Methodenartikel

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

DOI:

10.3791/62151

⸱

13 februari 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwikkeling van het gehemelte is een dynamisch proces, waarbij verticale groei van bilaterale palatale planken naast de tong wordt gevolgd door verhoging en fusie boven de tong. Defecten in dit proces leiden tot gespleten gehemelte, een veel voorkomende aangeboren afwijking. Recente studies hebben aangetoond dat palatale plankverhoging een verbouwingsproces omvat dat de oriëntatie van de plank transformeert van een verticale naar een horizontale. De rol van de palatale plank mesenchymale cellen in deze dynamische remodellering is moeilijk te bestuderen. Time-lapse-imaging-gebaseerde kwantitatieve analyse is onlangs gebruikt om aan te tonen dat primaire muis embryonale palatale mesenchymale (MEPM) cellen zichzelf kunnen organiseren in een collectieve beweging. Kwantitatieve analyses konden verschillen in gemuteerde MEPM-cellen identificeren van een muismodel met gehemelte-elevatiedefecten. Dit artikel beschrijft methoden om MEPM-cellen van E13.5-embryo's te isoleren en te kweken - specifiek voor time-lapse beeldvorming - en om verschillende cellulaire kenmerken van collectieve beweging te bepalen, waaronder metingen voor stroomvorming, vormuitlijning en persistentie van richting. Het stelt dat MEPM-cellen kunnen dienen als een proxymodel voor het bestuderen van de rol van palataal plankmesenchym tijdens het dynamische proces van elevatie. Deze kwantitatieve methoden zullen onderzoekers in het craniofaciale veld in staat stellen om collectieve bewegingsattributen in controle- en mutante cellen te beoordelen en te vergelijken, wat het begrip van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging zal vergroten. Bovendien bieden MEPM-cellen een zeldzaam mesenchymaal celmodel voor onderzoek naar collectieve celbewegingen in het algemeen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van het gehemelte is uitgebreid bestudeerd omdat defecten in palatogenese leiden tot gespleten gehemelte - een veel voorkomende aangeboren afwijking die optreedt in geïsoleerde gevallen of als onderdeel van honderden syndromen1,2. De ontwikkeling van het embryonale gehemelte is een dynamisch proces dat beweging en fusie van embryonaal weefsel omvat. Dit proces kan worden onderverdeeld in vier belangrijke stappen: 1) inductie van palatale planken, 2) verticale groei van de palatale planken naast de tong, 3) verhoging van de palatale planken boven de tong en 4) fusie van de palatale planken op de middellijn1,3,4. In de afgelopen decennia zijn veel muismutanten geïdentificeerd die een gespleten gehemelte manifesteren5,6,7,8. Karakterisering van deze modellen heeft defecten in palatale plankinductie, proliferatie en fusiestappen aangegeven; palatale plankverhogingsdefecten zijn echter zeldzaam. Het begrijpen van de dynamiek van palatale plankverhoging is dus een intrigerend onderzoeksgebied.

Zorgvuldige analyse van sommige muismutanten met palatale plankverhogingsdefecten heeft geleid tot het huidige model waaruit blijkt dat het voorste gebied van de palatale plank omhoog lijkt te klappen, terwijl een verticale naar horizontale beweging of "remodellering" van de palatale planken plaatsvindt in het midden tot achterste gebieden van het gehemelte1,3,4, 9,10,11. Het mediale randepitheel van de palatale plank initieert waarschijnlijk de signalering die nodig is voor deze remodellering, die vervolgens wordt aangedreven door het mesenchym van de palatale plank. Onlangs hebben veel onderzoekers palatale plankverhogingsvertraging geïdentificeerd in muismodellen die voorbijgaande orale verklevingen vertoonden met betrekking tot palataleplanken 12,13. De mesenchymale remodellering omvat reorganisatie van de cellen om een uitstulping in horizontale richting te creëren, terwijl tegelijkertijd de palatale plank in de verticale richting9,10,14wordt ingetrokken. Onder de verschillende mechanismen die worden voorgesteld om de palatale schapverhoging en de onderliggende mesenchymale remodellering tebeïnvloeden,zijn celproliferatie15,16, 17,chemotactische gradiënten18en extracellulaire matrixcomponenten19,20. Een belangrijke vraag rees: is de palatale plankverhogingsvertraging die wordt waargenomen bij Specc1l-deficiënte muizen ook gedeeltelijk te wijten aan een defect in de palatale plankremodellering, en zou dit remodelleringsdefect zich kunnen manifesteren in een intrinsiek defect in het gedrag van primaire MEPM-cellen21?

