Methodenartikel

Flowcytometrie en confocale beeldvormingsanalyse van lage Wnt-expressie in Axin2-mTurquoise2 Reporter-thymocyten

DOI:

10.3791/62141

⸱

24 september 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cell and Chemical Biology, Leiden University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is bekend dat signaalniveaus het lot van cellen reguleren, wat aangeeft dat regulering van Wnt-signalering een interessant therapeutisch doelwit is. Hier beschrijven we flowcytometrie en confocale microscopie-analysemethoden voor een robuust murien canoniek Wnt-signaleringsreportermodel dat verschillende Wnt-signaleringsniveaus meet.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het meten van Wnt-expressieniveaus is essentieel bij het identificeren of testen van nieuwe Wnt-therapeutische doelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat canonieke Wnt-signalering werkt via een doseringsgestuurd mechanisme, wat de noodzaak motiveert om Wnt-signalering in verschillende celtypen te bestuderen en te meten. Hoewel er verschillende reportermodellen zijn voorgesteld om fysiologische Wnt-expressie weer te geven, heeft de genetische context of het reportereiwit een grote invloed gehad op de validiteit, nauwkeurigheid en flexibiliteit van deze tools. Dit artikel beschrijft methoden voor het verkrijgen en analyseren van gegevens die zijn verkregen met het Axin2-mTurquoise2 muis Wnt reportermodel, dat een gemuteerd Axin2em1Fstl allel bevat. Dit model vergemakkelijkt de studie van endogene canonieke Wnt-signalering in individuele cellen over een breed scala van Wnt-activiteit.

Dit protocol beschrijft hoe de activiteit van de Axin2-mTurquoise2-reporter volledig kan worden gewaardeerd met behulp van celpopulatieanalyse van het hematopoëtische systeem, gecombineerd met celoppervlaktemarkers of intracellulaire kleuring van β-catenine . Deze procedures dienen als basis voor implementatie en reproductie in andere interessante weefsels of cellen. Door fluorescentie-geactiveerde celsortering en confocale beeldvorming te combineren, kunnen verschillende canonieke Wnt-expressieniveaus worden gevisualiseerd. De aanbevolen meet- en analysestrategieën bieden kwantitatieve gegevens over de fluorescerende expressieniveaus voor een nauwkeurige beoordeling van canonieke Wnt-signalering. Deze methoden zullen nuttig zijn voor onderzoekers die het Axin2-mTurquise2-model willen gebruiken voor canonieke Wnt-expressiepatronen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canonieke Wnt-signalering is een geconserveerde signaalroute die betrokken is bij de homeostase van gezond weefsel en bij ziekte. Het is aangetoond dat nauwkeurige regulatie van Wnt-signaleringsniveaus belangrijk is voor de embryonale ontwikkeling, maar ook van groot belang is voor volwassen weefsels. Canonieke Wnt-signalering blijkt een belangrijke rol te spelen bij weefselregeneratie van verschillende organen, zoals de darmen, de huid en het hematopoëtische systeem. Wanneer Wnt-signalering wordt gedereguleerd, ontstaan er dus ernstige pathologieën. Colorectale, lever- en huidkanker, neurologische aandoeningen en bepaalde hematologische maligniteiten zijn exemplarische pathologieën waarbij gedereguleerde Wnt-signalering de oorzakelijke factor of bijdrage is1. Daarom worden momenteel verschillende remmers voor verschillende Wnt-doelen getest in klinische onderzoeken als Wnt-geassocieerde kankertherapieën2.

Daarnaast vinden er interessante vorderingen plaats in het therapeutisch potentieel van Wnt voor neurologisch herstel, leeftijdsgebonden neurologische aandoeningen en aangeboren autismespectrumstoornissen 3,4,5. Wnt-signalen zijn onderzocht voor ex vivo expansie van stamcellen voor daaropvolgende transplantatie6. Therapeutische targeting van canonieke Wnt-signalering is echter een moeilijke onderneming vanwege het belang ervan in veel basiscelfuncties en overspraak met andere routes 7,8,9, wat resulteert in de noodzaak om de effecten van deze Wnt-therapeutische middelen nauwkeurig te meten in een gemakkelijk te interpreteren model. Canonieke Wnt-signalering wordt aangedreven door oplosbare Wnt-liganden op korte afstand, die worden uitgescheiden door naburige cellen of als autocriene uitscheiding zoals gerapporteerd in verschillende Wnt-responsieve stamceltypen.

De Wnt Frizzled-receptor en lipoproteïne-receptor-gerelateerd eiwit (LRP) co-receptoren reageren op deze liganden, wat een intracellulaire signaalcascade op gang brengt. Wanneer de Wnt-signalering is uitgeschakeld, voorkomt een vernietigingscomplex bestaande uit asremmer (Axin), tumorsuppressorgenproduct, adenomateuze polyposis coli (APC), caseïnekinase1 (CK1α) en glycogeensynthasekinase (GSK-3β), de accumulatie van β-catenine (CTNNB1) door proteasomale afbraak. Bij Wnt-ligandreceptorbinding wordt het vernietigingscomplex geïnactiveerd, wat leidt tot accumulatie en stabilisatie van β-catenine in het cytoplasma. Het actieve β-catenine kan migreren naar de kern waar het zich bindt aan de transcriptiefactor/lymfoïde enhancer-bindende factor (TCF/LEF) transcriptiefactoren om de transcriptie van Wnt-doelwitgenen te initiëren. Axin2 wordt beschouwd als een doelgen omdat het een direct doelwit is van de Wnt-route10. Bovendien dient Axin2 als een negatieve regulator en als een reportergen voor actieve canonieke Wnt-signalering11,12.

Verschillende canonieke Wnt-signaleringsverslaggevers zijn in de literatuur beschreven en zijn van groot nut geweest bij het begrijpen van de rol van Wnt-signalering in de embryonale ontwikkeling. De meeste van deze reporters maken gebruik van synthetisch ingebrachte TCF/LEF-bindingsplaatsen, die geen endogeen doelwitgen 13,14,15,16,17,18,19 gebruiken. Daarnaast zijn Axin2 knock-in strategieën gebruikt die de natuurlijke locatie van het gen 11,20,21,22,23 respecteren, waarvan Axin2-LacZ algemeen wordt aanvaard als de meest robuuste canonieke Wnt reporter11. Het reportereiwit LacZ, hoewel het in de meeste weefsels gemakkelijk te gebruiken is, vereist echter een β-galactosidasesubstraat, waarvan bekend is dat het hard is voor levende cellen24. Vooral voor stamcellen en thymocyten verhogen de zware LacZ-detectieomstandigheden de celdood (eigen niet-gerapporteerde gegevens) bij het hanteren van celsuspensies.

