Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van biofilmdispersie in muriene wonden

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62136

⸱

7 augustus 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we ex vivo en in vivo methoden voor het beoordelen van bacteriële dispersie van een wondinfectie bij muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van topische antimicrobiële en antibiofilmtherapieën te testen, of om de dispersiecapaciteit van verschillende bacteriestammen of soorten te beoordelen.

Samenvatting

Biofilm-gerelateerde infecties zijn betrokken bij een breed scala aan chronische aandoeningen zoals niet-genezende diabetische voetzweren, chronische sinusitis, terugkerende otitis media en nog veel meer. Microbiële cellen binnen deze infecties worden beschermd door een extracellulaire polymere stof (EPS), die kan voorkomen dat antibiotica en gastheerimmuuncellen de infectie verwijderen. Om dit obstakel te overwinnen, zijn onderzoekers begonnen met het ontwikkelen van dispergeermiddelen als potentiële therapieën. Deze middelen richten zich op verschillende componenten in de biofilm EPS, verzwakken de structuur en initiëren de verspreiding van de bacteriën, wat theoretisch de potentie van antibiotica en immuunklaring kan verbeteren. Om de werkzaamheid van dispersiemiddelen voor wondinfecties te bepalen, hebben we protocollen ontwikkeld die biofilmdispersie zowel ex vivo als in vivo meten. We gebruiken een muis chirurgisch excisiemodel dat goed is beschreven om biofilm-geassocieerde chronische wondinfecties te creëren. Om de dispersie in vivote controleren, infecteren we de wonden met bacteriële stammen die luciferase uitdrukken. Zodra volwassen infecties zijn vastgesteld, irrigeren we de wonden met een oplossing die enzymen bevat die componenten van de biofilm EPS afbreken. Vervolgens monitoren we de locatie en intensiteit van het lichtgevende signaal in de wond en filteren we organen om informatie te geven over het bereikte verspreidingsniveau. Voor ex vivo analyse van biofilmdispersie wordt geïnfecteerd wondweefsel ondergedompeld in biofilmafbrekende enzymoplossing, waarna de bacteriële belasting die in het weefsel achterbleef, versus de bacteriële belasting in oplossing, wordt beoordeeld. Beide protocollen hebben sterke en zwakke punten en kunnen worden geoptimaliseerd om de effectiviteit van dispersiebehandelingen nauwkeurig te bepalen.

Inleiding

De toename van antibioticaresistentie wereldwijd leidt tot een gebrek aan antibioticaopties om een verscheidenheid aan bacteriële infecties te behandelen1. Naast antibioticaresistentie kunnen bacteriën antibioticatolerantie krijgen door een biofilm-geassocieerde levensstijl aan te nemen2. Een biofilm is een gemeenschap van micro-organismen die worden beschermd door een matrix van polysachariden, extracellulair DNA, lipiden en eiwitten3, gezamenlijk de extracellulaire polymere stof (EPS) genoemd. Naarmate de antibioticaresistentiecrisis voortduurt, zijn nieuwe strategieën nodig die het gebruik van antibiotica verlengen of de werkzaamheid ervan versterken. Anti-biofilmmiddelen zijn een veelbelovende oplossing4.

Onder de verschillende anti-biofilmstrategieën die zijn voorgesteld, loopt het gebruik van dispergeermiddelen, die zich richten op verschillende componenten van de biofilm EPS, voorop in de therapeutische ontwikkeling5. Glycosidehydrolasen (GH) zijn zo'n klasse van dispergeermiddel. GH zijn een grote klasse enzymen die het decolleté van verschillende bindingen binnen de polysachariden katalyseren die structurele integriteit bieden aan de EPS. Onze groep, evenals anderen, hebben aangetoond dat GH biofilms effectief kan afbreken, dispersie kan induceren en de werkzaamheid van antibiotica kan verbeteren voor een aantal verschillende bacteriesoorten, zowel in vitro als in vivo6,7,8,9,10,11.

Met een groeiende interesse in biofilm dispersie, is het belangrijk om effectieve methoden te ontwikkelen die de dispersie-werkzaamheid beoordelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de behandeling van biofilm-geassocieerde wondinfecties met een dispergeermiddel bij muizen, en de beoordeling van de dispersie-werkzaamheid, in vivo en ex vivo. Het algemene doel is om effectieve methoden te bieden die kunnen worden gebruikt met preklinische modellen om biofilmdispersie effectief en efficiënt te meten.