Primaire MEPM-cellen zijn gebruikt in het craniofaciale veld voor vele studies met genexpressie22,23,24,25,26,27,28,29,en een paar met proliferatie30,31 en migratie25,31,32 , maar geen voor collectieve celgedragsanalyse. Time-lapse beeldvorming van MEPM-cellen werd uitgevoerd in 2D-cultuur en wondhersteltests om aan te tonen dat MEPM-cellen directionele beweging vertoonden en dichtheidsafhankelijke celstromen-attributen van collectieve beweging vormden21. Bovendien vormden Specc1l-mutante cellen smallere celstromen en vertoonden ze zeer variabele celmigratietrajecten. Dit gebrek aan gecoördineerde beweeglijkheid wordt geacht bij te dragen aan de vertraging van de verhoging van het gehemelte in Specc1l mutante embryo's13,21. Deze relatief eenvoudige testen met behulp van primaire MEPM-cellen kunnen dus dienen als een proxy voor het bestuderen van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging. Dit artikel beschrijft de isolatie en cultuur van primaire MEPM-cellen, evenals de time-lapse beeldvorming en analyse, voor de 2D- en wondhersteltests.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met een protocol dat is goedgekeurd door de KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met hun richtlijnen en voorschriften (Protocolnummer: 2018-2447).

1. Oogst E13.5 embryo's

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke muizen met behulp van een CO 2-inhalatiekamer of volgens een procedure die is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Ga onmiddellijk over tot dissectie.
  2. Stel de inferieure helft van de buikholte bloot door de huid en het peritoneum te verwijderen. Snijd beide hoorns van de baarmoeder, die de E13.5-embryo's bevatten.
  3. Plaats de baarmoeder kort in voorverwarmde steriele fosfaatbuffered saline (PBS) van 37 °C om overtollig bloed, haar of ander vuil af te spoelen. Plaats de baarmoeder in een steriele schaal van 10 cm gevuld met steriel PBS.
  4. Snijd met een kleine schaar door de baarmoederwand over de lengte van de baarmoeder om elk embryo bloot te leggen, nog steeds in zijn dooierzak. Verwijder de dooierzak rond het embryo, maar bewaar deze indien nodig voor genotypering. Terwijl de embryo's worden verwijderd, plaatst u elk embryo in zijn eigen put van een 12-well plaat gevuld met PBS.

2. Dissectie van palatale planken van embryo's (Figuur 1)

OPMERKING: Steriliseer de roestvrijstalen dissectie-instrumenten (zie de tabel met materialen)na het verwerken van elk embryo door de instrumenten eerst in een bekerglas van 100% ethylalcohol (EtOH) te plaatsen, vervolgens in een instrumentsilisator bij 350 °C gedurende 10 s en ze vervolgens af te koelen in een tweede bekerglas van 100% EtOH.

