We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Celdissociatie is een essentiële procedure geweest voor studies op het niveau van de individuele cel en/of op celpopulatieniveau (bv. RNA-sequencing met één cel en primaire celcultuur). Het leveren van levensvatbare, gezonde cellen in grote hoeveelheden is van cruciaal belang en de optimale omstandigheden om dit te doen zijn weefselafhankelijk. Celpopulaties in het tongepitheel en het onderliggende mesenchyme/bindweefsel zijn heterogeen en weefselstructuren variëren in verschillende regio's en in verschillende ontwikkelingsstadia. We hebben protocollen getest voor het isoleren van cellen uit het epitheel van de muistong en mesenchym/bindweefsel in de vroege ontwikkelingsfasen [embryonale dag 12,5 (E12,5)] en jongvolwassenen (8 weken). Een schone scheiding tussen het epitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel was eenvoudig te bereiken. Het is echter van cruciaal belang om cellen verder te verwerken en te isoleren, levensvatbare gezonde cellen in grote hoeveelheden op te leveren en zorgvuldige selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, incubatietijd en centrifugeersnelheid en -tijd. Incubatie van gescheiden epitheel of onderliggend mesenchym/bindweefsel in 0,25% Trypsine-EDTA gedurende 30 min bij 37 °C, gevolgd door centrifugeren bij 200 x g gedurende 8 min resulteerde in een hoge opbrengst van cellen met een hoge levensvatbaarheidssnelheid (>90%) ongeacht de muisstadia en tonggebieden. Bovendien ontdekten we dat zowel gedissocieerde epitheel- als mesenchymale/bindweefselcellen van embryonale en volwassen tongen ten minste 3 uur in het celkweekmedium konden overleven zonder een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel. De protocollen zullen nuttig zijn voor studies die de voorbereiding vereisen van geïsoleerde cellen uit muistongs in vroege ontwikkelingsstadia (E12.5) en young adult (8 weken) die celdissociatie van verschillende weefselcompartimenten vereisen.
Inleiding
De zoogdiertong is een complex orgaan dat cruciaal is voor smaak, spreken en voedselverwerking. Het bestaat uit meerdere soorten sterk georganiseerde weefsels gecompartimenteerd door mesenchym / bindweefsel en bedekt met een gelaagd epitheelblad met smaakpapillen en smaakpapillen. Celpopulaties in zowel tongepitheel als mesenchym/bindweefsel zijn heterogeen. Om de functies en verdeling van een bepaald type cellen in de tong beter te begrijpen, zijn studies met gedissocieerde cellen nodig. RNA-sequencing met één cel is bijvoorbeeld een krachtige en hoge doorvoermethode voor transcriptomische profilering in afzonderlijke cellen, die is ontworpen om het transcriptoom van complex weefsel te begrijpen bij een eencellige resolutie1,2,3,4. Het is bewezen dat primaire celkweek een nuttig hulpmiddel is om de functie en differentiatie van stam-/voorlopercellen voor smaakpapillen te bestuderen5,6. Deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige geïsoleerde celpopulaties (bv. voldoende totaal celaantal met de juiste concentratie en hoge levensvatbaarheid).
Er is dus behoefte aan het isoleren van cellen uit verschillende regio's van de linguale weefsels en in verschillende ontwikkelingsstadia. Momenteel is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Hier rapporteren we een geoptimaliseerde celdissociatiemethode om cellen voor te bereiden op experimenten die een hoge kwaliteit van levende cellen vereisen, zoals voor RNA-sequencing met één cel en primaire stamcelculturen. We ontdekten dat selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, zachte pipetting, selectie van resuspensiemedium en optimale centrifugeertijd en snelheid cruciaal zijn om deze grote hoeveelheden hoogwaardige cellen te genereren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Diergebruik (C57BL/6 muizen gedurende het hele onderzoek) werd goedgekeurd door de University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee en was in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines voor zorg en gebruik van dieren voor onderzoek.
1. Dierlijk gebruik
OPMERKING: Muizen werden gefokt en onderhouden in de dierenfaciliteit van de afdeling Dier- en Zuivelwetenschappen van de Universiteit van Georgia bij 22 °C onder 12 uur dag-/nachtcycli.
- Wijs de middag van de dag van vaginale plugdetectie bij muizen aan als embryonale (E) dag 0,5. Gebruik embryo's op E12.5 en postnatale muizen op de leeftijd van 8 weken voor de volgende experimenten.
2. Voorbereiding voor experiment
OPMERKING: De instrumenten die nodig zijn voor dit protocol zijn opgenomen in de tabel met materialen.
- Autoclaaf instrumenten voor het experiment. Steriliseer instrumenten met behulp van een kraalsterilisator tijdens het experiment.
- Reinig het operatiegebied, de ontleedmicroscoop en de bioveiligheidskast met 70% ethanoldoekjes. Zet het UV-licht van de bioveiligheidskast aan en houd deze 20 minuten aan voorafgaand aan de experimentele procedure.