Hoewel de signaalversterking die door de LacZ-kleuring wordt veroorzaakt, handig is om lage signalen te detecteren, maakt het de kwantificering minder direct en dus aantoonbaar minder betrouwbaar. Daarom werd een muizenreportermodel ontworpen om de genetische strategie van Axin2-LacZ na te bootsen, maar met een mTurquoise2 reporter-eiwit21, om een uitlezing te bieden die directer is en dichter bij de fysiologische expressieniveaus ligt. Het fluorescerende eiwit mTurquoise2 is een uitstekende vervanger voor LacZ vanwege zijn hoge helderheid (kwantumopbrengst (QY) = 0,93), flexibiliteit in combinatie met andere fluorescerende eiwitten voor uitgebreide karakterisering van het celoppervlak en het ontbreken van een exogeen substraat. Bovendien biedt de nauwe genetische verwantschap met groen fluorescerend eiwit (GFP) de mogelijkheid om de meeste GFP-herkennende fluorescerende antilichamen te gebruiken voor sterkere signaaldetectie, indien nodig, in extreem Wnt-gevoelige cellen25.

Het Axin2-mTurquoise2 model is niet alleen een canonieke Wnt reporter, maar biedt ook de mogelijkheid om Axin2 heterozygote en homozygote (Axin2 knock-out) fenotypes te bestuderen. Het gericht inbrengen van mTurquoise2 op de startplaats van Axin2 resulteert in een verstoord Axin2-eiwit21. Aangezien Axin2, ook bekend als Conductin, deel uitmaakt van het Wnt-vernietigingscomplex en het vernietigingscomplex β-catenine-gemedieerde transcriptie streng reguleert, kan de gedeeltelijke of volledige afwezigheid ervan van belang zijn om diverse pathologieën te bestuderen. Bij colorectale kanker zijn de Axin2-spiegels bijvoorbeeld relatief hoog als gevolg van Wnt-hyperactivatie11; Zijn rol in andere pathologieën is echter nog grotendeels onbekend. Hoewel wordt aangenomen dat Axin2 een beperkte rol speelt bij de afbraak van β-catenine, kan zijn rol bij de Wnt-regulatie worden versterkt door de toevoeging van een klein peptide, dat de groei van Wnt-gemedieerde colorectale kanker blokkeert26.

Al met al kan zorgvuldige Wnt-regulatie via Wnt-therapeutische doelen mogelijkheden bieden om het ontstaan of de ontwikkeling van ernstige pathologieën te veranderen en moet verder worden onderzocht in modellen met reportercapaciteit. In dit rapport leggen we onze best-practice analysemethode uit van het Axin2-mTurquoise2 muizenmodel voor flowcytometrie en confocale beeldvorming. In de context van Wnt-doseringsniveaus zijn zeer lage canonieke Wnt-signaleringsniveaus moeilijk te detecteren, waarvoor geavanceerde detectie- en analysemogelijkheden een voordeel bieden om de voordelen van dit model volledig te benutten. Thymocyten worden gebruikt als modelsysteem vanwege hun fragiele cellevensvatbaarheid, lage canonieke Wnt-signaleringsexpressie en gecondenseerd cytoplasmagebied om de detectiegevoeligheid van het Axin2-mTurquoise2-model weer te geven. Bovendien wordt een histologische totale β-cateninekleuringsprocedure voor thymocytensuspensies uitgelegd om cytoplasmatische β-cateninespiegels te meten en nucleaire actieve canonieke Wnt-signalering te verifiëren in combinatie met de reporter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Alle muizenprocedures zijn uitgevoerd met goedkeuring van de Ethische Commissie Dierproeven van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC). Mannelijk en vrouwelijk, 6-12 weken oud, wildtype (wt), die geen insertie van het Axin2-mTurquoise2 reporterconstruct hebben, heterozygoot (Tg/0) met één insertie van het Axin2-murquoise2 reporterconstruct en dus één verstoord Axin2-gen , en homozygoot (Tg/Tg) met de insertie van het Axin2-mTurquoise2 reporterconstruct in beide allelen en dus twee verstoorde Axin2-genen ; Axin2-mTurquoise2 muizen (B6; CBA-Axin2em1Fstl/J muizen) werden gebruikt in de experimenten. De dieren werden geofferd door CO2 -euthanasie voorafgaand aan orgaanisolatie. Beperk tijdens de procedure de blootstelling van de monsters aan licht tot een minimum en houd ze te allen tijde op ijs of 4 °C, tenzij anders aangegeven. Dek de monsters af met aluminiumfolie. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een standaard laboratorium met een bioveiligheidskast.

1. Bereiding van thymocytensuspensie

  1. Oogst de thymus van muizen voorzichtig zonder bloedbesmetting door de buik van de muizen open te snijden en de thymus met een tang te extraheren. Bewaren/tijdelijk vervoeren in het ijskoude Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) met daarin 2,5% foetaal kalfsserum (FCS).
    OPMERKING: Om bloedverlies en mogelijke thymusschade te voorkomen, mag u de muizen niet opofferen door cervicale dislocatie.
  2. Bereid een buis van 50 ml voor met een celzeef van 70 μm en bevochtig het filter met 1 ml koud IMDM/2,5% FCS-medium.
  3. Stamp het orgel fijn met de achterpunt van een zuiger van een spuit van 1 ml en was tweemaal met koud IMDM/2,5% FCS-medium (Figuur 1A). Voeg desgewenst een eindconcentratie van 50 E/ml DNAse I toe aan het IMDM/2,5% FCS-medium om samenklonteren van dode cellen te voorkomen. Spoel het filter 2x af met koud IMDM/2,5% FCS-medium en resuspendeer voorzichtig in de tube van 50 ml.
    OPMERKING: Overschrijd een totaal eindvolume van 10 ml niet. Bewaar de cellen op ijs en in het donker voor de volgende stappen en wanneer ze niet worden gehanteerd.
  4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 330 × g en zuig het bovenstaande voorzichtig op uit de celpellet. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in koud, onvolledig IMDM/2,5% FCS-medium en bereid u voor op het tellen van de cellen.
    OPMERKING: Vries indien nodig de thymocyten in en bewaar ze in vloeibare stikstof in FCS-10% dimethylsulfoxide voor latere experimenten. Door de cellen op de juiste manier in te vriezen en te ontdooien, wordt overmatige celdood verminderd. Gemiddeld kan de helft van de thymocyten na ontdooien apoptotisch zijn vanwege de natuurlijke T-celselectie in de thymus, waarmee rekening moet worden gehouden bij het beslissen hoeveel thymocyten per cryoflesje moeten worden ingevroren. Per injectieflacon mogen niet minder dan 2,5 × 106 thymocyten worden ingevroren.