Een murien chirurgisch excisie infectiemodel werd in deze studies gebruikt om een biofilm-geassocieerde infectie vast te stellen. We gebruiken dit model al meer dan 15 jaar en publiceerden onze observaties uitgebreid7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Over het algemeen is dit een niet-dodelijk infectiemodel waarbij bacteriën gelokaliseerd blijven in het wondbed en biofilm-geassocieerd zijn (bacteriën gezien in aggregaten omringd door EPS), waardoor een chronische infectie wordt opgezet die tot 3 weken duurt. Als muizen echter immuungecompromitteerd zijn (met type 1 diabetes bijvoorbeeld), kunnen ze vatbaarder worden voor het ontwikkelen van een fatale systemische infectie in dit model.

In dit rapport bieden we protocollen voor het beoordelen van de verspreiding van bacteriën uit een wond, zowel in vivo als ex vivo. Beide protocollen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van een dispergeermiddel te onderzoeken en hebben hun eigen sterke en zwakke punten. Het beoordelen van dispersie in vivo kan bijvoorbeeld belangrijke, realtime informatie opleveren over de verspreiding van bacteriën naar andere delen van het lichaam na dispersie en hoe de gastheer reageert. Aan de andere kant kan het beoordelen van dispersie ex vivo wenselijker zijn voor het screenen van meerdere middelen, doses of formuleringen, omdat het weefsel kan worden onderverdeeld in meerdere secties die afzonderlijk kunnen worden getest, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Bij het beoordelen van meerdere middelen meten we meestal dispersie eerst in vitro zoals eerder beschreven 6,9,22. Vervolgens testen we de meest effectieve ex vivo en reserveren we in vivo testen voor een beperkt aantal veelbelovende middelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit dierprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Texas Tech University Health Sciences Center (protocolnummer 07044). Deze studie is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid.

1. Bacteriën voorbereiden op muizeninfecties

OPMERKING: Hier beschrijven we het infecteren van muizen alleen met Pseudomonas aeruginosa. Andere bacteriesoorten kunnen echter worden gebruikt om infectie te veroorzaken. Bacteriële stammen en materialen worden beschreven in de tabel met materialen.

  1. Gebruik Pseudomonas aeruginosa wild-type stam PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux23 voor deze experimenten zoals eerder beschreven7.
  2. Kweek P. aeruginosa stammen in verbijsterde Erlenmeyer kolven, met schudden bij 200 tpm, in Luria-Bertani (LB) bouillon bij 37 °C gedurende 16 tot 20 uur. Voeg een eindconcentratie van 100 μg/ml ampicilline toe aan de nachtcultuur van PAO1 (pQF50-lux) voor het behoud van de plasmide.
  3. Subcultuur P. aeruginosa door 100 μL van de nachtcultuur toe te voegen aan een Erlenmeyerkolf met 10 ml LB bouillon met een eindconcentratie van 100 μg/ml ampicilline. Groei vervolgens gedurende 2-2,5 uur bij 37 °C met schudden, tot een OD600 nm van 0,4 en verdun vervolgens drie keer serieel (1:10) voor een infecterende dosis van ongeveer 104 cellen.

2. Bereiding van biofilmdispersie-enzym

OPMERKING: Voor deze studie gebruiken we een 10% oplossing van gelijke delen amylase en cellulase (5% van elk), die "GH" zal worden genoemd, voor de dispersiebehandeling.

  1. Gebruik een 10% GH-oplossing (m/v) amylase (van Bacillus subtilis) en schimmel cellulase (uit Aspergillus niger) verdund in 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Gebruik PBS als behandeling voor voertuigbesturing.
  2. Verwarm alle behandelingen tot 37 °C gedurende 30 minuten voor enzymactivering.