  1. Plaats het embryo met behulp van een gesteriliseerde geperforeerde lepel in een nieuwe schaal van 10 cm gevuld met MEPM-kweekmedium bestaande uit Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine (4 mM L-Glu) en de antibiotica-penicilline en streptomycine (50 eenheden / ml).
  2. Onthoofd het embryo direct onder de kaaklijn met een steriele schaar(figuur 1A,rode stippellijn). Verwijder de onderkaak door een punt van de gesteriliseerde fijne # 5 tang in de mond te steken en deze net in de wang te houden. Duw de punt van de ingebrachte tang door totdat deze uit de achterkant van de schedel komt.
  3. Oriënteer de tang, langs de gele lijn in figuur 1B, zodat de andere kant van de tang (die zich nog buiten het embryo bevindt) net boven de gehoorgang zweeft en knijp vervolgens de tang dicht om het weefsel door te snijden. Laat indien nodig nog een fijne tang langs de naad van de nu gesloten tang lopen om door weefsel te snijden dat niet volledig is doorgesneden door de knijp.
  4. Herhaal de vorige stap voor de andere kant van de embryokop. Ga door met de knijpprocedure om de onderkaak, tong en het inferieure deel van de schedel volledig te verwijderen en de palatale planken bloot te leggen.
  5. Verwijder de schedel door net boven de ogen te snijden, zoals weergegeven in figuur 1C (groene lijn). Doe dit door het hoofd aan de linker- of rechterkant te plaatsen en de punten van de kleine roestvrijstalen schaar voor en achter de schedel net boven de ooghoogte van het embryo te plaatsen. Knip de bovenkant van de schedel af met een snelle knip van de schaar, waardoor een plat oppervlak ontstaat dat belangrijk is voor stabiliteit in latere stappen en dat er vanaf de zijkant uit moet zien als Figuur 1D.
  6. Plaats het resterende deel van het hoofd ondersteboven, waarbij het superieure aspect van de kop (schedel verwijderd) plat op de bodem van de schaal rust, wat een stabiel oppervlak biedt voor het verwijderen van de palatale plank. Neem even de tijd om de palatale planken te identificeren, die nu bloot en naar boven gericht zijn en verschijnen als twee verhoogde richels aan weerszijden van een centrale groef in de voorste helft van het hoofd (figuur 1E).
  7. Pin het resterende deel van de kop op de schaal om deze te immobiliseren terwijl de planken worden verwijderd. Doe dit door een punt van een fijne tang door het weefsel in de buurt van het neusgebied van het hoofd te steken, vooraan bij de palatale planken, en het andere punt van de tang door de basis van de schedel in te brengen, achterste naar de palatale planken. Houd deze op hun plaats tijdens het uitvoeren van de excisie van de palatale planken.
    1. Immobiliseer het hoofd met één hand, kies een van de twee planken om eerst te verwijderen en steek beide punten van een tweede paar fijne tangen in het weefsel aan de basis van het laterale oppervlak van de plank en knijp om het weefsel te snijden (Figuur 1F). Herhaal dit langs de basis van het mediale oppervlak van de plank en vervolgens aan zowel de voorste als de achterste uiteinden van de plank om los te komen van het hoofd.
  8. Til de plank voorzichtig op en maak indien nodig extra knijpen om de plank volledig te bevrijden van het omliggende weefsel.
  9. Herhaal de vorige twee stappen om de tweede palatale plank te verwijderen.
  10. Nu de palatale planken zijn bevrijd van het omliggende weefsel en in PBS(figuur G)zijn geplaatst, gebruikt u een steriele plastic boltransferpipet om de planken in de pipet op te tekenen en over te brengen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml samen met ongeveer 500 μL PBS. Houd de buisjes met palatale planken op ijs terwijl de rest van het strooisel op dezelfde manier wordt verwerkt.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen planken onmiddellijk na dissectie in een microcentrifugebuis van 1,5 ml worden geplaatst die voorverwarmde trypsine (0,25%) bevat (in plaats van ze op ijs te plaatsen). De monsters zullen verser zijn, maar er moet voor worden gezorgd dat alle stappen voor elk afzonderlijk monster worden getimed in plaats van de monsters gezamenlijk te behandelen.

3. Kweek van MEPM-cellen

OPMERKING: Onder de hier beschreven omstandigheden overleven de epitheelcellen van het gehemelte de eerste passage niet, wat resulteert in een zuivere mesenchymale celkweek van het gehemelte. Gebruik steriele techniek om alle stappen in een weefselkweekkap uit te voeren.

