. Veeg het stolsel af zoals in stap 1.2.3. Weeg het stolsel op de weegschaal om het verlies van de stolselmassa te beoordelen.
  5. Om het D-dimeergehalte te analyseren, voegt u 100 mg aminocaproïnezuur toe aan een microcentrifugebuis gevolgd door 1 ml perfusaat en mengt u goed met een pipet. Voer een latex immuun-troebele test uit om het D-dimeer in het monster te kwantificeren36.
  6. Om hemolyse te beoordelen, voegt u 1 ml perfusaat toe aan centrifugebuizen en draait u gedurende 10 minuten bij 610 x g (3.500 tpm). Combineer 0,5 ml supernatant (concentraat) met 0,5 ml Drabkins-oplossing en laat het mengsel gedurende 15 minuten op kamertemperatuur rusten. Breng 200 μL over op putplaten, zoals weergegeven in figuur 4B. Gebruik een plaatlezer om absorptie bij 540 nm af te lezen, figuur 4C (Drabkins-test37).
  7. Histologie beoordeling
    1. Snijd een gedeelte uit het midden van het stolsel van ongeveer 2-3 mm lang met een scalpel.
    2. Voeg de sectie toe aan een cassette. Behoud de oriëntatie van de sectie ten opzichte van de richting van de histotripsy pulsvoortplanting.
    3. Voeg 2 ml lage geleer agarose-oplossing bereid in stap 3.2.5 toe aan de cassette om het stolsel op zijn plaats te fixeren.
    4. Bevestig het monster gedurende 24 uur in 10% formaline. Plaats het monster na 24 uur in 70% alcohol en voer standaard hemotoxyline-eosinekleuring uit38.

9. Passieve cavitatiebeeldanalyse

  1. Verwerk de signalen die tijdens de histotripsie-excitatie (stap 7.2.4) van de beeldarray zijn verkregen met behulp van een algoritme op basis van de robuuste Capon beamformer39 om een beeld te creëren van akoestische emissies gegenereerd door de bellenwolk op elke behandelingslocatie.
    OPMERKING: Om kwantitatieve afbeeldingen te genereren, volgt u de stappen die worden beschreven in Haworth et al.35. Anders moet elke pixelwaarde in de afbeelding de relatieve akoestische energie van de bellenwolk (eenheden van V2) op elke overeenkomstige locatie vertegenwoordigen.
  2. Segmenteer de B-modusafbeelding die in stap 7.2.3 is vereist om onderscheid te maken tussen de pixels die het stolsel vertegenwoordigen en het modelvat.
  3. Registreer het passieve cavitatiebeeld samen met het B-modusbeeld zoals weergegeven in figuur 5B. Som de akoestische energie in het stolsel op gedurende de blootstellingsperiode35.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol dat in deze studie wordt geschetst, benadrukt de details van veneuze stolselmodellering, lysotripsie voor stolselverstoring en echografie in een in vitro opstelling van DVT. De goedgekeurde procedure toont de stappen die nodig zijn om stolselverstoring te beoordelen als gevolg van de gecombineerde effecten van rt-PA en histotripsy bubble cloud-activiteit. De benchtopopstelling is ontworpen om de kenmerken van een veneuze iliofemorale ader na te bootsen. Figuur 1A toont een model...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het voorgestelde protocol presenteert een model om de werkzaamheid van lysotripsy bij de behandeling te kwantificeren. Hoewel de belangrijkste details zijn besproken, zijn er bepaalde kritieke aspecten waarmee rekening moet worden gehouden voor het succes van dit protocol. De enzymatische activiteit van rt-PA heeft een Arrhenius temperatuurafhankelijkheid30. Temperatuur is ook een factor die bijdraagt aan de snelheid van geluid in water en weefsel, en variaties in temperatuur kunnen kleine verande...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health, Grant R01HL13334. De auteurs willen Dr. Kevin Haworth bedanken voor het assisteren bij drabkin's test en Dr. Viktor Bollen voor zijn steun bij het ontwerpen van het protocol. De auteurs zijn ook Dr. Adam Maxwell dankbaar voor zijn begeleiding bij het ontwerpen van de histotripsy bron.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorbing sheetsPrecisie-akoestiekF28-SMALL-M300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicat Pasteur pijpenFisher Scientific1367820A14,6 cm lengte, 2 mL capaciteit
Centrifuge tubesEppendorf223641111,5 mL capaciteit
Drabkin's assaySigma AldrichD5941-6VL
Teken spuitCole-ParmerEW-07945-4360 mL capaciteit
FilterzakkenMcMaster-Carr5162K111Verwijdering van deeltjesgrootte tot 1 micron
Flow kanaal buizenMcMaster-Carr5154K25Polyethyleen-gecoate EVA kunststof buizen (Buitendiameter: 3/8", Binnendiameter: 1/4")
VerwarmingselementenWon BrothersHT 300 TitaniumTitanium staven geplaatst op de bodem van de tank
Beeldvorming arrayVerasonicsL11-5v128 element met gevoeligheid van -55 tot -49 dB
Laag gelerende agaroseMillipore SigmaA9414
Model vatMcMaster-Carr5234K986,6 cm lengte, 0,6 cm binnendiameter, 1 mm dikte
Nanopure waterBarnsteadNanopure DiamondASTM type I, 18 Mohm-cm weerstand
PlasmaVitalant4PF000Plasma ingevroren binnen 24 uur
PlaatlezerBiotekSynergy Neo HST Plate ReaderVoor hemoglobine kwantificering
Probe coverCivco610-362
ProgrammeerplatformMATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant weefseltype plasminogeenactivator (rt-PA)GenentechActivase
ReservoirCole-ParmerEW-07945-4360 mL capaciteit
SpuitpompCole-ParmerEW-74900-20pomp bevestigd aan de spuit om de stroom in het stroomkanaal met een vooraf bepaalde vaste snelheid te trekken
TransducerIn-house customizedAcht-element, elliptisch gefocuste transducer (9 cm grote as, 7 cm kleine as en 6 cm brandpuntsafstand), aangedreven door een op maat gemaakte en gebouwde klasse D versterker en matching netwerk
Ultrageluid scan systeemVerasonicsVantage Research Ultrageluid Systeem
WatertankAdvanced acrylicsC13314 x 14 x 12, 1/2"

Referenties

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953(2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117(2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083(2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Histotripsiebehandelingdiepe veneuze trombosegefocust ultrageluidgenereren van bellenwolkenpassieve cavitatiebeeldvormingverlies van stolselmassarecombinant weefselplasminogeenactivatorin vitro trombolyseafgifte van lytische geneesmiddelen
Een in vitro systeem om de trombolytische werkzaamheid van histotripsie en een lytisch medicijn te meten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.