Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Samenvatting

Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Samenvatting

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) in combinatie met massaspectrometrie (MS) is een onschatbaar hulpmiddel geworden in structurele proteomica om eiwitinteracties, structuur en eiwitconformatiedynamiek te ondervragen als functie van oplosmiddeltoegankelijkheid. In de afgelopen jaren is het bereik van FPOP, een hydroxyl radicale eiwitvoetdruktechniek (HRPF), uitgebreid naar eiwitetikettering in levende celculturen, wat de middelen biedt om eiwitinteracties in de ingewikkelde cellulaire omgeving te bestuderen. In-cell eiwitmodificaties kunnen inzicht geven in ligand geïnduceerde structurele veranderingen of conformationele veranderingen die gepaard gaan met eiwitcomplexvorming, allemaal binnen de cellulaire context. Eiwitvoetafdruk is bereikt met behulp van een gebruikelijk flow-based systeem en een 248 nm KrF excimer laser om hydroxylradicalen op te leveren via fotolyse van waterstofperoxide, waarvoor 20 minuten analyse nodig is voor één celmonster. Om tijdsgebonden FPOP-experimenten mogelijk te maken, werd het gebruik van een nieuw 6-well plate-based IC-FPOP-platform geïntroduceerd. In het huidige systeem bestraalt een enkele laserpuls één hele put, waardoor het experimentele FPOP-tijdsbestek wordt verkort, wat resulteert in 20 seconden analysetijd, een 60-voudige afname. Deze sterk verkorte analysetijd maakt het mogelijk om cellulaire mechanismen zoals biochemische signaalcascades, eiwitvouwen en differentiële experimenten (d.w.z. drugsvrij versus drugsgebonden) op een tijdsafhankelijke manier te onderzoeken. Deze nieuwe instrumentatie, getiteld Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), stelt de gebruiker in staat om celkweek en IC-FPOP direct op de optische bank uit te voeren met behulp van een platform incubator met temperatuur, CO₂ en vochtigheidsregeling. Het platform bevat ook een positioneringsfase, peristaltische pompen en spiegeloptiek voor laserstraalgeleiding. IC-FPOP-omstandigheden zoals opticaconfiguratie, debieten, transfecties van voorbijgaande aard en H₂O_{2-concentratie} in PIXY zijn geoptimaliseerd en peer-reviewed. Automatisering van alle componenten van het systeem vermindert menselijke manipulatie en verhoogt de doorvoer.

Inleiding

Eiwitvoetafdruktechnieken kunnen diepgaande informatie onthullen over de organisatie van eiwitten. Deze essentiële structurele biologie MS-gebaseerde technieken zijn een onderdeel van de massaspectrometrie toolbox. Deze methoden onderzoeken eiwit hogere orde structuur (HOS) en synergie via covalente labeling^1,2,3,4. Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) maakt gebruik van hydroxylradicalen om op oxidatieve wijze oplosmiddel toegankelijke zijketens van aminozuren te wijzigen^5,6 (Tabel 1). De methode maakt gebruik van een excimerlaser bij 248 nm voor fotolyse van waterstofperoxide (H₂O₂) om hydroxylradicalen te genereren. Theoretisch kunnen 19 van de 20 aminozuren oxidatief worden gewijzigd, waarbij Gly de enige uitzondering is. Vanwege de variërende reactiviteitssnelheden van aminozuren met hydroxylradicalen is echter experimenteel slechts een subset hiervan gewijzigd. Toch heeft de methode het potentieel voor analyse over de lengte van een eiwitsequentie⁵. FPOP wijzigt eiwitten op de microseconde tijdschaal, waardoor het nuttig is bij het bestuderen van zwakke interacties met snelle off rates. Oplosmiddeltoegankelijkheid verandert bij ligandbinding of een verandering in eiwitconformatie, dus de kracht van de methode ligt in de vergelijking van het etiketteringspatroon van een eiwit in meerdere toestanden (d.w.z. ligandvrij in vergelijking met ligandgebonden). Als gevolg hiervan is FPOP erin geslaagd eiwit-eiwit - en eiwit-ligandinteractieplaatsen en gebieden met conformationele verandering^7,8,9,^10teidentificeren . De FPOP-methode is uitgebreid van de studie van gezuiverde eiwitsystemen tot in-cell analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidatief meer dan duizend eiwitten in cellen wijzigen om structurele informatie te verstrekken over het proteoom^11,12. Het conventionele IC-FPOP-platform maakt gebruik van een stroomsysteem om cellen één bestand langs de laserstraal te laten stromen. De ontwikkeling van dit systeem stelde individuele cellen in staat om gelijke blootstelling aan laserbestraling te hebben. Dit leidde tot een 13-voudige toename van het aantal oxidatief gelabelde eiwitten¹². Een beperking van het stromingssysteem is echter de lengte van een enkel monsterexperiment dat bestaat uit een bestralingsinterval van 10 minuten waarin wijzigingen plaatsvinden en een extra wascyclus van 10 minuten. De tijdsdruk van IC-FPOP maakt het ongeschikt voor het bestuderen van kortlevende eiwitvouwmiddelen of veranderingen die bestaan tussen interactienetwerken in biochemische signaalcascades. Deze tijdelijke beperking inspireerde het ontwerp van een nieuw IC-FPOP-platform met een hogere doorvoer.

