Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Summary

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Abstract

Ontwikkeling van het gehemelte is een dynamisch proces, waarbij verticale groei van bilaterale palatale planken naast de tong wordt gevolgd door verhoging en fusie boven de tong. Defecten in dit proces leiden tot gespleten gehemelte, een veel voorkomende aangeboren afwijking. Recente studies hebben aangetoond dat palatale plankverhoging een verbouwingsproces omvat dat de oriëntatie van de plank transformeert van een verticale naar een horizontale. De rol van de palatale plank mesenchymale cellen in deze dynamische remodellering is moeilijk te bestuderen. Time-lapse-imaging-gebaseerde kwantitatieve analyse is onlangs gebruikt om aan te tonen dat primaire muis embryonale palatale mesenchymale (MEPM) cellen zichzelf kunnen organiseren in een collectieve beweging. Kwantitatieve analyses konden verschillen in gemuteerde MEPM-cellen identificeren van een muismodel met gehemelte-elevatiedefecten. Dit artikel beschrijft methoden om MEPM-cellen van E13.5-embryo's te isoleren en te kweken - specifiek voor time-lapse beeldvorming - en om verschillende cellulaire kenmerken van collectieve beweging te bepalen, waaronder metingen voor stroomvorming, vormuitlijning en persistentie van richting. Het stelt dat MEPM-cellen kunnen dienen als een proxymodel voor het bestuderen van de rol van palataal plankmesenchym tijdens het dynamische proces van elevatie. Deze kwantitatieve methoden zullen onderzoekers in het craniofaciale veld in staat stellen om collectieve bewegingsattributen in controle- en mutante cellen te beoordelen en te vergelijken, wat het begrip van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging zal vergroten. Bovendien bieden MEPM-cellen een zeldzaam mesenchymaal celmodel voor onderzoek naar collectieve celbewegingen in het algemeen.

Introduction

De ontwikkeling van het gehemelte is uitgebreid bestudeerd omdat defecten in palatogenese leiden tot gespleten gehemelte - een veel voorkomende aangeboren afwijking die optreedt in geïsoleerde gevallen of als onderdeel van honderden syndromen^1,2. De ontwikkeling van het embryonale gehemelte is een dynamisch proces dat beweging en fusie van embryonaal weefsel omvat. Dit proces kan worden onderverdeeld in vier belangrijke stappen: 1) inductie van palatale planken, 2) verticale groei van de palatale planken naast de tong, 3) verhoging van de palatale planken boven de tong en 4) fusie van de palatale planken op de....

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met een protocol dat is goedgekeurd door de KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met hun richtlijnen en voorschriften (Protocolnummer: 2018-2447).

1. Oogst E13.5 embryo's

1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke muizen met behulp van een CO 2-inhalatiekamer of volgens een procedure die is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Ga onmiddellijk over tot dissectie.
2. Stel de inferieure helft van de buikholte bloot door de huid en het peritoneum te verwijderen. Snijd beide hoorns van de baarmoeder, die de E13.5-embryo's bevatten.
....

Results

De dissectie van palatale planken wordt geïllustreerd in figuur 1. De volgorde van incisies is ontworpen om uitglijden van het weefsel te minimaliseren. Na het verwijderen van de kop(figuur 1A,B)wordt de onderkaak verwijderd(figuur 1B,C). De incisie van het bovenste deel van de kop (Figuur 1C, D) wordt gedaan om het weefsel te stabiliseren wanneer het o.......

Discussion

Palatale plankverhoging vormt een verticale tot horizontale verbouwingsgebeurtenis^1,3,4,9,11. Er wordt gepostuleerd dat dit remodelleringsproces vereist dat palatale plank mesenchymale cellen zich gecoördineerd gedragen. De analyses met wildtype MEPM-cellen tonen aan dat dit celgedrag intrinsiek is en gekwantificeerd kan worden²¹. Deze .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker, 250 mL (x2)	Fisher Scientific	FB-100-250
CO2	Matheson Gas	UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1)	Midwest Scientific	C15B
Debian operating system			computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate	Cytiva Life Sciences	SH30243.01
EtOH, 100%	Decon Laboratories	2701
EVOS FL Auto	ThermoFisher Scientific	AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator	ThermoFisher Scientific	AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates	ThermoFisher Scientific	AMEPVH028
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2)	Fine Science Tools	11295-10	Dissection
Instrument sterilizer bead bath	Fine Science Tools	18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL	Avant	2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight	Roboz	RS-5910	Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes	ThermoFisher Scientific	R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Silicone Insert, 2-well	Ibidi	80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon	Fine Science Tools	MC17C	Dissection
Spring Scissors, 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
Sterile 10 cm dishe(s)	Corning	430293
Sterile 12-well plate(s)	PR1MA	667512
Sterile 6-well plate(s)	Thermo Fisher Scientific	140675
Sterile PBS	Corning	21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette	ThermoFisher Scientific	202-1S
Trypsin, 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056