- Bereid een enzymmengsel van 1:1 dispase (5,0 mg/ml) en collagenase (2,0 mg/ml) tot een eindconcentratie van respectievelijk 2,5 en 1,0 mg/ml en filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm7.
- Bereid 1 ml enzymmengsel voor een volwassen tong of 0,5 ml voor een specifiek tonggebied (bijv. achterste of voorste tong).
- Bereid 2 ml enzymmengsel voor embryonale tongen.
- Maak 10 ml 2,5% BSA in 0,1 M PBS en filtreer de oplossing met een spuit van 1 ml en een spuitfilter van 0,22 μm.
- Maak 500 μL van 5% FBS in DMEM/F12.
- Maak 3 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% BSA en filtreer de oplossing met een spuit van 1 ml en een spuitfilter van 0,22 μm.
3. Scheiding van het tongepitheel van het mesenchym/onderliggend bindweefsel
- Scheiding van het epitheel van het mesenchyme van een E12.5 muistong
- Euthanaseer getimed zwangere vrouwelijke muizen die E12.5 embryo's dragen door het in een CO2-kamer te plaatsen, gevolgd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Muisembryo's op E12.5 worden verzameld na 12.00 uur (middag) op de 12e dag na detectie van vaginale plug in de zwangere vrouwelijke muizen. - Breng muizen over naar het operatiegebied. Maak de buik van de muis nat met 70% ethanol om te voorkomen dat bont op de operatieplaats komt.
- Open de buik met behulp van een ontleedschaar om de baarmoederhoorns bloot te leggen die embryo's dragen. Ontleed de baarmoederhoorns met behulp van een ontleedschaar en breng deze over op 15 ml verse Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Ontleed de embryo's (figuur 1A1) uit de baarmoederhoorns onder een ontleedmicroscoop met behulp van een minischaar en een fijne tang.
- Open de mondholte voorzichtig wijd met behulp van een fijne tang en ontleed de tong van de onderkaak met behulp van een minischaar (afbeelding 1A2).
- Was de tongen met 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Breng de weefsels over op 2 ml enzymmengsel van dispase (2,5 mg/ml) en collagenase (1,0 mg/ml) in een kweekschaal van 35 mm met een spatel en fijne tang in een bioveiligheidskast. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Breng tongen over op 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm en verwijder het mesenchym voorzichtig uit het epitheel van de ventrale kant met behulp van een fijne tang.
OPMERKING: Epitheelbladen kunnen tijdens de incubatie zonder mechanische kracht worden gescheiden. - Was de gescheiden epithelia en mesenchym tweemaal in 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
OPMERKING: De activiteiten van dispase en collagenase worden geremd door EDTA in de celdissociatieprocedure (stap 4.1).
- Euthanaseer getimed zwangere vrouwelijke muizen die E12.5 embryo's dragen door het in een CO2-kamer te plaatsen, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Scheiding van het tongepitheel van het onderliggende bindweefsel van volwassen muizen
- Euthanaseer de muis op de leeftijd van 8 weken door hem in een CO2-kamer te plaatsen. Bevestig dat de muis geëuthanaseerd is zonder ademhaling en forepaw-pinch reactie.
- Breng de muizen over naar het operatiegebied. Maak de muiskop nat met 70% ethanol om te voorkomen dat bont in de mondholte komt.
- Snijd de mondhoeken langs de wang met een ontleedschaar om de mondholte te openen. Ontleed de tong met de onderkaak (afbeelding 1B1) en plaats deze in een plastic schaal met een laag plasticfolie.
- Injecteer met behulp van een chirurgische tang om de tong onder een ontledende microscoop te houden het enzymmengsel van dispase (2,5 mg/ml) en collagenase (1,0 mg/ml) in de subepitheelruimte van de tong door de snijkant(figuur 1B1,pijlen) van de achterste tong.
- Injecteer 1 ml enzymmengsel gelijkmatig op de hele tong voor weefselverzameling van zowel de voorste als de achterste tong.
- Injecteer lokaal 0,5 ml enzymmengsel in de voorste tong voor weefselverzameling vanaf de tongpunt of op de achterste tong voor het verzamelen van papillaweefsel.
OPMERKING: De tong zwelt op naarmate het enzym zich ophoopt (Figuur 1B2). Zachte injectie van het enzym kan voorkomen dat druk het epitheel beschadigt en zoveel mogelijk enzym in de tong houden.
- Wikkel de tong in met plasticfolie en incubeer de tong gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Gebruik een minischaar om de tongpunt te ontleden en/of papilla te omzichtig te maken, en gebruik spatel en fijne tang om weefsel over te brengen naar 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Scheid het epitheel van het onderliggende bindweefsel in de enzymverteerd subepitheelruimte met behulp van een minischaar. Trim de weefsels tot een juiste grootte volgens de vereiste van downstream experimenten.