2. Thymocyt flow cytometrie voorbereiding

  1. Bereid thymocyten voor op de kleuringsprocedure op het celoppervlak door 2,5 × 106 thymocyten per kleuringsmonster te bereiden in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) (Figuur 1B). Tel het aantal levende cellen na ontdooiing, als de thymocyten eerder zijn ingevroren. Voeg indien nodig een eindconcentratie van 50 E/ml DNAse I toe om samenklontering van dode cellen te voorkomen.
  2. Gebruik de antilichaamkleuringspanelen voor de karakterisering van het celoppervlak van een volledige thymocytensubset.
    OPMERKING: Andere combinaties van fluorochromen kunnen worden geselecteerd. Selecteer zeldzame populatiemarkeringen voor heldere fluorescerende fluorchromen en voeg indien mogelijk een levend-dode markering toe. Noch V450- noch V500-fluorchromaten mogen worden gebruikt in combinatie met de mTurquoise2 fluorescerende reporter vanwege spectrale overlapping. Controleer altijd de fluorescentiespectra van mTurquoise2 in combinatie met blauwe en groene fluorochen (aanvullende figuur 1A).
    1. Meng de antilichamen in vooraf gedefinieerde verhoudingen van de afstammingsnegatieve (Lin-) panels afzonderlijk in PBS/0,2% runderserumalbumine (BSA)/0,1% NaN3 (natriumazide) buffer.
      OPMERKING: Alle ongewenste cellen (niet-thymocyten aanwezig in de thymus) worden in een 2-staps proces gekleurd met een streptavidine secundair antilichaam (in dit voorbeeld fycoerythrine (Pe)-Cy7 en allophycocyanine (APC)-Cy7) en kunnen worden uitgesloten door een "dump gate" te gebruiken in de flowcytometrie-analyse.
    2. Meng de antilichamen in vooraf gedefinieerde verhoudingen van het Double Negative (DN) kleuringspaneel met het streptavidine secundaire antilichaam Pe-Cy7 in PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3-buffer . Sluit het Lin-paneel uit van deze mix (Tabel 1).
    3. Meng de antilichamen in vooraf gedefinieerde verhoudingen van het onrijpe enkelvoudige positieve (ISP), dubbele positieve (DP) en enkelvoudige positieve (SP) kleuringspaneel met het streptavidine secundaire antilichaam APC-Cy7 in PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3-buffer . Sluit het Lin-paneel uit van deze mix (Tabel 1).
    4. Kleur eerst de thymocyten met de ongewenste niet-T-celpopulaties door de biotine primaire antilichaammengsels van de Lin-panels gedurende 30 minuten op ijs in het donker te gebruiken.
      OPMERKING: Elk Lin-paneel is een andere set cellen en mag daarom niet in één monster worden gekleurd.
    5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g, 4 °C en verwijder het supernatant. Was de thymocyten met 150 μL ijskoude PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 buffer en draai af bij 300 × g, 4 °C gedurende 5 min.
    6. Vlek met het DN-paneel en het ISP/DP/SP-paneel gedurende 30 minuten op ijs in het donker met de bijbehorende kleuring. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g, 4 °C en verwijder het supernatant. Was de thymocyten met 150 μL ijskoude PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 buffer en centrifugeer 5 minuten bij 300 × g, 4 °C.
  3. Bereid de cellen voor op flowcytometriemeting door te homogeniseren met een celzeefbuis van 35 μm en de cellen op te nemen in PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3-buffer . Bescherm cellen tegen licht en blijf op ijs liggen tot en tijdens de meting van de flowcytometer.
    OPMERKING: NaN3 (natriumazide) is zeer giftig en dodelijk. Speciale aandacht moet worden besteed aan het werken met deze stof. Was de handen grondig na het hanteren en bel onmiddellijk een antigifcentrum of een arts/arts als NaN3 wordt ingeslikt.

3. Meting van de flowcytometer

OPMERKING: Onervaren gebruikers moeten eerst een flowcytometertraining volgen, aangezien het meten van het mTurquoise2-signaal in combinatie met verschillende andere fluorochromen ervaring en deskundige planning van het experiment vereist. Zie de materiaaltabel voor informatie over de flowcytometer.

  1. Start de flowcytometer volgens de gebruikershandleiding of een ander vastgesteld protocol. Controleer en pas indien nodig de banddoorlaatfilter in de flowcytometer aan voor een optimale fluorescentiedetectiestrategie.
    OPMERKING: Een aanbevolen filter voor mTurquoise2 is 470/20 nm op de ultraviolette 405 nm, 407 nm of de minder gebruikelijke 440 nm laserlijn.
  2. Kalibreer de flowcytometer door compensatie-instellingen in te stellen met in de handel verkrijgbare compensatiekorrels en stabiel getransfecteerde 293T-cellen die mTurquoise2 tot expressie brengen.
    OPMERKING: Enkelvoudig gekleurd wt thymocyten kunnen worden gebruikt in plaats van compensatieparels. In dit geval was compensatie met kralen even efficiënt en handiger dan het gebruik van cellen.
    1. Label de kralen met elk afzonderlijk fluorchroom dat in het experiment is gebruikt en voeg ongekleurde kralen toe. Meet de kralen om een compensatie-instellingspaneel op te zetten en meet mTurquoise2-expressie 293T-cellen omdat er geen overeenkomend fluorchroom is voor mTurquoise2, dat op de kralen kan worden gebruikt. Sla de compensatie-instellingen op voor gebruik in het eigenlijke experiment.
      OPMERKING: De cellen die mTurquoise2 tot expressie brengen en die voor de compensatie-instelling worden gebruikt, moeten even helder of helderder zijn dan de thymocyten die mTurquoise2 tot expressie brengen van het eigenlijke experiment. Zorg ervoor dat er ook mTurquoise2-negatieve 293T cellen aanwezig zijn.
    2. Neem voor het experiment fluorescentie minus één (FMO) Tg/Tg-gekleurde thymocyten op, inclusief een wt-monster voor de mTurquoise2 FMO en een ongekleurde steekproef van thymocyten van elk muisgenotype als positieve controles voor het analysegedeelte.
      OPMERKING: Deze bedieningselementen zijn belangrijk om de poorten voor positieve cellen goed in te stellen. De rest van de experimentele monsters wordt gekleurd met het volledige kleurplaat (Tabel 1).
      1. Maak een experiment, voeg het aantal buisjes toe en geef het een naam in de flowcytometersoftware en maak spreidingsdiagrammen om de gekleurde cellen te visualiseren voor de volledige set fluorochromen.
      2. Pas de eerder ingestelde compensatie-instellingen toe op het experiment. Pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) aan met ongekleurde gewt-thymocyten totdat de volledige populatie cellen zichtbaar is in het spreidingsdiagram. Meet eerst de ongekleurde Tg/Tg mTurquoise2-expressieve thymocyten om er zeker van te zijn dat de positieve populatie zichtbaar is.
      3. Meet een Tg/Tg volledig gekleurd thymocytenmonster en controleer op alle fluorochroomcombinaties. Pas indien nodig de eerder vastgestelde compensatiewaarden aan voor de fluorchromen die een onjuiste compensatie vertonen. Meet de rest van de experimentele monsters en pas geen instellingen aan tijdens het meten van de monsters.
        OPMERKING: Latere compensatieaanpassing kan ook worden uitgevoerd in het analysesoftwarepakket. Hoewel het aantal beschikbare cellen een beperkende factor kan zijn, is het raadzaam om deze stap tijdens de meting uit te voeren. Houd de instellingen voor alle samples gelijk voor het vergelijken van de mTurquoise2-intensiteitswaarden.