Om de eiwitstructuur van hogere orde in de inheemse celomgeving nauwkeurig te meten, maakt het nieuwe ontwerp het mogelijk om celkweek rechtstreeks op het laserplatform te bereiken, waardoor IC-FPOP een hoge doorvoer kan zijn. Deze opstelling maakt ook geminimaliseerde verstoringen van de cellulaire omgeving mogelijk, in tegenstelling tot IC-FPOP met behulp van flow waarbij aanhangende cellen uit het substraat moeten worden verwijderd. Het nieuwe platform maakt het mogelijk ic-FPOP voor te komen in een steriel incubatiesysteem met behulp van een CO₂ en temperatuurgecontroleerde podium bovenkamer, terwijl gebruik wordt gemaakt van geconfigureerde spiegeloptiek voor laserstraalgeleiding, een positioneringssysteem voor XY-beweging en peristaltische pompen voor chemische uitwisseling. Het nieuwe platform voor het uitvoeren van IC-FPOP heet Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figuur 1). In PIXY wordt IC-FPOP uitgevoerd op menselijke cellen die worden gekweekt in zesputplaten in de incubatorkamer van het platform. Voor deze configuratie wordt de laserstraal naar beneden op de plaat gereflecteerd met behulp van straalcompatibele spiegels als een positioneringsfase die de incubator vasthoudt, wordt verplaatst, in het XY-vlak, zodat de laserstraal strategisch is uitgelijnd om slechts één put tegelijk te bestralen. Validatiestudies tonen aan dat IC-FPOP sneller kan worden uitgevoerd in PIXY dan in het stroomsysteem en leidt tot verhoogde aminozuurmodificaties per eiwit. De ontwikkeling van dit nieuwe IC-FPOP-platform zal de kennis die kan worden opgedaan met cellulaire experimenten^{uiteenbouwen 13}.

Protocol

1. Montage van Platform Incubator met beweegbare XY-fase

OPMERKING: Het nieuwe platform omvat het incubatiesysteem, de positioneringsfase en controllers, de peristaltische pompen, de 248 nm KrF excimerlaser en de optische spiegels die op een imperiale optische breadboard zijn gemonteerd.

1. Monteer het incubatiesysteem: de temperatuureenheid, kooldioxide-eenheid, luchtbevochtiger, luchtpomp en aanraakbewakingssysteem (figuur 2A-E).
   OPMERKING: De fabrikant geeft gedetailleerde montage-instructies. Het incubatiesysteem moet stabiliseren tot 5% CO_{2, 37}°C en 85% vochtigheid voordat cellen in de incubator worden groeien. Deze parameters kunnen afhankelijk zijn van de cellijn.
2. Monteer de aangepaste incubator met zes putten, de nanopositioneringsaandrijvingsfase en de XY-aandrijftrap. De eerste schroeft respectievelijk in de laatste.
   OPMERKING: Gedetailleerde montage-instructies van de fabrikant.
3. Sluit de vier peristaltische pompen in een "daisy chain" -reeks aan via RS-232-kabels, met een RS-232 naar USB-kabel aangesloten op de besturingscomputer. Sluit 3,18 mm ID polymeerslang (bijv. Tygon) aan op elk kanaal op elke pompkanaalrol.
   OPMERKING: Elke pomp heeft vier rollen. Richting en debiet van rollen worden handmatig gemanipuleerd.
4. Plaats 1/16" x 1/8" connectoren aan het uiteinde van elke 3,18 mm ID polymeerbuis. Steek het 1/16'' uiteinde van de connector in 1,59 ID polymeerslang en steek vervolgens de polymeerslang in de incubator via aangepaste poorten. Plaats het andere uiteinde van de buis in de oplossing die tijdens IC-FPOP-experimenten wordt toegediend.
   OPMERKING: Voor de perfusielijnen heeft de incubator 36 aangepaste poorten voor buizenlijnen rondom de periferie om alle gebruikte reagentia te huisvesten.
5. Schroef een 50 mm, 248 nm, 45° excimer laserlijn spiegel in een kinematische spiegelbevestiging voor Ø2" optiek in de breadboard 10-11 rasterpunten van de 248 nm laseropening. Plaats de tweede spiegel onder een hoek van 90° ten opzichte van de eerste aan de andere kant van de incubator. Richt de tweede spiegel op ongeveer 45° naar beneden voor laserstraalgeleiding naar de incubator (figuur 2F-J).