3. Proefdieren en preoperatieve opstelling

  1. Huismuizen, 5 nestgenoten per kooi, in omgevingsgecontroleerde omstandigheden, met 12 uur licht/donker cycli en goede toegang tot voedsel en water.
  2. Gebruik bij voorkeur vrouwelijke Zwitserse Webster-muizen, tussen de 8 en 10 weken oud.
  3. Weeg muizen om de juiste hoeveelheid anesthesie te bepalen om toe te dienen.
  4. Anesthesie toedienen door de intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine 10 mg/kg xylazine.
  5. Breng oogcrème (bijv. Refresh P.M.) voorzichtig aan op het oog met een wattenstaafje om de droogheid te verminderen.
  6. Bewaak fysiologische parameters, waaronder ademhalingsfrequentie, huidskleuring en lichaamstemperatuur tijdens de operatie.

4. Dorsale volledige dikte excisie chirurgie

  1. Beoordeel het chirurgische anesthesievlak door teenknijpen en monitoring van de ademhalingsfrequentie en inspanning. Scheer het dorsale oppervlak en breng een ontharingscrème aan gedurende 10 minuten (of volgens de instructies van het product), waarna voorzichtig wordt verwijderd, zodat de huid droog is.
  2. Voor pijnbestrijding, toegediend 0,05 ml lidocaïne subcutaan in het te verwijderen gebied, en injecteer 0,02 ml buprenorfine subcutaan in het nekvel. Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de pijnbestrijding is bereikt.
  3. Desinfecteer voor de excisie het dorsale oppervlak met een alcoholdoekje en teken een cirkel met een diameter van 1,5 cm naar het achterste deel van de rug. Zorg voor een steriel chirurgisch veld tijdens de hele procedure en gebruik autoclaafinstrumenten en steriele handschoenen. Om besmetting te beperken, voert u de operatie uit met een brandende Bunsen-brander en gebruikt u schoon gereedschap voor elk dier.
  4. Dien een volledige dikte, excisionale huidwond toe aan het niveau van panniculus spier met chirurgische schaar.
  5. Bedek na excisie onmiddellijk wonden met een semipermeabel polyurethaanverband.
  6. Injecteer ongeveer 104 KVE bacteriën in 100 μL PBS onder het verband, op het wondbed, om een infectie vast te stellen.
    OPMERKING: Wonden kunnen ook worden geïnfecteerd met meerdere soorten bacteriën en/of schimmels tegelijkertijd, of door voorgevormde biofilms12, of zelfs debridement weefsel geëxtraheerd van patiënten19, op het wondbed te plaatsen.
  7. Plaats na infectie muizen in de kooi met verwarmingskussens en controleer totdat ze hun juiste reflex hebben herwonnen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat muizen niet koud worden, omdat dit tot de dood kan leiden.
  8. Stel wondinfecties vast gedurende 48 uur.
  9. Inspecteer dagelijks kleefverbanden op scheuren en gebieden zonder hechting en indien nodig vervangen.

5. In vivo dispersiebehandeling

OPMERKING: Hier beschrijven we de toediening van de dispergeermiddelen door een reeks van 3 topische wondirrigatieoplossingen aan te brengen (Figuur 1). Het protocol kan echter worden aangepast voor andere soorten levering, zoals het aanbrengen van gels, crèmes of verbanden.

  1. Plaats muizen onder isofluraan anesthesie (bij 3% en 1 L per minuut zuurstof) tijdens het toedienen van de behandelingen.
  2. Bereid drie spuiten van 1 ml voor, met naalden van 25 G, die 200 μL behandeling voor elke muis bevatten.
  3. Injecteer 200 μL enzymoplossing of PBS-controle op de wond door de huid voorzichtig op te tillen en te knijpen met een tang, iets boven de wond naar het hoofd van het dier. Prik de spuit voorzichtig door de opgetilde huid en injecteer langzaam de oplossing tussen het verband en het wondbed. Het verband dat in deze studie wordt gebruikt, hecht zich vaak aan zowel het wondbed als het omliggende weefsel.
    1. Om ervoor te zorgen dat het hele wondbed bedekt is met een oplossing, tilt u het verband voorzichtig op met een tang, trekt u het weg van het wondbed en injecteert u de oplossing langzaam.
  4. Plaats muizen na de behandeling 30 minuten terug in hun kooien.
  5. Na 30 minuten blootstelling aan de behandeling, verdoof de muizen opnieuw met isofluraan en aspireer de oplossing met een spuit, zorg ervoor dat u in hetzelfde gebied prikt als voorheen.
    OPMERKING: Deze aangezogen oplossing bevat gedispergeerde bacteriële cellen, die kunnen worden opgeslagen voor verschillende downstream-analyses.
  6. Dien de tweede en derde irrigatiebehandeling toe als de eerste, met elke keer een nieuwe spuit.