  1. Aspirateer en gooi de PBS weg uit de buis van 1,5 ml, zorg ervoor dat u de planken tijdens het proces niet weggooit. Voeg onmiddellijk 200 μL voorverwarmd (37 °C) trypsine (0,25%) toe aan elke buis die palatale planken bevat. Pipetteer de planken kort op en neer in de trypsine met behulp van een pipetpunt van 1000 μL om de trypsinisatie te versnellen.
  2. Incubeer de buizen gedurende 5 minuten bij 37 °C en pipetteer vervolgens elk monster op en neer om het weefsel te helpen breken. Incubeer de buisjes nog eens 5 minuten bij 37 °C en pipetteer nogmaals op en neer om de dissociatie van het weefsel te voltooien.
    OPMERKING: De planken moeten volledig of bijna volledig worden gedissocieerd en in de trypsine worden gesuspendeerd zonder zichtbare stukjes weefsel die overblijven.
  3. Voeg 800 μL MEPM-kweekmedium (stap 2.1) toe aan elke buis van 1,5 ml. Centrifugeer de buis van 1,5 ml bij 200 × g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in 1 ml MEPM-kweekmedium.
  4. Plaats de MEPM-cellen in een met 6-putjes weefselkweek behandelde plaat met MEPM-kweekmedium. Laat de cellen zich 12 uur bij 37 °C hechten aan het plastic oppervlak in een incubator met 5% CO2.
    OPMERKING: Na nachtelijke incubatie zal de overgrote meerderheid (~ 90%) van de cellen zich hechten. Op dit punt zien de aangekleefde cellen er redelijk homogeen uit, met een driehoekige of enigszins langwerpige vorm.
  5. Vervang het medium elke dag door het oude medium voorzichtig aan te zuigen en onmiddellijk te vervangen door 1 ml warme steriele PBS zonder calcium of magnesium gedurende ~ 1 minuut. Aspirateer de PBS en vervang door 3 ml voorverwarmd MEPM-kweekmedium.
  6. Doorloop de cellen zodra ze 100% confluent worden.
    OPMERKING: MEPM-cellen zouden zich bijna dagelijks in aantal moeten vermenigvuldigen.
    1. Om de cellen te passeren, aspiraleer je voorzichtig het oude medium en vervang je het onmiddellijk door warme PBS zonder calcium of magnesium gedurende ~ 1 minuut. Adem de PBS op en vervang deze door 0,5 ml voorverwarmd 0,25% trypsine.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende ~ 5 minuten, of totdat de cellen loskomen van het oppervlak van de schaal wanneer ze voorzichtig met de hand heen en weer worden gewiegd. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u onmiddellijk 5 ml voorgewarmd MEPM-kweekmedium toe aan de trypsine-cellen.
    3. Gebruik een serologische pipet van 10 ml, verzamel de cellen voorzichtig in een conische buis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 × g om de cellen te pelleteren. Adem het trypsine en medium op en resuspend de cellen in 3 ml voorverwarmd MEPM-kweekmedium. Pipetteer voorzichtig 1 ml cellen in een enkele put van een 6-well dish en voeg 2 ml MEPM-kweekmedium toe om het totale volume op 3 ml te brengen.
      OPMERKING: Dit vormt een 1:3 verdeling van cellen. Europarlementariërs kunnen maximaal drie keer worden gepasseerd. De zaaidichtheid van MEPMs is enigszins flexibel en het aantal aanwezige cellen varieert afhankelijk van het kweekvat. MepMs verspreiden zich echter niet goed wanneer ze te dun worden gesplitst en moeten ten minste 20-25% confluent zijn in hun nieuwe gerecht zodra ze zich hechten.

4. Cryopreservatie van MEPM-cellen

  1. Zodra trypsinized MEPM-cellen zijn gepelletiseerd, resuspend de cellen in MEPM-kweekmedium om een concentratie van ~ 1 × 106 cellen / ml te verkrijgen. Pipetteer de cellen in cryovialen en voeg een eindconcentratie van 5% dimethylsulfoxide toe aan de celvoorraad. Dop het cryoviaal, meng kort door om te keren en plaats de injectieflacons onmiddellijk in een vriescontainer die afkoelt met een snelheid van 1 °C/min.
  2. Plaats de koeler een nacht in een vriezer van -80 °C. Verplaats de volgende dag de cryovialen naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  3. Ontdooien van gecryopreserveerde MEPM-cellen
    1. Verwijder de cryovialen uit de vloeibare stikstoftank en ontdooi bij kamertemperatuur totdat de inhoud vloeibaar begint te worden. Leeg de inhoud in een conische buis van 15 ml met 9 ml voorverwarmd MEPM-kweekmedium.
    2. Centrifugeer de buis op 200 × g om de cellen te pelleteren. Resuspend de cellen in 1 ml MEPM-kweekmedium en pipetteer de cellen in een enkele put van een 6-well plaat. Voeg 2 ml warm MEPM-kweekmedium toe om het totale volume op 3 ml te brengen.
    3. Kweek de cellen bij 37 °C in een incubator met 5% CO2. Verander het medium dagelijks.