2. Synchronisatie en initiële automatisering van het systeem via integratiesoftware

1. Installeer de nieuwste versie van de integratiesoftware die nodig is om de stuurprogramma's en pompen te bedienen.
2. Verwijzend naar de pomphandleiding, hernoemt u de pompen die beginnen met '5' en in waarde toenemen. De commando's kunnen naar het pompsysteem worden gestuurd met behulp van het subprogramma Manual Control in de integratiesoftware.
   OPMERKING: Als u een pomp instelt op kanaalmodus, wordt de pompnaamgevingsconventie automatisch gewijzigd in de set 1, 2, 3 en 4, die overeenkomt met de vier pompkanalen.
3. Open het integratiesoftwareprogramma voor de automatisering van de platformincubator.
4. Kies de juiste USB-comport-apparaatnaam (bijv. COM4) die overeenkomt met de USB-kabel van het pompsysteem in het vervolgkeuzemenu van de aansluiting met het label Comport voor pompen.
5. Klik op de knop Script builder om een script te bewerken/maken voor het geautomatiseerde platform incubator platform. Klik op Script opslaan om de reeks op te slaan als tekstbestand ( Afbeelding3A).
   OPMERKING: De scriptbouwer heeft een gebruikersinterface voor het definiëren van het script met definities van pompnummer, richting, snelheid, volume, buisdiameter, kanaalmodus en getijde vertraging.
6. Als de kanaalmodus gewenst is bij het maken van het script, moet een stap in het script worden gewijd aan het veranderen van de pomp in en uit de kanaalmodus en moeten de volgende stappen die overeenkomen met de pompkanalen worden gelabeld als pompen 1-4.
   OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat geen twee pompen tegelijkertijd in kanaalmodus kunnen zijn tijdens een platform incubator script en dat elke pomp wordt teruggeschakeld naar de legacy-modus nadat de opdrachten naar de benodigde kanalen zijn verzonden.
7. Klik op de knop Script lezen en kies het juiste scriptbestand dat gewenst is voor de platform incubator-bewerking.
8. Schakel de knop Reeks uitvoeren om naar de AAN-positie (groen) om het script uit te voeren en klik vervolgens op de startknop (afbeelding 3B) .

3. Kweek cellen in de platform incubator

OPMERKING: Cellen moeten de dag voor het experimenteren onder steriele omstandigheden in de platformincubator in een celkweekkap worden geplaatst.

1. Schroef de platformincubator los van de nanopositiefase en koppel de temperatuur-, gas- en luchtbevochtigerlijnen los. Na het spuiten van de incubator met 70% ethanol, plaatst u deze in een celkweekkap.
2. Kweek cellen in een T-175 tot ongeveer 80-90% samenvloeiing voorafgaand aan overdracht.
   OPMERKING: De term samenvloeiing wordt gebruikt als maat voor het aantal/de dekking van de cellen in een celkweekschaal of een kolf.
3. Verwijder media en spoel af met buffer.
4. Maak cellen los met trypsine-EDTA met behulp van het protocol van de fabrikant.
5. Resuspend in 8 ml media en tel de cellen.
6. Zaadfibtine/collageen¹⁴ gecoate zes-put platen met ongeveer 90-95 μL van geresuspendeerde cellen in elke put. Dit volume zal geschikt zijn om 80-90% samenvloeiing (~ 1,2 miljoen cellen) in elke put op de volgende dag te bereiken.
   OPMERKING: Platen met zes putten moeten vóór het zaaien met collageen worden bedekt. De reagentia die tijdens IC-FPOP worden gebruikt, zijn doordrenkt met snelle debieten. Gecoate platen zorgen ervoor dat cellen niet voortijdig worden losgemaakt als gevolg van infusie van reagentia.
7. Plaats de gezaaide plaat in de platform incubator en dek af met het kwartsdeksel.
   OPMERKING: Tijdens het ontwerp en de ontwikkeling werd een glazen incubatordeksel veranderd in kwarts, zodat het compatibel is met het ultraviolette laserlicht.
8. Vervang en bevestig de platform incubator terug op de nanopositioning drive stage. Sluit de temperatuur-, gas- en luchtbevochtigerleidingen opnieuw aan.
9. Laat cellen 's nachts samenvloeien.
   OPMERKING: De volgende celkweekstappen zijn optioneel en zijn bedoeld voor experimenten waarbij menselijke cellen tijdelijk worden getransfecteerd. Deze stappen beoordelen de transfectie-efficiëntie onder celkweekomstandigheden.
10. Transfecteert het plasmide dat het gen voor het chimerische eiwit GCaMP2 bevat in HEK 293-cellen met behulp van een commerciële kationisch-lipidetransfectiekit.
11. Voer transfecties van GCaMP2 uit in HEK293T-cellen in twee zesputplaten.
12. Incubeer één zesputsplaat in de platformincubator en de tweede zesputplaat in een standaard CO_2-incubator.
13. Vergelijk transfectie-efficiëntie binnen elke plaat door fluorescentiebeeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

4. Maak blusbuffer en H₂O₂

1. Maak 100 ml blusbuffer met 125 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitrone (PBN) en 125 mM N, N′-Dimethylthiourea (DMTU).
   OPMERKING: DMTU en PBN zijn vrije radicalen aaseters en zijn celdoorlatend.
2. Verdun H₂O₂ tot 200 mM. Elk monster heeft 6 ml H₂O₂ nodig om de cellaag aan de onderkant van elke put volledig onder te dompelen.
   OPMERKING: De blusbuffer wordt de dag ervoor gemaakt en 's nachts bij 4 °C opgeslagen, beschermd tegen licht. Verdun de H₂O₂ op de dag van het experiment.