6. In vivo dispersie beeldvorming en analyse

OPMERKING: Als een lichtgevende bacteriestam wordt gebruikt om een infectie te initiëren, kan een In Vivo Imaging System (IVIS) worden gebruikt om de verspreiding vanuit het wondbed te visualiseren.

  1. Afbeelding muizen vlak voor en na de behandeling en bij 10 en 20 uur na de behandeling (figuur 2 en aanvullende figuur 1).
  2. Voer beeldvorming uit terwijl muizen onder narcose zijn door ze individueel in het IVIS te plaatsen en ze elk gedurende 5 s op een golflengte van 560 nm te plaatsen. Sla afbeeldingen op voor verdere analyse.
    OPMERKING: De optimale golflengte en belichtingstijd zijn afhankelijk van de gebruikte verslaggever en het IVIS-instrument en de beeldvormingssoftware.
  3. Open voor analyse afbeeldingen in de IVIS-software en selecteer het gebied dat moet worden geanalyseerd in het toolpalet.
  4. Om rekening te houden met de achtergrond, plaatst u een cirkel op de achtergrond van een foto en plaatst u vervolgens dezelfde cirkel van dezelfde grootte bovenop het wondbed voor elke muis.
  5. Als u meetwaarden wilt uploaden, selecteert u ROI-metingen (Region of Interest) weergeven > regio en uploadt u de tabel met metingen naar een spreadsheet. Trek de achtergrondcirkel af van elk van de wondbedmetingen om de luminescentie voor elk monster te berekenen. Bereken percentage luminescentie gewijzigd door:
    ROI pre-treatment-ROI nabehandeling/ ROI pre-treatment) x 100.
    OPMERKING: Controle- en behandelde muizen moeten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te normaliseren op variabelen die van invloed kunnen zijn op het verkrijgen of de uitstraling van het beeld.

7. Dispersie beoordelen door CFU te bepalen

  1. Humane euthanaseren muizen door de intraperitoneale injectie van 0,2 ml pentobarbitaal natrium (bijv. Fatal Plus) onder anesthesie met 100 mg/kg ketamine 10 mg/kg xylazine.
  2. Oogst wondbedweefsel door eerst het verband voorzichtig te verwijderen met steriele tang en snijd vervolgens rond de omtrek van het wondbed met een steriele chirurgische schaar. Til voorzichtig het ene uiteinde van het wondbed op met een tang terwijl u een schaar gebruikt om het monster van de spierlaag af te snijden/ plagen.
  3. Plaats weefsel uit het wondbed in voorgelabelde en voorgewogen homogenisatiebuis van 2 ml met 1 ml PBS. Weeg de buizen opnieuw na het inbrengen van de monsters en keer vervolgens voorzichtig 3-5 keer om om eventuele verspreide of losjes aangehechte bacteriën af te spoelen en de PBS te verwijderen. Voeg 1 ml verse PBS toe.
  4. Om de milt te oogsten, plaatst u muizen in een liggende anatomische positie en zet u ze vast door hun ledematen vast te pinnen op een dissectieoppervlak. Week het te ontleden gebied met 70% ethanol om het gebied te desinfecteren en te voorkomen dat de vacht het monster verontreinigt.
  5. Maak voorzichtig een kleine incisie loodrecht op de middellijn met een chirurgische schaar in de dermis van de onderbuik, zorg ervoor dat u de huid op en af trekt van de interne organen. Ga verder met de incisie naar binnen, langs de middenlijn, totdat het borstbeen werd bereikt. Zodra de peritoneale holte werd blootgesteld en de inwendige organen zichtbaar waren, scheid je de milt voorzichtig van het bindweefsel en plaats je deze in een aparte homogenisatiebuis.
  6. Weeg de milt af en spoel af met PBS, zoals beschreven voor het wondbedweefsel.
    OPMERKING: Andere organen van belang kunnen op dezelfde manier worden geoogst.
    1. Let er bij het maken van de eerste incisie op dat u de darmen of andere organen niet doorprikt.
  7. Homogeniseer monsters in voorgevulde kraalmolenbuizen van 2 ml met behulp van een benchtop homogenisator op 5 m/s gedurende 60 s, tweemaal.
  8. Om CFU op te sommen, verdun monsters en spotplaat op selectieve agar. Voor seriële verdunning pipeteert u 100 μL van het monster in 900 μL PBS in een buis van 1,5 ml, vortex, en herhaalt u dit 5 keer. Pipet 10 μL van elke verdunning op een agarplaat zoals weergegeven in figuur 3.
    OPMERKING: Als een nauwkeurigere CFU-kwantificering vereist is, verdeel dan 100 μL van elke verdunning van het monster over afzonderlijke agarplaten.