5. Live-imaging van MEPM-cellen - 2D collectieve migratietest (Figuur 2)

  1. Bereid een plaat voor om te gebruiken voor live beeldvorming.
    1. Gebruik een kleine chirurgische schaar of een scherpe scalpel om een steriele 2-well siliconen insert in te korten tot een hoogte van ~ 1 mm. Bereid een inzetstuk voor voor elk monster dat wordt gebruikt.
    2. Plaats met behulp van een tang de verkorte 2-well siliconen insert in het midden van een put van een 6-well plaat. Druk langs alle randen naar beneden om ervoor te zorgen dat het volledig hecht.
  2. Ontdooi gecryopreserveerde cellen door de stappen in paragraaf 4.3 van dit protocol te volgen. Tel MEPM-cellen en zaad 300 cellen/mm2 van de verkorte siliconeninzetstukken in een totaal volume van 40-50 μL MEPM-kweekmedium per put. Kweek de cellen 's nachts bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.
  3. Bereid je de volgende dag voor op live time-lapse-beeldvorming.
    1. Gebruik een fasecontrastmicroscoop met een incubator op het podium en automatische beeldvormingsmogelijkheden. Voeg water toe aan het incubatorreservoir op het podium om de verdamping van het kweekmedium te verminderen; stel de temperatuur in op 37 °C en CO2 op 5%. Wacht ~ 30 minuten voordat de vochtigheid zich opbouwt voordat u de 6-well schotel in de incubator op het podium plaatst.
  4. Gebruik instellingen die gelijkwaardig zijn aan de volgende voor time-lapse-beeldvorming.
    1. Selecteer het 4x-objectief om grote gezichtsvelden en fasecontrastfilter te hebben.
      OPMERKING: Autofocus, Auto find sample, z-stack en auto-lighting zijn meestal niet nodig.
    2. Selecteer twee microscopische velden per put om het lumen van de verkorte siliconeninzetstukken vast te leggen. Zorg ervoor dat alle beeldposities de juiste focus hebben.
      OPMERKING: Beeldvlakken kunnen tijdens het afbeelden worden aangepast, maar een dergelijke aanpassing is meestal niet nodig.
    3. Selecteer het gewenste bestandstype voor het uitvoeren van afbeeldingen en selecteer vervolgens naar wens opties voor post-imaging, zoals het automatisch maken van video's en watermerken. Selecteer indien van toepassing fasecontrast als beeldmodus.
      OPMERKING: Het gebruik van watermerken kan volgende beeldverwerkingsstappen belemmeren.
    4. Stel de duur van de opname in op 72 uur. Stel het programma in om elke 10 minuten beelden vast te leggen.
      OPMERKING: Gewoonlijk is slechts 48 uur beeldvorming vereist, maar beeldvorming kan op elk moment vóór de 72 h-markering worden gestopt zonder beelden te verliezen die al zijn gemaakt.
    5. Zorg ervoor dat de milieukamer operationeel is zoals vereist in 5.3.1. Sla deze instellingen(de routine)op en begin met het maken van een afbeelding.
  5. Ga door met het afbeelden tot 72 uur (of de opgegeven tijd).

6. Live-imaging van MEPM-cellen in een wondhersteltest (Figuur 3)

  1. Bereid een plaat voor om te gebruiken voor live-imaging. Plaats met behulp van een tang een steriel 2-well siliconen inzetstuk in het midden van een put van een 6-well plaat en druk langs alle randen naar beneden om ervoor te zorgen dat het volledig hecht. Bereid een 2-well insert voor elk monster dat wordt gebruikt.
  2. Ontdooi gecryopreserveerde cellen door de stappen in paragraaf 4.3 van dit protocol te volgen. Tel MEPM-cellen en concentreer de cellen indien nodig tot ten minste 350 cellen/μL.
  3. Zaai 1400 cellen/mm2 in de siliconen inserts in een volume van 100 μL MEPM kweekmedium per putje. Kweek de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2en verander het medium elke dag.
  4. Bereid na 48 uur een microscoop voor op live time-lapse beeldvorming zoals beschreven in rubrieken 5.3 en 5.4. Voeg onmiddellijk voordat u de cellen in de incubator op het podium plaatst, 3 ml voorgewarmd MEPM-kweekmedium toe aan de put (maar buiten de inzetstukken) en verwijder vervolgens voorzichtig de siliconeninzetstukken.
    OPMERKING: De muur die de 2 kamers scheidt, laat een opening achter die de "wond" is.
  5. Start time-lapse beeldvorming zoals beschreven in 5.4, met de volgende verschillen:
    1. Gebruik een hogere vergroting (bijvoorbeeld 10x) doelstelling. Om de wondsluiting vast te leggen, selecteert u 5 gezichtsvelden langs elke wond, zodat de wond evenwijdig is aan de verticale as van de afbeelding.
  6. Stop met beeldvorming na 72 uur of wanneer de wonden volledig gesloten zijn.