5. Zet de platform incubator op voor IC-FPOP

OPMERKING: De platform incubator moet onder steriele omstandigheden worden gemonteerd. Monteer de incubator in een steriele celkweekkap.

1. Schroef de platformincubator los van de positioneringsfase en koppel de temperatuur-, gas- en luchtbevochtigerleidingen los.
2. Na het spuiten van de incubator met 70% ethanol, plaatst u deze in de celkweekkap.
3. Verwijder de zesputplaat uit de platformincubator, zet het originele deksel van de plaat vast en bevestig de samenvloeiing van de cellen met behulp van een microscoop.
4. Nadat de celconfluentie is bevestigd, vervangt u de zesputplaat door samenvloeiende cellen terug in de platformincubator in de celkweekkap.
5. Steek drie voorgesneden (15 cm) 1,59 ID polymeerbuizen in elke put via de ingebouwde poorten. Spoel de buizen naar de putwanden en houd vast met aangepaste 3D-geprinte ringen.
   OPMERKING: Zes 33 mm PLA filament 3D-geprinte ringen zijn op maat ontworpen om de slang aan de wanden van de plaat te vastzetten zonder de cellen te verstoren of de laserpuls in de weg te staan.
6. Bedek de platform incubator met het kwartsdeksel. Vervang en bevestig de stage top incubator op het positioneringssysteem. Sluit de temperatuur-, gas- en luchtbevochtigerleidingen opnieuw aan.
7. Sluit 1,59 ID polymeerslang aan op het 1/16" uiteinde van de 1/16x1/8" connectoren.

6. IC-FPOP uitvoeren in de platform incubator

1. Bereid een integratiesoftwarescript voor pomponttrekking voor. Gebruik één peristaltische pomp (pomp 8) om celmedia volledig uit alle zes putten te verwijderen.
2. Priemmiddelen in elk kanaal van de andere drie peristaltische pompen (pompen 5-7). Infuseer H₂O₂ en blus buffer in hun respectievelijke wisselbuizen totdat de reagentia de incubatorpoorten bereiken.
3. Controleer of de laserstraal correct is gehoekt door de spiegels en de incubator onbevangen bereikt.
   OPMERKING: Een laserveiligheidsbril moet worden gedragen wanneer de laser in gebruik is. Bestraal de cellen niet voortijdig tijdens het hengelen/uitlijnen. Gebruik karton om het kwartsdeksel volledig te bedekken bij het uitlijnen van de balk. Gebruik ook een afgedrukte omtrek op wit papier van een plaat met zes putten om verder te bevestigen dat de laserstraal het midden van elke put raakt. Gebruik de instelling Continue puls op de laagste frequentie en energie voor uitlijning.
4. Controleer de laserenergie met behulp van een externe sensor. Gebruik één enkele laserpuls van 160 mJ bij 50 Hz en 27 kV.
   OPMERKING: Voor de volgende stappen is een timer nodig.
5. Bereid het script van de integratiesoftware voor pompinfusie voor na het bevestigen van de uitlijning van de straal.
6. Start de timer en druk tegelijkertijd op de startknop op het script van de integratiesoftwarepomp.
7. Infuseer 200 mM H₂O₂ bij 35 mL/min in de eerste put (6-10 seconden markering op timer).
   OPMERKING: Er is een vertraging van vijf seconden voordat een pomp begint te infuseren. Het duurt ook zeven seconden voordat de puls wordt geactiveerd. De laserpuls moet onmiddellijk na de infusie met H₂O₂ komen.
8. Druk op de startknop op de lasersoftware bij de 5 seconden markering om de puls te activeren bij de 11 seconden markering op de timer.
9. Giet 125 mM blusoplossing bij 35 ml/min direct na de laserpuls in de eerste put. Verplaats handmatig de positioneringsfase om de volgende put uit te lijnen met de laserstraal.
10. Herhaal de bovenstaande stappen 6.5-6.9 totdat elke put is verwerkt.
    OPMERKING: IC-POP wordt uitgevoerd in technisch drievoud van drie laser- en drie niet-lasermonsters. Een verwerkte zes-put plaat dient als een biologische repliceren.
11. Gebruik in een celkweekkap een celschraper om de cellen van elke put over te brengen in individuele conische buizen van 15 ml. Centrifugeer cellen bij 1.200 x g gedurende 5 minuten.
12. Gooi de supernatans en resuspendcellen weg in 100 μL RIPA-lysisbuffer.
13. Breng cellen over op individuele polypropyleen buizen van 1,2 ml.
14. Vries alle monsters in vloeibare stikstof in en plaats ze tot gebruik in een vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.