8. Ex vivo beoordeling van dispersie ( Figuur4)

  1. Wond muizen en infecteren met ongeveer 104 PAO1 zoals hierboven beschreven, en euthanaseren vervolgens 48 uur na infectie.
  2. Verwijder het verband voorzichtig met een tang, met behulp van steriele techniek en zonder het wondbed te verstoren.
  3. Gebruik een steriele chirurgische schaar om de omtrek van het wondbed weg te snijden van de niet-geïnfecteerde huid door een tang te gebruiken om het ene uiteinde van het wondbed op te tillen en een schaar om geïnfecteerd wondweefsel uit de spierlaag eronder en het omringende niet-geïnfecteerde weefsel te verwijderen. Verdeel gewikkelde bedmonsters in gelijke delen of gebruik ze in hun geheel.
  4. Plaats wondweefsel in lege, voorgewogen 2 ml kraalmolen homogeniserende buizen. Weeg vervolgens de buizen opnieuw na het toevoegen van het monster. Bereken het gewicht van het monster door:
    gewicht na het toevoegen van monster - gewicht voordat u het monster toevoegt.
  5. Voeg 1 ml PBS toe en draai de buis 3-5 keer voorzichtig om om het monster te spoelen en eventuele planktonische cellen te verwijderen. Verwijder en gooi de PBS weg.
  6. Voeg 1 ml GH-behandeling (of PBS als negatieve controle) toe aan het monster en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C met schudden bij 80 tpm.
  7. Verwijder de biofilmdispersieoplossing en plaats deze in een aparte buis van 1,5 ml. Dit bevat de verspreide cellen.
  8. Voeg 1 ml PBS toe aan het resterende weefselmonster en keer voorzichtig 3-5 keer om om eventuele resterende gedispergeerde cellen af te spoelen. Verwijder en gooi de PBS weg.
  9. Voeg 1 ml PBS toe aan het resterende weefsel en homogeniseer bij 5 m/s gedurende 60 s met behulp van een benchtop homogenisator.
  10. Verdun de oplossing van gedispergeerde cellen en het gehomogeniseerde weefselmonster serieel door 100 μL monster in 900 μL PBS in een buis van 1,5 ml te plaatsen en vijf keer te herhalen voor in totaal 6 verdunningen.
  11. Spotplaat 10 μL van elke verdunning op mediaselectieve agar (bijv. Pseudomonas Isolation Agar voor P. aeruginosa) en incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
  12. Tel de KVE en bereken het 'percentage gedispergeerd' als (CFU in supernatant/ (CFU in supernatans+ CFU in biofilmweefsel)) x 100.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit experiment werden 8-10 weken oude vrouwelijke Zwitserse Webster muizen geïnfecteerd met 104 KVE van PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux. Zoals hierboven beschreven, mocht een infectie gedurende 48 uur worden vastgesteld voordat 3 x 30 minuten behandelingen van PBS (voertuigcontrole) of 10% GH (behandeling) werden toegediend om de biofilm EPS te verteren. Muizen werden voor de behandeling afgebeeld, direct na de behandeling (0 uur) en om 10 uur en 20 uur na de behandeling. F...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van biofilmdispersiemiddelen te bestuderen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan gebruik met verschillende soorten dispergeermiddelen, bacteriesoorten of ex vivo monsters, waaronder klinische debridement monsters. Dit protocol biedt ook een klinisch relevant model om gedispergeerde bacteriële cellen te verzamelen en te bestuderen. Het is aangetoond dat de fenotypen van gedispergeerde bacteriële cellen verschillen van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de Ted Nash Long Life Foundation, de Jasper L. en Jack Denton Wilson Foundation en het Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher14823434Gebruik voor het uitvoeren van seriële verdunningen van monsters
25G 58 in naaldFisher14823434Kan worden bevestigd aan 1 mL spuit
Ampicillin Sodium SaltFisherBP1760-5Maak een 50 mg/ mL stamoplossing en voeg 100 µL toe aan 10 mL LB-bouillon voor zowel overnacht als subcultuur