7. Computationele analyse van time-lapse beeldsequenties

OPMERKING: Voer de volgende procedures uit op een computer die is uitgerust met standaard rekenhulpmiddelen, zoals de python-interpreter, C-compiler en een shell (zie de tabel met materialen).

  1. Confluency analyse
    OPMERKING: Deze procedure kan worden gebruikt om celproliferatie binnen een schaarse cultuur te schatten of om wondsluitingsexperimenten te kwantificeren. Om gebieden te detecteren die door cellen worden bezet, wordt een segmentatiedrempel toegepast op de lokale standaardafwijking van de helderheid van de afbeelding. De code is eerder beschreven door Wu et al.33 en Neufeld et al.34 en is beschikbaar op http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Bepaal de segmentatiedrempel voor de afbeeldingen. Als u bijvoorbeeld de segmentatie met een drempel 4 wilt zien, geeft u de opdracht
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -testuitgang.jpg
      en controleer vervolgens de uitvoer(uitvoer.jpg).
      OPMERKING: Als de drempel te laag is, worden achtergrondgebieden in de micrograaf geclassificeerd als met cellen bedekt. Als de drempel daarentegen te hoog is, worden met cellen bedekte gebieden niet als zodanig geclassificeerd. De optimale drempelwaarde houdt beide fouten tot een minimum beperkt.
    2. Gebruik het meegeleverde area.sh-script om samenvloeiingswaarden te berekenen voor een reeks afbeeldingen als
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > samenloop.dat
      OPMERKING: De discriminatiedrempelwaarde 4 wordt geverifieerd in stap 1 en de resultaten worden opgeslagen in het bestand confluency.dat. Door de afbeeldingen in de juiste mappen te sorteren, kan de lijst met namen van afbeeldingsbestanden worden vervangen door jokertekens:
      area.sh -S4 *.jpg > samenvloeiing.dat
    3. Voor wondsluitingsexperimenten transformeert u de confluentiegegevens A(t)- de grootte van het met cellen bedekte gebied, uitgedrukt als een percentage als een functie van de tijd-in-wondrandvoortplantingssnelheid V als
      figure-protocol-1
      waarbij w de breedte van het veld aangeeft en dA/dt de tijdsderivaat van A(t), d.w.z. de expansiesnelheid van het met cellen bedekte gebied.
  2. Celmotiliteitskaart
    1. Voer een deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) algoritme uit om de beweeglijkheid van cellen te karakteriseren en de mate van lokale beweging "optische stroom" tussen beeldparen te extraheren, maar niet om individuele cellen te identificeren.
      OPMERKING: Hier wordt een initiële venstergrootte van 50 μm gebruikt, zoals in detail beschreven door Zamir et al.35 en Czirok et al.36, met een initiële venstergrootte van 50 μm. De PIV-analyse levert een snelheidsveld v(x,t) op voor elk beeldframe t en locatie (binnen de afbeelding) x.
    2. Extraheer de gemiddelde snelheid van de celmotiliteit uit v(x,t) als een ruimtelijk gemiddelde berekend over het door de cel bezette gebied, zoals bepaald in punt 7.1.
  3. Handmatige celtracking
    OPMERKING: Hoewel de PIV-analyse een automatische beoordeling van de beweeglijkheid van cellen biedt, is het vaak handmatig volgen vereist om zich te concentreren op het gedrag van individuele cellen. Hoewel verschillende tools deze functionaliteit bieden, is het erg handig als de handmatig geplaatste markeringen na hun eerste plaatsing kunnen worden gewijzigd en als tracking zowel vooruit als achteruit in de tijd kan worden uitgevoerd.
    1. Voer celtracking uit met een speciaal ontwikkeld Python-hulpprogramma (http://github.com/donnagreta/cm_track), dat ook basisfuncties biedt, zoals het verwijderen van trajectsegmenten.
      OPMERKING: Deze handmatige trackingtool levert de posities P (i, t) van cel i op tijdstip t in een tekstbestand en wordt aangeroepen als
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      waarbij de time-lapse-afbeeldingen zich in de mapafbeeldingen bevinden/ en de positiegegevens worden verzameld in de bestandstrack.dat (figuur 4).