4. Cytometrische flowanalyse

OPMERKING: Flowcytometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van specifieke software die wordt vermeld in de materiaaltabel; Er zijn echter ook andere programma's voor cytometrische analyse beschikbaar.

  1. Gate levende cellen en thymocytensubsets volgens FSC- en SSC-waarden.
  2. Controleer de compensatie-instellingen in het dialoogvenster van de compensatiematrix aan de linkerkant van het voorbeeld om er zeker van te zijn dat er geen fluorochroominterferentie is en dat de juiste compensatie heeft plaatsgevonden om spill-over of bleed-through te voorkomen.
    1. Als de door acquisitie gedefinieerde matrix moet worden aangepast, wijzigt u de waarden in de compensatiematrix door simpelweg de compensatiewaarde van elke fluorochroomcombinatie te verhogen of te verlagen, zodat de populatie geen bijna perfecte horizontale of verticale lijn vertoont (aanvullende figuur 1B).
  3. Om de mTurquoise2-intensiteit visueel te spreiden voor een goede positieve gating, wijzigt u het mTurquoise2 X-asdisplay in lineair (aanvullende afbeelding 2).
    1. Gebruik de mTurquoise2 FMO-besturing als negatieve regeling voor mTurquoise2 positieve signaalgating. Herzie de juiste drempelpoort per celpopulatie (Figuur 2).
      OPMERKING: De (wt) mTurquoise2 FMO-controlecellen hebben niet de mTurquoise2-marker en kunnen daarom worden gebruikt als achtergronddrempel voor de activiteit van de Axin2-reporter.
  4. Poort mTurquoise2-positieve cellen met het juiste detectiekanaal om te bepalen hoeveel cellen Wnt-positief zijn.
  5. Bereken het geometrisch gemiddelde en de mediaan om de hoeveelheid fluorescerende intensiteit in de cellen van interesse te definiëren.
    1. Klik op Statistieken | Voeg een statistiek toe in het paneel met mTurquoise2-positieve cellen.
    2. Definieer de statistische methode, de populatie van interesse en het detectiekanaal van mTurquoise2 en klik op Toevoegen. Vertegenwoordig het geometrisch gemiddelde en de mediane fluorescerende intensiteit in willekeurige eenheden (AU) om grafieken uit te zetten.
      OPMERKING: De mediaan vertegenwoordigt de middelste waarde van de fluorescerende intensiteit en geeft dus informatie over de verschuiving van de fluorescerende intensiteit. Indien nodig kan een achtergrondcorrectie helpen om een duidelijkere visualisatie van het dynamisch bereik van de mTurquoise2 reporter-activiteit te verkrijgen. Dit kan worden gedaan door de wt-achtergrondkleuringsfrequenties af te trekken van de totale frequentie van mTurquoise2-positieve cellen van het specifieke celtype dat wordt gegated.

5. Bereiding van cytospins van thymocyten voor confocale beeldvorming

OPMERKING: Cytospins van thymocyten worden aanbevolen bij het werken met celsuspensies van niet-hechtende cellen. Omdat de expressie van Axin2-mTurquoise2 in thymocyten lager is dan in de thymusepitheelcellen, werden gefilterde thymocytensuspensies gebruikt voor beeldvorming.

  1. Begin met een celsuspensie van vers geoogste of ingevroren thymocyten. Suspendeer ~20.000 thymocyten in 100 μL koude PBS/0,5% BSA/10% FCS per thymocytengenotype.
    OPMERKING: Ontdooi de cellen indien nodig voorzichtig om de maximale levensvatbaarheid van de cellen te behouden bij het werken met eerder ingevroren thymocyten. Dit zal helpen bij minder autofluorescentie bij het afbeelden van de cellen. Controleer de levensvatbaarheid van de cellen om de kwaliteit van het monster te garanderen. De cytospinprocedure maakt gebruik van een mechanische kracht die is aangepast aan de fragiele thymocyt; Desalniettemin vereist het een zeer levensvatbare startpopulatie. Om een hogere levensvatbaarheid te garanderen, is het raadzaam om te beginnen met vers geoogste in plaats van ingevroren thymocyten.
  2. Maak het gebied rond de opening van de filterkaarten nat met PBS. Monteer de houder van de cytospinmonsterkamer volgens de handleiding (Figuur 1C).
    1. Plaats de filterkaart op de vorstschuif (gladde kant tegen de glasplaat). Plaats beide items op de houder van de monsterkamer. Zorg ervoor dat de filterkaart precies op het gat van de monsterkamerhouder wordt geplaatst en plaats de volledige monsterkamerhouder in de rotor.
  3. Resuspendeer de thymocyten voorzichtig en voeg 100 μl van de celsuspensie toe aan de monsterkamers. Draai de thymocytensuspensie gedurende 4 minuten bij ~350 × g op de vorstglaasjes. Verwijder de filterkaart voorzichtig van het vorstglaasje zonder de cellen aan te raken. Laat de cytospins aan de lucht drogen gedurende een periode van 1 uur tot een nacht bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Wanneer u met andere celtypen werkt, test dan verschillende celdichtheden voor optimale resultaten. Cytospins kunnen in een afgesloten doos bij -20 °C worden ingevroren om later te experimenteren. Ontdooi de cytospins voor verdere verwerking gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