7. Eiwitextractie, zuivering en proteolyse

1. Ontdooi de monsters en verwarm bij 95 °C in een hitteblok gedurende 5 minuten.
2. Koel na het verwarmen 5 minuten af op ijs.
3. Voeg 25 eenheden nuclease toe aan het cellysaat om enkelstrengs, dubbelstrengs, lineair en circulair DNA en RNA af te doen en incubeer gedurende 15 minuten in de kamer gematigd.
4. Centrifugeer monsters bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
5. Verzamel het supernatant en breng het over in een schone polypropyleen buis.
6. Controleer de eiwitconcentratie met behulp van een colorimetrische eiwittest.
7. Breng 100 μg monster over in een schone polypropyleenbuis en breng tot 100 μL met cellysebuffer.
8. Verminder monsters met 10 mM dithiothreitol (DTT) bij 50 °C gedurende 45 minuten.
9. Koel monsters op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
10. Alkylaat met 50 mM iodoacetamide (IAZ) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    OPMERKING: Bescherm de IAA tegen licht
11. Voeg 460 μL voorgekoelde (-20 °C) aceton toe. Vortexmonsters en 's nachts bij -20 °C plaatsen.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
12. De volgende dag centrifugeer monsters bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
13. Verwijder aceton zonder de eiwitkorrel te verstoren.
14. Voeg 50 μL voorgekoeld (-20 °C) aceton toe met 90%. Vortexmonsters om te mengen en te centrifugeren bij 16.000 x g gedurende nog eens 5 minuten bij 4 °C.
15. Verwijder aceton en laat de monsters 2-3 minuten drogen.
16. Resuspend eiwitkorrel met 10 mM Tris buffer pH 8.
17. Resuspend MS-kwaliteit trypsine (20 μg bouillon) in 40 μL van 10 mM Tris buffer pH 8 en voeg 2,5 μg trypsine toe aan elk monster.
18. Incubeer monsters bij 37 °C 's nachts.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
19. Beoordeel de peptideconcentratie met behulp van een colorimetrische peptidetest.
20. Blus de monsters met 5% mierenzuur.
21. Breng 10 μg monster over in een schone polypropyleenbuis.
22. Droog het monster met een vacuümcentrifuge en resuspend met 20 μL MS-klasse 0,1% mierenzuur (FA) in water.
23. Breng elk monster over op schone autosamplerflacons met voorgesneden doppen.

8. Hoge prestaties Vloeibare Chromatografie-Tandem Massaspectrometrie (LC-MS/MS)

1. Als u FPOP-wijzigingen wilt lokaliseren, analyseert u het verteerd cellysaat met behulp van LC-MS/MS-analyse.
2. Gebruik mobiele fasen van 0,1% FA in water (A) en 0,1% FA in acetonitril (ACN) (B).
3. Plaats 0,5 μg monster op een vangkolom van 180 μm x 20 mm C18 (5 μm en 100 Å) en was de kolom gedurende 15 minuten met 99% (A) en 1% (B).
4. Met behulp van een analytische kolom van 75 μm x 30 cm C18 (5 μm en 125 Å) worden verteerd en gescheiden verteerd peptiden met een debiet van 0,300 μL/min gedurende 120 minuten.
5. Voer de LC-gradiënt als volgt uit: 0−1 min, 3% oplosmiddel B; 2−100 min, 10−45% B;100−110 min, 45-100% B; 110−115 min, 100% B.
6. Reconditioneer de kolom op 3% (B) van 115-116 minuten en houd op 3% (B) van 116-120 minuten.
7. Analyseer geëuteerde peptiden in positieve ionenmodus met nano-elektrospray-ionisatie.
8. Verkrijg MS1-spectra over een m/z-scanbereik van 375-1500 met een resolutie van 60.000.
9. Stel het AGC-doel (Automatic Gain Control) in op 5,0e⁵ met een maximale injectietijd van 50 ms en een intensiteitsdrempel van 5,0e^4.
10. Isoleer precursorionen met ladingstoestanden 2-6 via data-afhankelijke acquisitie (DDA) met een isolatievenster van 1,2 m/z en een cyclustijd van 4 seconden.
11. Onderwerp MS2-ionen aan hoogenergetische collisionele dissociatie (HCD) (32% genormaliseerde energie).
12. Sluit peptiden uit na 1 MS/MS acquisitie gedurende 60 seconden.
13. Stel de resolutie van MS/MS in op 15.000 met een AGC-doel van 5,0e⁴ en een maximale injectietijd van 35 ms.

9. Proteome ontdekker/gegevensverwerking

1. Zoek tandem raw databestanden op beschikbare bottom-up proteomics analyse software tegen een relevante Homo sapiens eiwit database en digest enzym.
2. Stel de zoekparameters voor eiwitanalyse in.
3. Stel fragmenttolerantie in op 0,02 Da en bovenliggende ionentolerantie op 10 ppm.
4. Stel enzymspecifiekheid in op trypsine en zorg voor een gemist decolleté.
5. Stel het massabereik in op 375-1500 m/z.
6. Stel het peptidevertrouwen vast op 95% (gemiddeld) en het residuvertrouwen op 99% (hoog).
7. Accepteer eiwitten als ten minste twee verschillende peptiden worden geïdentificeerd met het 5% discovery rate (FDR) filter.
8. Stel carbamidomethylatie in als een statische modificatie en alle bekende hydroxyl radicale zijketenmodificaties^15,16 als dynamische modificaties.
9. Zodra bestanden klaar zijn met zoeken, export volgorde, wijziging locaties, eiwit toetreding, spectrum bestand, precursor overvloed, en bewaartijd informatie naar een elektronische database.
10. Bereken de mate van modificatie per peptide of residu uit deze vergelijking:
    