figure-protocol-2
Figuur 4: Analyse van individuele celtrajecten. (A) Fasecontrast time-lapse micrografieën worden onderworpen aan (B, C) een handmatige trackingprocedure, die cellen markeert (groene stippen). (D) Celposities (x,y) worden opgeslagen voor elke cel die zich onderscheidt door zijn ID en voor elk frame f. (E) Trajecten kunnen over de micrografieën worden gelegd en kleurgecodeerd om temporele informatie aan te geven. Als voorbeeld, in elk traject geeft een blauw naar rood kleurenpalet geleidelijk latere trajectsegmenten aan, waarbij rood en blauw respectievelijk de initiële en laatste cellocaties markeren. (F) Verschillende statistische eigenschappen van trajecten, zoals de gemiddelde vierkante verplaatsing, kunnen worden geëxtraheerd en gebruikt om de beweeglijkheid van verschillende celpopulaties te karakteriseren, die in dit voorbeeld wildtype (wt, blauw) en knockdown (kd, rood) MEPM-cellen omvatten. De scalebars vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Overlaytrajecten op afbeeldingen met behulp van een tweede gereedschap, aangeroepen als
    visdat.py -d track.dat -i images/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2
  2. Verzamel de afbeeldingen met de trajecten eroverheen in de mapoverlay.
    OPMERKING: In dit voorbeeld worden celpositiegegevens opgeslagen in de bestandstrack.dat, terwijl de time-lapse-afbeeldingsreeks zich in de mapafbeeldingen bevindt. De rest van de parameters bepalen de maximale lengte van de getekende trajecten (-l), de grootte van de symbolen (-r) en het gebruikte kleurenschema (-C).
  1. Analyse van individuele celtrajecten
    1. Trajecten karakteriseren door de totale padlengte
      figure-protocol-3,
      en netto verplaatsing naar de wond
      figure-protocol-4,
      waarbij X de projectie van P aangeeft in de richting loodrecht op de wond: de x-coördinaat van de posities wanneer de wond evenwijdig is aan de y-as.
    2. Bereken de geleidingsefficiëntie zoals figure-protocol-5 voor elke cel i en tijdspunt t37. Karakteriseer culturen door het populatiegemiddelde van deze eencellige metingen, geëvalueerd op een geschikt tijdstip t.
  2. Collectieve streaming beweging van cellen
    1. Karakteriseer de lokale ruimtelijke correlaties van celbewegingen door de gemiddelde snelheid van andere cellen die zich in de buurt van een bewegende cel bevinden, zoals eerder beschreven38,39.
      OPMERKING: De rekencode is beschikbaar op https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Lijn een referentiesysteem uit met de richtingen voor, achter, links en rechts naar elke vector v(x,t) (Figuur 5A). Wijs elk van de omringende cellen of PIV-snelheidsvector toe aan de juiste ruimtelijke cel van het referentiesysteem (figuur 5B). Herhaal de procedure omdat elke vector dient als de oorsprong van de referentiesystemen (Figuur 5C, D) zodat een gegeven snelheidsvector aan meerdere bakken wordt toegewezen.
        OPMERKING: Een gegevenspunt kan zich voor een vector en links van een andere vector staan.
      2. Draai de referentiesystemen in een gemeenschappelijke oriëntatie(figuur 5C,F)en bundel ze(figuur 5G).
        OPMERKING: Het gemiddelde van elke bak van de gepoolde snelheidsgegevens is een snelheidsvector (U) die indicatief is voor ruimtelijke correlatie: het gemiddelde is een maat voor een gedeelde snelheidscomponent (Figuur 5H).
      3. Plaats de U(x)-stroomvelden met een exponentiële figure-protocol-6 functie, waarbij a, x0 en U0 passende parameters zijn. Van de drie aanpassingsparameters richt u zich op x0, de correlatielengte (Figuur 5I,J), wat de karakteristieke afstand is waar lokale snelheid-snelheid correlaties verdwijnen.