6. Cytospin immunokleuring met totaal β-catenine

  1. Fixeer de cytospins gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 100% methanol. Laat de glaasjes 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Teken met een hydrofobe pen een cirkel rond de thymocytenpopulatie op de glasplaat.
    OPMERKING: Deze fixatiestap is speciaal geoptimaliseerd voor β-cateninekleuring.
  2. Plaats de objectglaasjes in PBS/0.05% Tween-20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en breng ze vervolgens over naar een donkere, vochtige doos tijdens de blokkerings- en incubatiestappen. Voeg 100 μL PBS/10% normaal muizenserum (NMS) per glaasje toe en laat 10 minuten in de vochtige doos op kamertemperatuur staan. Tik op het glaasje om de 10% NMS te verwijderen, voeg 100 μL PBS/10% normaal geitenserum (NGS) per glaasje toe en laat 30 minuten op kamertemperatuur in de vochtige doos staan.
    OPMERKING: Incubatie met PBS/10% NMS blokkeert niet-specifieke primaire antilichaambinding (Figuur 1D), terwijl PBS/10% NGS niet-specifieke secundaire antilichaambinding blokkeert.
  3. Bereid extra antilichamen voor cellulaire kleuring voor. Meng 0,5 μg van het totale β-catenine-antilichaam met de AF568-gelabelde fragmenten.
    OPMERKING: In deze instelling werd een in de handel verkrijgbare etiketteringskit gebruikt voor het vooraf labelen van de primaire anti-muis totale β-catenine met secundaire geit-anti-muis IgG1 Fab-fragmenten met Alexa Fluor 568 (AF568) fluorochroomlabel voordat het aan de thymocyten werd toegevoegd. Voer de etikettering uit volgens het protocol van de fabrikant, aangezien er mogelijk meerdere concentraties moeten worden getest. Gebruik het totale β-catenine-AF568-gelabelde antilichaam binnen 30 minuten.
  4. Voeg 50 μL (0,5 μg) van het totale β-catenine-AF568-gelabelde antilichaam toe per cytospinglaasje 's nachts bij 4 °C in een vochtige doos. Voeg een negatieve kleuringscontrole toe volgens het protocol van de fabrikant of een isotypecontrole in het geval van een direct etiketteringsprotocol.
  5. Was gedurende 20 minuten met PBS/0.05% Tween-20 op kamertemperatuur. Was vervolgens 20 minuten met PBS op kamertemperatuur in een pot onder roeren. Voer een tweede fixatiestap uit om de binding van het antilichaam aan het antigeen te garanderen: 10 minuten bij kamertemperatuur met 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS in een vochtige doos.
    OPMERKING: Houd de dia's in het donker. Noch methanol, noch PFA-fixatie zal de mTurquoise2-expressie significant beïnvloeden27.
  6. Dompel de dia's in PBS. Voer een nucleaire kleuring uit met 50 μL TO-PRO-3 (1:1500) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de vochtige doos. Was de dia's 20 minuten met PBS op kamertemperatuur in een potje onder roer.
    OPMERKING: De TO-PRO3-concentratie kan worden getitreerd afhankelijk van het gebruik van andere fluorochromen met nabijgelegen fluorescerende spectra.
  7. Sluit de monsters in met een antifade-reagens volgens het protocol van de fabrikant en dek af met een dekglaasje. Laat 24 uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Bekijk de objectglaasjes direct onder een fluorescerende of confocale microscoop, of bewaar ze bij -20 °C voor latere beeldvorming.

7. Confocale microscopische meting

NOTITIE: Zie de materiaaltabel voor informatie over de confocale microscoop.

  1. Schakel de confocale microscoop in volgens de handleiding of het vastgestelde protocol. Gebruik negatief en positief stabiel getransfecteerde mTurquoise2 293T cellijnregelaars voor primaire aanpassing van de confocale instellingen. Gebruik vervolgens wt Axin2-mTurquoise2 en Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 thymocyten als respectievelijk negatieve en positieve controles om ervoor te zorgen dat het mTurquoise2-signaal niet onderbelicht wordt.
  2. Bereid de software voor op sequentieel scannen door de lasers en filterbreedtes te programmeren. Begin eerst met de laserlijn met de hoogste golflengte en werk toe naar de laagste golflengte. Wanneer alle sequentiële scanstappen zijn geïnstalleerd, laadt u het monster op de microscooptafel, stelt u het monster scherp en drukt u op Live om het laservermogen en Smart Gain te optimaliseren met behulp van de respectievelijke knoppen op de confocale software of het optionele handmatige paneel.
    OPMERKING: Het monstergedeelte van het objectglaasje mag niet worden afgebeeld voor signaalkwantificering, aangezien er mogelijk fotobleken kan optreden. mTurquoise2 heeft echter een hoge fotostabiliteit25.
  3. In het geval van een zeer lage mTurquoise2-expressie, verhoogt u het laservermogen en Smart Gain totdat een fluorescerend signaal wordt waargenomen en controleert u met het negatieve controlemonster om een echt positief signaal te garanderen. Visualiseer de thymocyten met een 40x 1,4 olielens, 63x 1,4 olielens of 100x 1,4 olielens.
    OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een Leica SP5-microscoop gebruikt.
  4. Gebruik deze confocale beeldvormingsinstellingen op de microscoop voordat u het monster meet.
    1. Pas het intensiteitswaardebereik aan naar een 12-bits afbeelding door te klikken op Configuratie | Instellingen | verander naar 12-bits in de optie Bitdiepte om een bredere intensiteitsschaal te creëren en dus meer onderscheid te maken tussen lage en hoge fluorescerende signalen.
    2. Pas de beeldresolutie aan door op XY te klikken en verhoog het formaat tot 1024 x 1024, waardoor ook de scantijd wordt verdubbeld. Pas de scansnelheid aan naar 400-600 Hz door op Snelheid | Meer om de instellingen handmatig te wijzigen. Activeer bovendien de optie Bidirectioneel scannen.
    3. Pas de gevoeligheidsschuifregelaar aan om het achtergrondsignaal te verminderen. Optimaliseer het juiste laservermogen en Smart Gain met de Quick LUT (Look-Up Table) optie.
      OPMERKING: In de 12-bits afbeelding heeft de schuifregelaar een grijsschaalintensiteitswaarde van 0 tot 4095. Dit kan ook achteraf met de gratis offline Las X software. De groene kleur toont de zwarte achtergrond en de blauwe kleur toont verzadigde pixels van het voorbeeld.
  5. Wanneer alle beeldvormingsinstellingen zijn geoptimaliseerd, meet u de steekproef door op Start te klikken, waardoor de sequentiële beeldvorming van alle drie de kanalen wordt gestart.
    1. Meet het TO-PRO-3 nucleaire fluorescerende signaal. Detecteer TO-PRO-3 met de 633 nm laser en HyD 640-750 nm.
      OPMERKING: In deze opstelling werd 6% laservermogen gebruikt bij 15% slimme versterking. Deze instelling kan veranderen afhankelijk van de intensiteit van de TO-PRO-3-kleuring. Als het erg helder is, kan het fluorochromen met een lagere intensiteit beïnvloeden wanneer het te veel wordt geëxciteerd. Verminder in dat geval de kleuringsconcentratie.
    2. Meet de nucleaire en cytoplasmatische fluorescerende signalen van β-catenine. Detecteer β-catenine met de 561 nm laser en HyD 580-605 nm. Verzamel maximaal 2 scans voor één afbeelding door de instelling in het XY-vak in de software aan te passen met lijngemiddelde 2 in het geval van een laag AF568-signaal.
      OPMERKING: In deze opstelling werd 85% laservermogen gebruikt met 87% slimme versterking.
    3. Meet het cytoplasmatische fluorescerende signaal van mTurquoise2. Detecteer mTurquoise2 met de 458 nm laser en HyD 490-600 nm. Verzamel maximaal 4 scans voor één afbeelding door de instelling in het XY-vak in de software aan te passen met lijngemiddelde 4 in het geval van een laag mTurquoise2-signaal.
      OPMERKING: Vanwege oude lasers op de confocale microscoop die voor dit protocol zijn gebruikt en het lage mTurquoise2-signaal, werd 405 nm gebruikt met 90% laservermogen, samen met de lasers van 458 nm en 476 nm met 100% laservermogen met HyD 490-550 nm bij 100% slimme versterking. Een laser van 440 nm is het meest optimaal, zij het minder vaak aanwezig op een confocale microscoop. Een hoog laservermogen moet met zorg worden behandeld en alleen worden uitgevoerd met sequentiële beeldvorming. Zorg ervoor dat de noodinstellingen aanwezig zijn om overmatige blootstelling van de detector te voorkomen. Het laservermogen op andere confocale microscopen kan inferieur zijn aan de lasers die in dit protocol worden voorgesteld vanwege krachtigere of nieuwere lasers. Een bleektest kan worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen fluorescerend signaal verloren gaat vóór de beeldvorming. In de voorgestelde opstelling was het fotobleken van mTurquoise2 acceptabel.
    4. Voer helderveldbeeldvorming uit voor totale celvisualisatie. Detecteer thymocyten met de 488 nm laser en PMT Scan-DIC. Exporteer de Gif-bestanden voor beeldanalyse.
      OPMERKING: In deze opstelling werd 59% laservermogen gebruikt met een versterking van 212 V en dataoffset van -4,3%. Lat-bestanden kunnen worden gelezen in de offline LAS x-software voor beeldcorrectie.