    OPMERKING: Gewijzigd EIC-gebied is het geëxtraheerde ionenchromatografische gebied (EIC) van het peptide of residu met een oxidatieve modificatie, en EIC-gebied is het totale oppervlak van hetzelfde peptide of residu met en zonder de oxidatieve modificatie. Na verloop van tijd zal eiwit in aanwezigheid van waterstofperoxide oxideren, wat resulteert in oxidatie op de achtergrond. Om de omvang van de wijziging te berekenen, wordt het gebied van het gemodificeerde peptide gedeeld door het totale oppervlak. Een niet-bestraald controlemonster zorgt voor oxidatie op de achtergrond. De achtergrondoxidatie van het controlemonster wordt afgetrokken van het met laser behandelde monster om een FPOP-wijziging te identificeren.

Resultaten

Om te bevestigen dat de platform incubator condities voldoende zijn voor celkweek op het laserplatform, werd GCaMP2 tijdelijk getransfecteerd in HEK293T en werd de transfectie-efficiëntie voor beide platen beoordeeld via fluorescentiebeeldvorming (figuur 4A). GCaMP2 is een calcium sensing fluorescerend eiwit dat wordt gebruikt als een genetisch gecodeerde intracellulaire calciumindicator. Het is een fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en het calciumbindende eiwit calmodulin. Een luciferasetest werd uitgevoerd op HEK 293 cellen getransfecteerd met plasmide prl-TK om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren (Figuur 4B). Deze resultaten tonen aan dat de platform incubator de prestaties van de standaard incubator overtrof, met een 1,13-voudige toename van transfectie-efficiëntie, wat een kwantitatieve benchmark biedt voor een optimale celkweekomgeving.

FPOP-modificaties in HEK293T-cellen die in het stroomsysteem zijn gelabeld, werden vergeleken met die in de platformincubator en toonden aan dat de platformincubator beter presteert dan het stromingssysteem, zowel in het aantal gemodificeerde eiwitten (figuur 5) als in de totale FPOP-dekking in die eiwitten. Het aantal FPOP gemodificeerde eiwitten verworven in de platform incubator was ongeveer 1051, 2,2 keer meer dan die verworven in een typisch experiment. Modificaties werden gecombineerd tussen twee biologische replica's voor elk experiment. Bovendien zorgt PIXY voor een hogere doorvoer.

Om het voordeel van een hogere modificatiedekking voor een eiwit aan te tonen, werden IC-FPOP-modificaties gelokaliseerd op het peptideniveau en werd de mate van modificatie gekwantificeerd om verschillen in uitkomsten te onderscheiden tussen de systemen voor actine, een 375 aminozuureiwit. In het stroomsysteem werden twee gemodificeerde peptiden gedetecteerd, die beperkte structurele informatie leverden (figuur 6A). Echter, vijf gemodificeerde peptiden over de actine volgorde werden gedetecteerd in het platform incubator. Tandemmassaspectra geven aan dat residu Pro322 in elk experiment is gewijzigd en gedetecteerd (figuur 6B). De vijf peptiden die in de incubatormonsters van het platform werden gewijzigd, bevatten twaalf gemodificeerde residuen, terwijl slechts vier residuen met het stroomsysteem werden gewijzigd (figuur 6C). De toename van de oxidatiedekking geeft meer structurele informatie over het eiwit.

Espino et al. demonstreerden het vermogen van FPOP om in vivo (IV-FPOP) te worden uitgevoerd binnen C. elegans, een wormmodel voor menselijke ziekten staten¹⁷. Terwijl IV-FPOP ook via een flowsysteem wordt uitgevoerd, werd het PIXY-systeem getest op compatibiliteit met de wormen. Ongeveer 10.000 wormen werden geïncubeerd in elke put in de platform incubator bij 20 °C. LC−MS/MS analyse toonde aan dat 792 eiwitten werden gewijzigd door IV-FPOP in de platform incubator in vergelijking met de 545 eiwitten gemodificeerd met het flow systeem (Figuur 7). Deze resultaten tonen aan dat deze nieuwe methodologie naast 2D-celcultuur ook compatibel is met de studie van andere biologische systemen zoals C. elegans.

Figuur 1. Schematisch van PIXY-systeem. Systeemcomponenten: (A) stage-top incubator, (B) positioneringssysteem , (C) peristaltische pompen en (D) perfusielijnen. Celkweekmedia worden via pompen uit elke put verwijderd voordat H₂O₂ en blusoplossingen op berekende tijdstippen worden geïnfundeerd. Laserpad voor bestraling tentoongesteld in wit. Herdrukt met toestemming van Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytische chemie, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Volledig geassembleerd PIXY-systeem. (A) Aanraakbewakingssysteem, (B) kooldioxide-eenheid, (C) temperatuur-eenheid, (D) luchtpomp, (E) luchtbevochtiger, (F) optische spiegels, (G) platform incubator, (H) positioneringsfase, (I) 248nm KrF excimer laser, en (J) peristaltische pompen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Automatisering van peristaltische pompen. (A) Voorbeeldopdrachtscript in LABVIEW. Opdrachtopties omvatten volume, debiet, pauzes, stroomrichting. Snelheid, etappeafstand en locatie worden momenteel geautomatiseerd. (B) Scriptlezer in LABVIEW. Hier worden opdrachtscripts geüpload en vervolgens Worden Run Sequence en START ingedrukt om pompen te starten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. HEK celtransfectie-efficiëntie. (A) Gemiddelde fluorescerende intensiteit van GCaMP2 transfectie vergelijking tussen standaard incubator (Control) en stage-top incubator (PIXY). Stippen en vierkanten vertegenwoordigen elk punt in een put waar een maatregel is genomen. (B) Transfectie-efficiëntie gekwantificeerd en gevalideerd met een andere vector plasmide, pRL-TK. P-waarde< 0,005. Herdrukt met toestemming van Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytische chemie, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Vergelijking van eiwitten gemodificeerd in het eencellige stroomsysteem en PIXY. Venn diagram van eiwitten aangepast met behulp van in het stroomsysteem (paars) en in PIXY (groen). Herdrukt met toestemming van Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytische chemie, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Lokalisatie van IC-FPOP modificaties. Vergelijking van IC-FPOP modificaties tussen systemen. (A) Staafgrafiek van oxidatief gemodificeerde peptiden binnen actine uit het stroomsysteem (paars) versus platform incubator (groen). (B) Tandem MS spectra van actine (peptide 316-326) met gemodificeerde proline in beide systemen en ongewijzigd actine peptide (C) FPOP gemodificeerde residuen van actine (PDB: 6ZXJ, keten A 11 gemodificeerde residuen in platform incubator (groen), 3 gemodificeerde residuen in het stroomsysteem (paars), 1 overlappend gemodificeerd residu (geel). Herdrukt met toestemming van Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytische chemie, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. Vergelijking van FPOP gemodificeerde eiwitten in C. elegans per flow vs PIXY. Er is een 1,5-voudige toename van oxidatief gemodificeerde eiwitten met PIXY in vergelijking met het stroomsysteem. Herdrukt met toestemming van Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytische chemie, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1. Workflow modificatie distributie en massaverschuivingen (Da). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Eiwitten doen veel van het werk in levende cellen. Gezien dit belang zijn gedetailleerde gegevens over eiwitfunctie en hogere ordestructuur (HOS) in de cellulaire omgeving nodig om het begrip van de fijne kneepjes in grotere complexen en enzymatische reacties in cellen te verdiepen in tegenstelling tot gezuiverde systemen. Om dit te doen, werd een hydroxyl radical protein foot printing (HRFP) methode aangenomen met de titel In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De meeste FPOP-studies zijn in vitro uitgevoerd in relatief zuivere eiwitsystemen, wat duidelijk contrasteert met de overvolle moleculaire omgeving die bindende interacties en eiwitconforme dynamica beïnvloedt. Als gevolg hiervan is er een kloof tussen de bevindingen van in vitro experimenten¹⁸ en die welke zouden worden verkregen in een daadwerkelijke cellulaire omgeving. Om de kloof tussen de geïdealiseerde omstandigheden van een in vitro FPOP-experiment en het complexe karakter van de cel te overbruggen, is een nieuw geautomatiseerd zesputs plaatgebaseerd in cel-FPOP-platform ontwikkeld. Deze nieuwe FPOP-technologie is in staat om deze moleculaire soorten te identificeren en te karakteriseren en hun dynamische moleculaire interacties in zowel gezonde als zieke toestanden te traceren. Dit nieuwe platform heet Platform Incubator with Movable XY stage (PIXY).

FPOP is met succes gebruikt om de structurele informatie binnen het proteoom te karakteriseren. Elke biologische techniek heeft echter bepaalde beperkingen die verdere verbetering vereisen. Specifieke reagentia zijn nodig tijdens laserfotolyse en om ongeacteerde hydroxylradicalen efficiënt te doven. Scheiding van verteerde peptiden kan grote hoeveelheden tijd vergen om structurele informatie te maximaliseren. Deze schat aan informatie kan ook een uitgebreide kwantificering vereisen tijdens gegevensanalyse na de lidstaten¹. De platform incubator, inclusief de perifere machines die nodig zijn voor celkweek en IC-FPOP op het laserplatform, brengt grote kosten met zich mee die voor sommige laboratoria misschien niet haalbaar zijn. Naarmate er vooruitgang wordt geboekt, moeten robuuste software en analysetools de techniek verder ontwikkelen; waarvan sommige in deze studie worden getoond. Huidige studies in deze platform incubator zijn uitgevoerd op HEK293T cellen en in C. elegans. Het is aangetoond dat de IC-FPOP-methode compatibel is met een breed scala aan cellijnen, waaronder chinese hamstereiererond (CHO), Vero, MCF-7 en MCF10-A-cellen¹⁹. Aangezien de algemene IC-FPOP-methode kan worden vertaald naar dit statische platform, moeten deze cellijnen ook vatbaar zijn voor studie met PIXY.

IC-FPOP maakt gebruik van H₂O₂ om op oxidatieve wijze oplosmiddel toegankelijke bijwerkingen van aminozuren te wijzigen, om vervolgens eiwitinteracties, structuur en metabolische effecten binnen levensvatbare cellen verder te onderscheiden, wat belangrijk is voor het bieden van biologische context. Het is essentieel voor een IC-FPOP-experiment om te bevestigen dat de cellen levensvatbaar zijn na H₂O_{2-toevoeging.} Studies naar de levensvatbaarheid van cellen toonden aan dat de cellen levensvatbaar waren in aanwezigheid van H₂O₂ concentraties tot 200 mM ¹³. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat H₂O₂ wordt toegediend bij een uiteindelijke concentratie van 200 mM direct op cellen nadat de media zijn verwijderd. Als celkweekmedia niet volledig worden verwijderd, zullen verschillende concentraties H₂O₂worden veroorzaakt . In vergelijking met de standaardomstandigheden leidde het verhogen van de incubatietijd tot 10 seconden samen met het verhogen van de H₂O_{2-concentratie} tot een hoger aantal eiwitten gewijzigd door IC-FPOP in de platformincubator. Het is noodzakelijk om peristaltische pompen voor gebruik te primen om ervoor te zorgen dat pompen goed werken en vloeistof wordt verspreid. Als u dit niet doet, kunnen luchtbellen in de slang, onvoldoende volume H₂O₂ om cellen onder te dompelen en/of onvoldoende volume blusoplossing ontstaan.

Een ander probleem dat zich kan voordoen, zijn ongewenste vertragingen in het systeem. Een voorbeeld hiervan is het proces van het verifiëren van ontvangen opdrachten voor de pompsystemen, wat aanzienlijke vertragingen toevoegt in de orde van 1000 of meer milliseconden met behulp van de integratiesoftware. Dit probleem kan worden verholpen door de communicatie met de pompen tijdens het experiment te minimaliseren en vooraf ingestelde opdrachten zoveel mogelijk van tevoren te gebruiken.

In de toekomst is het doel van PIXY het produceren van een volledig geautomatiseerd en geïntegreerd systeem. Naast de peristaltische pompen wordt het activeren van de laserpuls geautomatiseerd. Een nieuw positioneringssysteem zal ook worden gebruikt voor de snelle beweging van de platformincubator om de snelheid en nauwkeurigheid te verbeteren. Alle componenten van het systeem blijven worden geprogrammeerd met behulp van de integratiesoftware om de doorvoer verder te verhogen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps	Cole-Palmer	122270050
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics	Thor Labs
10X trypsin−EDTA	Corning	AB00490-00005
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror	Edmond Optics
Acetone, HPLC Grade	Fisher Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	23275	other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters	A53225
Afinia H480 3D Printer	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
air pump	OKOlabs	D12345
Aluminum Foil	Fisher Scientific	Stock #63-120
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material	Phenomenex
carbon dioxide unit	OKOlabs	MadMotor®-UHV
Centrifuge	Eppendorf
connectors (Y PP 1/16” and 1/16x1/8”)	Cole-Palmer	116891000
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	022625501
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	LS118-500
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	SK-78001-82
EX350 excimer laser	GAM Laser	PI89900
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	SK-12023-78
Formic Acid, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A929-4	4 L quantity is not necessary
HEK293T cells	Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore)
humidifier	OKOlabs	Nano-LPMW stage
HV3-2 VALVE	Hamilton	BP152-500
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	LS120-500
Iodoacetamide (IAA)	ACROS Organics
LABVIEW Professional 2018	National Instruments	86728
MadMotor Positioning system and controllers	Mad City Labs	W6-4
Methanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	01-213-100	any brand is sufficient
Microcentrifuge	Thermo Scientific	H301-T Unit-BL-PLUS
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics
Nanopositioinging stage	Mad City Labs
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)	ACROS Organics
OKO Touch Monitoring System	OKOlabs
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	7Z02936
PE50-C pyroelectric energy meter	Ophir Optronics
Penicillin-streptomycin	Corning
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	75002436
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis	Fisher Scientific	06-666A
pressure gauge	OKOlabs	OKO-AIR-PUMP-BL
PTFE filter	OKOlabs	CO2-UNIT-BL
Six 33 mm PLA filament rings	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
sterile incubator	OKOlabs
temperature unit	OKOlabs	OKO-TOUCH
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Fisher Scientific	A117-50
TiNKERcad	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
Tris Base	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID)	Cole-Palmer	177350250
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L quantity is not necessary
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	88702
		90058
		KM200
		186007496