AmylaseMP Biomedicals2100447Maak een 5% w/v oplossing, vortex - andere dispersiemiddelen kunnen worden gebruikt
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)ZooPharmRX216118Gebruik voor pijnbeheersing - andere opties kunnen worden gebruikt
CellulaseMP Biomedicals2150583Voeg 5% w/v toe aan de 5% w/v amylase oplossing, vortex, activeer bij 37 °C gedurende 30 min - andere dispersiemiddelen kunnen worden gebruikt
Depilatory creamWalmart287746Gebruik een kleine hoeveelheid om in de haarzakjes op de rug van het dier te masseren en geef 10 min de tijd om haar te verwijderen
Dressing Forceps, Gerande PuntenFisher12-460-536Kan andere vormen van pincetten gebruiken
Erlenmeyer kolven met windafsluiter 125 mLFisher101406Gebruik om overnachten en subcultuurs van bacteriën te laten groeien
FastPrep-24 Benchtop HomogenizerMP Biomedicals6VFV9Gebruik 5 m/s gedurende 60 s twee keer om weefsel te homogeniseren
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68Injecteer 0.2 mL intraperitoneal voor elke muis
Homogeniseringsbuizen (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metaal)Fisher15340151Gebruikt om monsters te homogeniseren voor plateren
IsofluraneDiamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride oplossing C-IIINSigma AldrichK4138Gebruik als anesthesie - andere opties kunnen ook worden gebruikt om een chirurgisch veld van anesthesie te verkrijgen
LB-bouillon, MillerFisherBP1426-2Voeg 25 g/L toe en autoclaveer
Lidocaine 2% InjecteerbaarDiamond Back Drugs2468Injecteer 0.05 mL door de zijkant van het gemarkeerde wondgebied zodat het in het midden van de markering wordt afgezet. Geef 10 min voor het snijden
MeropenemSigma AldrichPHR1772-500MGMaak 5 mg/mL om toe te voegen aan de GH-oplossing om lokaal aan te brengen en een 15 mg/mL oplossing om intraperitaneal te injecteren 4 uur voorafgaand en 6 uur na de behandeling
Niet-steriele katoenen gaaszwammenFisher13-761-52Gebruik om de depilatoire crème te verwijderen
PAO1 pQF50-lux bacteriestamRef [13]N/APAO1 pQF50-lux werd gebruikt als de P. aeruginosa-stam van belang in de representatieve resultaten van dit artikel
Petri schotelsFisherPHR1772-500MG
Fosfaat Buffer Saline 10xFisherBP3991Verdun 10x naar 1x voor gebruik
Polyurethaan dressingMckesson66024007Snij de afgeronde rand af en snijd het resterende vierkant in 4 gelijke secties
Pseudomonas isolatie-agarVWR90004-394Voeg 20 mL/L glycerol en 45 g/mL toe aan water, autoclaveer en giet 20 mL in petrischalen
Refresh P.M.WalmartGebruik op de ogen om droogte tijdens de procedure te verminderen.
Steriele Alcohol Prep PadsFisher22-363-750Gebruik om de huid direct voor het wondmaken te reinigen om het gebied te desinfecteren
Rechte Delicate SchaarFisher89515Kan ook gebogen schaar gebruiken
Swiss Webster muizenCharles River551NCISWWEBAndere muizensoorten kunnen worden gebruikt
Syring Slip Tip 1 mLFisher14823434Gebruikt om medicijnen en enzymbehandeling toe te dienen

Referenties

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738(2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632(2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379(2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317(2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518(2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129(2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079(2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462(2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Muiswondmodelchronische wondinfectiedispersiemiddelenextracellulaire polymere substantiein vivo beeldvormingkwantificering van de bacteriële lastex vivo analysepolymicrobiële infectieenzymbehandeling
Beoordeling van biofilmdispersie in muriene wonden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.