8. Confocale microscopie analyse

  1. Analyseer de afbeeldingen met behulp van beeldverwerkingssoftware28 (aanvullende afbeelding 3). Laad de afbeeldingen in de software.
    OPMERKING: Meerdere formaten worden geaccepteerd, maar TIFF-bestanden met LUT of directe import van LIT-bestanden in de beeldverwerkingssoftware worden aanbevolen.
  2. Meet het actieve β-cateninesignaal in de thymocytenkernen.
    1. Selecteer de kernen van de TO-PRO-3-gekleurde thymocyten in het roodgrijze waardebeeld voor de analyse van actief β-catenine. Doe dit handmatig, of gebruik geautomatiseerde celselectie in de software.
      OPMERKING: Geautomatiseerde celselectie heeft mogelijk beeldverwerking nodig voor de juiste drempelwaarde en deeltjesanalyse. Handmatige celselectie kan omslachtig zijn, maar vereist over het algemeen geen beeldverwerking en wordt aanbevolen in dit protocol.
    2. Activeer handmatige selectie met een van de selectiegereedschappen in de werkbalk.
      1. Selecteer de contour van de kern en voeg deze toe aan de manager van de interesseregio (ROI). Activeer de ROI-manager door te klikken op Analyseren | Gereedschap | ROI Manager, en wanneer een nieuw ROI Manager-venster wordt geopend, klikt u op de eerste optie Toevoegen (t) of gebruikt u de sneltoets t. Herhaal de vorige stap totdat alle kernen zijn gedefinieerd en toegevoegd aan de ROI-manager. Gebruik de optie Alles weergeven in de ROI-manager om de geselecteerde cellen te visualiseren.
    3. Selecteer >3 achtergrondgebieden waar geen cellen aanwezig zijn en voeg deze toe aan de ROI-manager.
      OPMERKING: Grootte en vorm zijn in dit geval niet belangrijk. Deze regio's zullen dienen als achtergrondgeluidsmetingen voor de uiteindelijke berekening.
      1. Definieer de meting op de afbeelding door te klikken op Analyseren | Stel afmetingen in. Activeer in het nieuwe venster dat wordt geopend met verschillende meetopties Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde | klik op OK.
      2. Activeer de afbeelding met de grijze waarde β-catenine door erop te klikken en visualiseer de geselecteerde kernen en achtergrondgebieden door te klikken op Alles weergeven in de ROI-manager. Bekijk alle geselecteerde gebieden die nu zichtbaar zijn in het β-cateninebeeld.
      3. Klik op Meten in de ROI Manager of klik op Analyseren | Meten. Bekijk het nieuwe resultatenvenster dat wordt geopend en waarin de resultaten van het β-catenine-signaal binnen de ROI's worden weergegeven.
      4. Breng de resultaten over naar een spreadsheetberekeningsprogramma door op Bewerken | Selecteer alles; en kopieer/plak de lijst in de spreadsheet voor verdere berekening. Sla de ROI-manager op voor toekomstig gebruik zonder de kernselectie te hoeven herhalen door te klikken op Meer | Redden....
    4. Voor geautomatiseerde celselectie maakt u duplicaten (toetsenbord Ctrl D) van de afbeelding die moet worden verwerkt, aangezien veel instellingen voor beeldverwerking niet ongedaan kunnen worden gemaakt.
      OPMERKING: Geautomatiseerde nucleaire etikettering vereist in de meeste gevallen beeldverwerking om de kernen automatisch en nauwkeurig te definiëren. Beeldverwerking mag alleen worden gedaan voor gebiedsselectiedoeleinden. Verwerkte afbeeldingen zijn niet bruikbaar voor het meten van de fluorescerende intensiteit omdat de pixelwaarden worden gewijzigd.
      1. Voer een Gaussiaans filter uit door te klikken op Proces | Filteren | Gaussiaans vervagen om het beeld vloeiender te maken. Test meerdere Sigma-waarden (Radius) en activeer de optie Voorbeeld om het effect te visualiseren voordat u op OK klikt.
      2. Keer de afbeelding om door op Bewerken | Omkeren. Controleer de helderheid en het contrast door op Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast. Gebruik de optie Auto of wijzig de waarden bij voorkeur handmatig.
        OPMERKING: Pas de wijzigingen niet toe , omdat dit de eigenschappen van de afbeelding zou wijzigen. Sluit gewoon het B&C-venster wanneer het gewenste beeld is verkregen.
      3. Maak een drempel door op Afbeelding | Aanpassen | Drempel en definieer de beste drempelinstellingen waarbij alle cellen meestal zichtbaar zijn. Klik op Toepassen om de drempelinstellingen toe te passen.
        OPMERKING: Als er geen drempelwaarde is toegepast op de cellen, die gaten vertonen, klikt u op Proces | Binair | Vul gaten om de gaten in de cellen op te vullen. Als cellen zijn samengevoegd met de drempelinstellingen, klikt u op Proces | Binair | Waterscheiding om deze cellen te scheiden. Een fijne lijn van 1 pixel scheidt elke cel die het programma interpreteert als gefuseerd.
      4. Definieer de kleinste en grootste kern in de afbeelding door handmatig een kern naar keuze te selecteren met de selectietool uit de vrije hand , deze toe te voegen aan de ROI-manager en het gebied te meten.
      5. Analyseer de deeltjes (kernen) door te klikken op Analyseren | Analyseer deeltjes en voeg het kleinste gebied en het grootste gebied in het vak Grootte (^2) in met een koppelteken (-) ertussen. Activeer de vakjes Resultaten weergeven, Toevoegen aan manager en Uitsluiten op randen voordat u op OK klikt. Ga verder met stap 8.2.3 om het protocol te voltooien.
  3. Meet de cytoplasmatische mTurquoise2- en β-catenine-signalen in de thymocyten.
    1. Selecteer de contouren van hele thymocyten in de helderveldafbeelding door dezelfde stappen te volgen als hierboven.
    2. Selecteer >3 achtergrondgebieden waar geen cellen aanwezig zijn en voeg deze toe aan de ROI-manager.
      OPMERKING: Grootte en vorm zijn in dit geval niet essentieel. Deze regio's zullen dienen als achtergrondgeluidsmetingen voor de uiteindelijke berekening.
      1. Activeer de afbeelding met grijze waarde mTurquoise2 door erop te klikken en visualiseer de geselecteerde totale cel-ROI's en achtergrondgebieden door te klikken op Alles weergeven in de ROI-manager. Bekijk alle geselecteerde gebieden die zichtbaar zijn in de mTurquoise2-afbeelding.
      2. Klik op Meten in de ROI Manager, of klik op Analyseren | Meten. Bekijk het nieuwe resultatenvenster dat wordt geopend met de meetresultaten van het mTurquoise2-signaal.