figure-protocol-7
Figuur 5: Karakterisering van de stroomvorming van gekweekte cellen. (A,D) Fasecontrast time-lapse beelden uit figuur 4A worden gebruikt om celbewegingen te identificeren. Voor elke bewegende cel werden een referentiekader (blauw) en ruimtelijke bakken (wit) samen uitgelijnd om aangrenzende cellen te categoriseren als zijnde voor, achter, links of rechts. (B, E) De snelheid van aangrenzende cellen (zwarte vectoren) was gerelateerd aan hetzelfde referentiekader (C,F). Deze procedure werd herhaald voor elke cel en elk tijdspunt. (G) Na het bundelen van deze lokale informatie bevat elke bin meerdere snelheidsvectoren (grijs), die kunnen worden gemiddeld om de gemiddelde co-bewegende snelheid (magenta-pijlen) op verschillende locaties ten opzichte van een gemiddelde beweeglijke cel te bepalen. (H) De gemiddelde snelheidskaart karakteriseert dus de typische celsnelheden op verschillende locaties ten opzichte van een bewegende cel. (I, J) Ten slotte werd dit veld bemonsterd langs de voor-achter (parallelle) as en ook langs de links-rechts (loodrechte) as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dissectie van palatale planken wordt geïllustreerd in figuur 1. De volgorde van incisies is ontworpen om uitglijden van het weefsel te minimaliseren. Na het verwijderen van de kop(figuur 1A,B)wordt de onderkaak verwijderd(figuur 1B,C). De incisie van het bovenste deel van de kop (Figuur 1C, D) wordt gedaan om het weefsel te stabiliseren wanneer het o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Palatale plankverhoging vormt een verticale tot horizontale verbouwingsgebeurtenis1,3,4,9,11. Er wordt gepostuleerd dat dit remodelleringsproces vereist dat palatale plank mesenchymale cellen zich gecoördineerd gedragen. De analyses met wildtype MEPM-cellen tonen aan dat dit celgedrag intrinsiek is en gekwantificeerd kan worden21. Deze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies DE026172 (I.S.) en GM102801 (A.C.). I.S. werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) -beurs (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) en Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) -beurs (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Beaker, 250 mL (x2)Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
Conical tubes, 15 mL (x1)Midwest ScientificC15B
Debian operating systemcomputationele analyse van time-lapse beelden
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose met 4 mM L-Glutamine en Sodium PyruvaatCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH, 100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
EVOS Onstage IncubatorThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well PlatesThermoFisher ScientificAMEPVH028
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Fine point #5 roestvrijstalen tang (x2)Fine Science Tools11295-10Dissectie
Instrumenten sterilisator kralenbadFine Science Tools18000-45
Microcentrifugebuisjes, 1,5 mLAvant2925
Micro-dissectie roestvrijstalen schaar, rechtRobozRS-5910Dissectie
NucBlue (Hoechst) Live Ready ProbesThermoFisher ScientificR37605
Penicilline Streptomycine oplossing, 100xCorning30-002-CI
Siliconen inzet, 2-wellIbidi80209
Kleine geperforeerde roestvrijstalen lepelFine Science ToolsMC17CDissectie
Verenschaar, 4 mmFine Science Tools15018-10
Steriele 10 cm schotel(s)Corning430293
Steriele 12-well plaat(en)PR1MA667512
Steriele 6-well plaat(en)Thermo Fisher Scientific140675
Steriele PBSCorning21-031-CV
Steriele plastic bulb transfer pipetteThermoFisher Scientific202-1S
Trypsine, 0,25%ThermoFisher Scientific25200056

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463(2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186(2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006(2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Collectieve celbewegingelevatie van de palatale platendissectie van muisembryo scelmigratie assaywondherstel assaymesenchymale remodelleringcraniofaciale ontwikkelinganalyse van celmotiliteit

Gerelateerde artikelen