- Was het gescheiden epitheel en het onderliggende bindweefsel tweemaal in 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
OPMERKING: De activiteiten van dispase en collagenase worden geremd door EDTA in de celdissociatieprocedure (stap 4.1).
4. Celdissociatie
OPMERKING: Het hier beschreven celdissociatieprotocol kan worden toegepast op het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel bij zowel E12.5 embryonale als 8 weken oude muizen. Om het celverlies tijdens agitatie en overdracht van celsuspensie te verminderen, gebruikt u commerciële pipettips met lage retentie of voorgecoate pipettips met 2,5% BSA bij 0,1 M PBS bij pH 7,48.
- Breng de weefsels over met spatel en fijne tang naar 3 ml 0,25% trypsine-EDTA in een nieuwe kweekschaal van 35 mm gedurende 30 minuten bij 37 °C. Roer de tissues voorzichtig om de 5 minuten met pipetpunten van 1 ml.
OPMERKING: Snijd de pipetpunt niet door, omdat de snijkant de gedissocieerde cellen fysiek kan beschadigen. - Voeg 500 μL 5% FBS toe in DMEM/F12 om de reactie te stoppen en breng het medium over naar een 5 ml laagbindende centrifugebuis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- S hang cellen voorzichtig opnieuw op in 3 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% BSA met behulp van pipetpunten van 1 ml en filtreer de cellen met een celzeef van 70 μm, gevolgd door een 35 μm celzeef.
- Centrifugeer celsuspensie bij 200 x g gedurende 8 min bij kamertemperatuur. Verwijder het grootste deel van het medium en laat 50-300 μL als het uiteindelijke volume om cellen opnieuw op te schorten.
OPMERKING: Pas de concentratie van cellen aan volgens de vereisten van downstream-experimenten door het uiteindelijke volume van de suspensie met één cel te wijzigen.
5. Celtelling en levensvatbaarheidstest met hemocytometer
OPMERKING: Om de meetnauwkeurigheid te verbeteren, worden voor elk monster 3 technische replica's aanbevolen.
- Meng voorzichtig 5-10 μL van de eencellige suspensie met een gelijk volume Trypan blauw en voeg toe aan de hemocytometer.
OPMERKING: Reinig de hemocytometer grondig met 70% ethanol voor gebruik. Stofdeeltjes op de hemocytometer worden donkerblauw gekleurd en beïnvloeden de nauwkeurigheid van de levensvatbaarheidstest. Controleer de hemocytometer onder een microscoop. - Tel het totale celnummer, het aantal levende cellen (wit) en het aantal dode cellen (donkerblauw) gekleurd door trypanblauw(figuur 2,pijlen) respectievelijk in 4 vierkanten met 16 rasters (figuur 2) met behulp van omgekeerde microscoop met beeldvormingssysteem.
- Bereken de celconcentratie:
Celconcentratie =
- Bereken de levensvatbaarheid:
Levensvatbaarheid =
- Bereken de levensvatbaarheid:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Scheiding van het tongepitheel van het onderliggende mesenchym/bindweefsel
In de embryonale muistong is een opening in de subepitheelruimte zichtbaar na een goede enzymvertering. Epitheelbladen van sommige tongen worden tijdens de incubatie zonder mechanische kracht gescheiden.
In de volwassen muistong wordt een succesvolle enzyminjectie aangegeven door de zwelling in de geïnjecteerde gebieden (figuur 1B2), wat sugge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tot op heden is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Dit huidige celdissociatieprotocol biedt een reproduceerbare procedure om een enkele celsuspensie te genereren met een hoge cel levensvatbaarheid (>90%) van tongweefsels van muizen, met inbegrip van epitheelbladen en mesenchyme/bindweefsels in zowel embryonale als postnatale stadia, ook al zijn geïsoleerde cellen van E12.5 en volwassen muizen verschillend in grootte. Geïsoleerde ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten aangegeven.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health, subsidienummer R01DC012308 en R21DC018089 aan HXL. We danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) en Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) voor technische bijstand en overleg over de celdissociatie; aan Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) voor Engelse bewerking.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 muis (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| kweebatje (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| kweebatje (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissectie schaar (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| foetaal bovien serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fijne pincet (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometers | Hausser Scientific | 3520 | |
| invers microscoop met beeldsysteem (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| pipettips met lage retentie | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-schaar (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| lepel (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| chirurgische pincet (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blauw | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s oplossing | Sigma-Aldrich | T2145-10L | gemaakt van Tyrode's zouten |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) | Hoefer | 33946 | gemaakt van 1 M PBS |
| 0.22-μm spuitfilter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | gemaakt van 100% ethanol |
| 1-mL spuit | BD | 8194938 | |
| 5-mL microcentrifugebuisje met lage binding | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G naald | BD | 9193532 | |
| 35-μm celfilter | Falcon | 64750 | |
| 70-μm celfilter | Falcon | 64752 |
Referenties
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367(2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