      3. Breng de resultaten over naar een spreadsheetberekeningsprogramma door op Bewerken | Selecteer alles en kopieer/plak de lijst in de spreadsheet voor verdere berekening.
      4. Activeer de afbeelding met de grijze waarde van β-catenine door erop te klikken en visualiseer de geselecteerde totale cel-ROI's en achtergrondgebieden door te klikken op Alles weergeven in de ROI-manager. Bekijk alle geselecteerde gebieden die zichtbaar zijn in het beeld van de β-catenine.
      5. Klik op Meten in de ROI Manager, of klik op Analyseren | Meten. Let op het nieuwe resultatenvenster dat wordt geopend met de meetresultaten van het totale cellulaire β-cateninesignaal.
      6. Breng de resultaten over naar een spreadsheetberekeningsprogramma door op Bewerken | Selecteer alles en kopieer/plak de lijst in de spreadsheet voor verdere berekening. Sla de ROI-manager op voor toekomstig gebruik zonder de celselectie te hoeven herhalen door te klikken op Meer | Redden....
  4. Bereken de gecorrigeerde totale nucleaire fluorescentie (CTNF) voor actieve β-catenine met behulp van vergelijking 1.
    CTNF = Geïntegreerde dichtheid - (Oppervlakte × gemiddelde van gemiddelde achtergrondgebieden) (1)
  5. Bereken de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) voor mTurquoise2 met behulp van vergelijking 2.
    CTCF = Geïntegreerde dichtheid - (Oppervlakte × gemiddelde van gemiddelde achtergrondgebieden) (2)
  6. Maak een onderscheid tussen actieve nucleaire β-catenine en cytoplasmatisch β-catenine door de nucleaire β-cateninewaarden die in stap 8.2.3.3 zijn verkregen, af te trekken. uit de totale cel-β-cateninewaarden verkregen in stap 8.3.2.5 om de cytoplasmatische inactieve β-catenine te verkrijgen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de metingen in dezelfde cel worden uitgevoerd.
    1. Bereken het gemiddelde van de gemiddelde intensiteit van de achtergrondgebieden. Bereken CTNF en CTCF met behulp van vergelijkingen 1 en 2. Beschouw IntDen (de som van alle pixels binnen het geselecteerde gebied) als de geïntegreerde dichtheid en niet de RawIntDen.
    2. Bereken indien nodig de standaarddeviatie van de IntDen-waarden voor het uitzetten van grafieken. Overweeg maximaal 200 afzonderlijke cellen voor statistische analyse met behulp van de Mann-Whitney U-test.
  7. Zet de resultaten uit in een afzonderlijke gegevenspuntgrafiek en label de y-as met de CTNF- of CTCF-waarden als Relative Fluorescent Units (RFU).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de rol van canonieke Wnt-signalering te onderzoeken, is een Axin2-mTurquoise2 canoniek Wnt-reportermodel getest in combinatie met β-catenine-eiwitexpressie. Van thymocyten is bekend dat ze kwetsbaar zijn, een lage canonieke Wnt-signalering vertonen in verschillende stadia van het rijpingsproces van thymocyten en een lage cytoplasmatische tot nucleaire verhouding hebben; al deze factoren belemmeren de detectie van cytoplasmatisch mTurquoise2 of β-catenine. Door het protocol te volgen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende canonieke Wnt-reporters beschikbaar met verschillende reportergevoeligheid en werkelijke reporter-eiwitten. Reportermodellen die gebruik maken van synthetisch geïntroduceerde gemultimeriseerde TCF/LEF-bindingsplaatsen zijn beschikbaar met fluorescerende reportereiwitten; dergelijke herhalingen van transgenen kunnen echter verloren gaan tijdens het fokken of lange in vivo experimenten en kunnen gevoelig zijn voor niet-Wnt-signalen van omringende genomische s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door een subsidie van de Universiteit Leiden voor de profilering Area Regenerative Medicine om nieuwe muismodellen te ontwikkelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD FACScantoII flow cytometerBD Biosciencesniet van toepassingDe flow cytometer instelling in dit protocol bevat een 405 nm laserlijn met 505 longpass filter en 530/30 nm bandpass filter, en 470/20 nm bandpass filter; een 488 nm laser met 735 nm longpass filter en 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter en 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter en 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter en 530/30 nm bandpass filter, en 488/10 nm bandpass filter; en een 633 nm laserlijn met 735 nm longpass filter en 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, en 660/20 nm bandpass filter.
BSA Sigma A9647
Corning 70 μm cell strainer Falcon/Corning 352350
Cytospin 4 Type A78300101Thermo Scientificniet van toepassing 
DMSOSigma Aldrich D5879-1L
DNAse ISigma A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubesGreiner bio-one227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap capFisher Scientific 352235
Fetal Calf Serum (FCS)Greiner Bio-One B.V. niet van toepassing Afhankelijk van de oorsprong
Fiji software ImageJniet van toepassing Versie 1.53
Filter card white (for cytospin)VWRSHAN5991022
FlowJo 10 softwareTreestarniet van toepassing Versie 10.5.3
Frost slides Klinipath
Gibco IMDM medium Fisher Scientific 12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lensLeica microsystems niet van toepassing 
Hydrophobic pen: Omm Edge pen Vectorniet van toepassing 
Leica TCS SP5 DMI6000Leica microsystems niet van toepassing De microscoop instelling in dit protocol bestond uit een HCX PL APO 40x/1.2 olie-immersie objectief met 8-bits resolutie, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz snelheid, pinhole 68 µm, en zoomfactor van 1,5 bij kamertemperatuur. Dit systeem bevat een 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser en HeNe 633 laser met 4 hybride detectors (HyDs) en 5 fotomultiplier tubes (PMTs). 
Methanol VWR1060091000
NaN3/sodium azideHospital farmacyniet van toepassing 
Normal mouse serumEigen muizenniet van toepassing 
PBS LonzaBE17-517Q
ProLong Diamond Antifade MountantFisher Scientific P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)BD Biosciences610154
TO-PRO-3 IodideThermofisherT3605
Transparent nailpolishbij elke drogisterijniet van toepassing 
Tween-20Sigma Aldrich P1379-500ml 
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kitThermofisherZ25006

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kahn, M. Can we safely target the WNT pathway. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (7), 513-532 (2014).
  2. Jung, Y. S., Park, J. I. Wnt signaling in cancer: therapeutic targeting of Wnt signaling beyond beta-catenin and the destruction complex. Experimental & Molecular Medicine. 52 (2), 183-191 (2020).
  3. Gao, K., Zhang, T., Wang, F., Lv, C. Therapeutic Potential of Wnt-3a in neurological recovery after spinal cord injury. European Neurology. 81 (3-4), 197-204 (2019).
  4. Jia, L., Pina-Crespo, J., Li, Y. Restoring Wnt/beta-catenin signaling is a promising therapeutic strategy for Alzheimer's disease. Molecular Brain. 12 (1), 104(2019).
  5. Bae, S. M., Hong, J. Y. The Wnt signaling pathway and related therapeutic drugs in autism spectrum disorder. Clinical Psychopharmacology and Neuroscience. 16 (2), 129-135 (2018).
  6. Tajer, P., Pike-Overzet, K., Arias, S., Havenga, M., Staal, F. J. T. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells for therapeutic purposes: Lessons from development and the niche. Cells. 8 (2), 169(2019).
  7. Yanai, K., et al. Crosstalk of hedgehog and Wnt pathways in gastric cancer. Cancer Letters. 263 (1), 145-156 (2008).
  8. Blank, U., et al. An in vivo reporter of BMP signaling in organogenesis reveals targets in the developing kidney. BMC Developmental Biology. 8, 86(2008).
  9. Duncan, A. W., et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nature Immunology. 6 (3), 314-322 (2005).
  10. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  11. Lustig, B., et al. Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/Axin2 in colorectal and liver tumors. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1184-1193 (2002).
  12. Bernkopf, D. B., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. Negative-feedback regulation of the Wnt pathway by conductin/axin2 involves insensitivity to upstream signalling. Journal of Cell Science. 128 (1), 33-39 (2015).
  13. Vassar, R., Rosenberg, M., Ross, S., Tyner, A., Fuchs, E. Tissue-specific and differentiation-specific expression of a human K14 keratin gene in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (5), 1563-1567 (1989).
  14. DasGupta, R., Fuchs, E. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation. Development. 126 (20), 4557-4568 (1999).
  15. Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
  16. Mohamed, O. A., Clarke, H. J., Dufort, D. beta-catenin signaling marks the prospective site of primitive streak formation in the mouse embryo. Developmental Dynamics. 231 (2), 416-424 (2004).
  17. Moriyama, A., et al. GFP transgenic mice reveal active canonical Wnt signal in neonatal brain and in adult liver and spleen. Genesis. 45 (2), 90-100 (2007).
  18. Currier, N., et al. Dynamic expression of a LEF-EGFP Wnt reporter in mouse development and cancer. Genesis. 48 (3), 183-194 (2010).
  19. Ferrer-Vaquer, A., et al. A sensitive and bright single-cell resolution live imaging reporter of Wnt/beta-catenin signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 10, 121(2010).
  20. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  21. de Roo, J. J. D., et al. Axin2-mTurquoise2: A novel reporter mouse model for the detection of canonical Wnt signalling. Genesis. 55 (10), (2017).
  22. van de Moosdijk, A. A. A., van de Grift, Y. B. C., de Man, S. M. A., Zeeman, A. L., van Amerongen, R. A novel Axin2 knock-in mouse model for visualization and lineage tracing of WNT/CTNNB1 responsive cells. Genesis. 58 (9), 23387(2020).
  23. Choi, Y. S., et al. Distinct functions for Wnt/beta-catenin in hair follicle stem cell proliferation and survival and interfollicular epidermal homeostasis. Cell Stem Cell. 13 (6), 720-733 (2013).
  24. Nolan, G. P., Fiering, S., Nicolas, J. F., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell analysis and sorting of viable mammalian cells based on beta-D-galactosidase activity after transduction of Escherichia coli lacZ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (8), 2603-2607 (1988).
  25. Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3, 751(2012).
  26. Bernkopf, D. B., Bruckner, M., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. An aggregon in conductin/axin2 regulates Wnt/beta-catenin signaling and holds potential for cancer therapy. Nat Commun. 10 (1), 4251(2019).
  27. Joosen, L., Hink, M. A., Gadella, T. W., Goedhart, J. Effect of fixation procedures on the fluorescence lifetimes of Aequorea victoria derived fluorescent proteins. Journal of Microscopy. 256 (3), 166-176 (2014).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Reviews. 11, 227-256 (2005).
  30. Henriksson, J., et al. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nature Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
  31. Hedgepeth, C. M., et al. Activation of the Wnt signaling pathway: a molecular mechanism for lithium action. Developmental Biology. 185 (1), 82-91 (1997).
  32. Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P., Brivanlou, A. H. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nature Medicine. 10 (1), 55-63 (2004).
  33. Ring, D. B., et al. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
  34. Liu, C., et al. Control of beta-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism. Cell. 108 (6), 837-847 (2002).
  35. Zeng, X., et al. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions. Development. 135 (2), 367-375 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Wnt signaleringCanonieke Wnt expressieThymocytenanalyseCeloppervlaktemarkersBeta cateninekleuringHematopo tisch systeemFluorescentiekwantificering
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen