Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62173

⸱

12 april 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Samenvatting

Chromatine-geassocieerde condensaten zijn betrokken bij veel nucleaire processen, maar de onderliggende mechanismen blijven ongrijpbaar. Dit protocol beschrijft een chemisch geïnduceerd eiwitdimerisatiesysteem om condensaten op telomeren te creëren. De chemische dimerizer bestaat uit twee gekoppelde liganden die elk kunnen binden aan een eiwit: Halo ligand aan Halo-enzym en trimethoprim (TMP) aan E. coli dihydrofolaat reductase (eDHFR), respectievelijk. Fusie van Halo-enzym tot een telomeereiwit verankert dimerizers aan telomeren door covalente Halo-ligand-enzymbinding. Binding van TMP aan eDHFR rekruteert eDHFR-gefuseerde fasescheidende eiwitten aan telomeren en induceert condensaatvorming. Omdat de interactie tussen TMP en eDHFR niet-covalent is, kan condensatie worden omgekeerd door overtollige vrije TMP te gebruiken om te concurreren met de dimerizer voor eDHFR-binding. Een voorbeeld van het induceren van promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren en het bepalen van condensaatgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling wordt getoond. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om condensaten op andere genomische locaties te induceren door Halo te fuseren met een eiwit dat direct bindt aan het lokale chromatine of aan dCas9 dat is gericht op de genomische locus met een gids-RNA. Door de temporele resolutie te bieden die nodig is voor live beeldvorming met één cel met behoud van fasescheiding in een populatie van cellen voor biochemische assays, is deze methode geschikt voor het onderzoeken van zowel de vorming als de functie van chromatine-geassocieerde condensaten.

Inleiding

Veel eiwitten en nucleïnezuren ondergaan vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) en assembleren zichzelf tot biomoleculaire condensaten om de biochemie in cellen te organiseren1,2. LLPS van chromatine-bindende eiwitten leidt tot de vorming van condensaten die geassocieerd zijn met specifieke genomische loci en betrokken zijn bij verschillende lokale chromatinefuncties3. LLPS van HP1-eiwit ligt bijvoorbeeld ten grondslag aan de vorming van heterochromatinedomeinen om het genoom te organiseren4,5,LLPS van transcriptiefactoren vormt transcriptiecentra om transcriptie te reguleren6, LLPS van ontluikende mRNA's en multi-sex kammen eiwit genereert histon locus lichamen om de transcriptie en verwerking van histon mRNA's te reguleren7.  Ondanks vele voorbeelden van chromatine-geassocieerde condensaten die worden ontdekt, blijven de onderliggende mechanismen van condensaatvorming, regulatie en functie echter slecht begrepen. In het bijzonder worden niet alle chromatine-geassocieerde condensaten gevormd door LLPS en zorgvuldige evaluaties van condensaatvorming in levende cellen zijn nog steeds nodig8,9. Het HP1-eiwit in de muis blijkt bijvoorbeeld slechts een zwak vermogen te hebben om vloeistofdruppels in levende cellen te vormen en heterochromatine foci gedragen zich als ingeklapte polymeerbolletjes10. Daarom zijn hulpmiddelen om de novo condensaten op chromatine in levende cellen te induceren wenselijk, met name die welke het gebruik van live imaging en biochemische assays mogelijk maken om de kinetiek van condensaatvorming, de fysische en chemische eigenschappen van de resulterende condensaten en de cellulaire gevolgen van condensaatvorming te volgen.

Dit protocol rapporteert een chemisch dimerisatiesysteem om eiwitcondensaten op chromatine11 te induceren(figuur 1A). De dimerizer bestaat uit twee gekoppelde eiwit-interagerende liganden: trimethoprim (TMP) en Halo ligand en kan eiwitten dimmeriseren die zijn gefuseerd met de cognate receptoren: Escherichia coli dihydrofolaat reductase (eDHFR) en een bacterieel alkyldehalogenase-enzym (Halo-enzym), respectievelijk12. De interactie tussen Halo-ligand en Halo-enzym is covalent, waardoor Halo-enzym als anker kan worden gebruikt door het samen te smelten met een chromatinebindend eiwit om een fasescheidend eiwit te rekruteren dat is gefuseerd met eDHFR tot chromatine. Na de initiële rekrutering passeert een verhoogde lokale concentratie van het fasescheidende eiwit de kritische concentratie die nodig is voor fasescheiding en nucleeert zo een condensaat aan het anker (figuur 1B). Door fluorescerende eiwitten (bijv. mCherry en eGFP) te fuseren met eDHFR en Halo, kunnen nucleatie en groei van condensaten in realtime worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Omdat de interactie tussen eDHFR en TMP niet-covalent is, kan overtollig vrij TMP worden toegevoegd om te concurreren met de dimeerizer voor eDHFR-binding. Dit zal dan het fasescheidingseiwit uit het anker vrijgeven en het chromatine-geassocieerde condensaat oplossen.

We gebruikten deze tool om de novo promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren in telomerase-negatieve kankercellen te induceren die een alternatieve verlenging van telomeren (ALT) pathway gebruiken voor telomeeronderhoud13,14.  PML-nucleaire lichamen zijn membraanloze compartimenten die betrokken zijn bij veel nucleaire processen15,16 en zijn uniek gelokaliseerd voor ALT-telomeren om APBs te vormen, voor ALT-telomeer-geassocieerde PML-lichamen17,18. Telomeren clusteren binnen APB's, vermoedelijk om reparatiesjablonen te bieden voor homologie-gerichte telomeer-DNA-synthese in ALT19. Inderdaad, telomeer DNA-synthese is gedetecteerd in APBs en APBs spelen een essentiële rol bij het verrijken van DNA-reparatiefactoren op telomeren20,21. De mechanismen die ten grondslag liggen aan APB-assemblage en telomeerclustering binnen APB's waren echter onbekend. Aangezien telomeereiwitten in ALT-cellen uniek worden gemodificeerd door kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMOs)22, bevatten veel APB-componenten sumillatieplaatsen 22,23,24,25 en / of SUMO-interacterende motieven (SIM's)26,27 en SUMO-SIM-interacties drijven fasescheiding28, we veronderstelden dat sumoyatie op telomeren leidt tot verrijking van SUMO / SIM-bevattende eiwitten en SUMO-SIM interacties tussen die eiwitten leiden tot fasescheiding.  PML-eiwit, dat drie sumoylation-sites en één SIM-site heeft, kan worden gerekruteerd om gecongloleerde telomeren te vormen om APBs te vormen en coalescentie van vloeibare APBs leidt tot clustering van telomeren. Om deze hypothese te testen, gebruikten we het chemische dimerisatiesysteem om sumillatie-geïnduceerde APB-formatie na te bootsen door SIM te rekruteren voor telomeren (Figuur 2A)11. GFP is gefuseerd met Halo-enzym voor visualisatie en met het telomeerbindende eiwit TRF1 om de dimerizer aan telomeren. SIM is gefuseerd met eDHFR en mCherry. Kinetiek van condensaatvorming en druppelfusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gevolgd met live celbeeldvorming.  Fasescheiding wordt omgekeerd door overtollige vrije TMP toe te voegen om te concurreren met eDHFR-binding. Immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden gebruikt om de condensaatsamenstelling en telomerische associatie te bepalen. Recruiting SIM verrijkt SUMO op telomeren en de geïnduceerde condensaten bevatten PML en zijn daarom APBs. Het rekruteren van een SIM-mutant die niet kan interageren met SUMO verrijkt SUMO niet op telomeren of induceert geen fasescheiding, wat aangeeft dat de fundamentele drijvende kracht voor APB-condensatie SUMO-SIM-interactie is. In overeenstemming met deze observatie kunnen polySUMO-polySIM-polymeren die zijn gefuseerd tot een TRF2-bindingsfactor RAP1 ook APB-vorming29induceren. Vergeleken met het polySUMO-polySIM-fusiesysteem waarbij fasescheiding plaatsvindt zolang er voldoende eiwitten worden geproduceerd, induceert de chemische dimerisatiebenadering die hier wordt gepresenteerd fasescheiding op aanvraag en biedt dus een betere temporele resolutie om de kinetiek van fasescheiding en telomeerclusteringsproces te bewaken. Bovendien maakt dit chemische dimerisatiesysteem de rekrutering van andere eiwitten mogelijk om hun vermogen te beoordelen om fasescheiding en telomeerclustering te induceren. Een ongeorded eiwit dat wordt gerekruteerd voor telomeren kan bijvoorbeeld ook druppels en clustertelomeren vormen zonder APB-vorming te induceren, wat suggereert dat telomeerclustering onafhankelijk is van APB-chemie en alleen afhankelijk is van APB vloeibare eigenschap11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Productie van voorbijgaande cellijnen

  1. Kweek U2OS-acceptorcellen op glazen coverslips van 22 x 22 mm (voor live beeldvorming) of cirkelvormige coverslips met een diameter van 12 mm (voor IF of FISH) bedekt met poly-D-lysine in een 6-putplaat met groeimedium (10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing in DMEM) totdat ze 60-70% confluency bereiken.
  2. Vervang groeimedium door 1 ml transfectiemedium (groeimedium zonder penicilline-streptomycine-oplossing) voorafgaand aan transfectie.
  3. Voeg voor elke transfectieput 4 μL transfectiereagens toe aan 150 μL gereduceerde serummedia, vortex gedurende 10 seconden en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten.
  4. Voeg voor elke put Halo-constructplasmide (Halo-GFP-TRF1 of Halo-TRF1) en eDHFR-constructplasmide (mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDHFR-SIM-mutant) toe met een massaverhouding van 1:1 (0,5 μg Halo-constructplasmide met 0,5 μg eDHFR-constructplasmide) aan 150 μL gereduceerde serummedia, druppelsgewijs, meng door pipetteren.
    OPMERKING: De tags zijn relatief klein (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) en er werd geen effect op de fasescheiding waargenomen. Het gebruik van mutanten zoals SIM-mutant die hier worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het fasegedrag gevoelig is voor de mutaties en niet de tags, wordt echter geadviseerd. SIM is van PIASx28,30. SIM-sequentie is AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. SIM-mutant wordt gegenereerd door SIM-aminozuren VIDL te muteren tot VADA28, en de sequentie is AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. We hebben onze plasmiden gedeponeerd om toe te voegen: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutant.
  5. Voeg 150 μL transfectiereagens -gereduceerd serummediamengsel toe aan 150 μL gereduceerde serummedia met DNA, druppelsgewijs, mix door pipetteren, incubeer gedurende 5 minuten.
  6. Voeg het 300 μL transfectiereagens-DNA-mengsel toe aan cellen, druppelsgewijs en plaats de cellen vervolgens terug naar de incubator.
  7. Wacht 24-48 uur voor live beeldvorming, immunofluorescentie (IF) of fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

2. Dimerisatie op telomeren

  1. Los dimerizers op in dimethylsulfoxide bij 10 mM en bewaar ze in plastic microcentrifugebuizen bij −80 °C voor langdurige opslag.
    OPMERKING: In plaats van de dimerizer te gebruiken met TMP direct gekoppeld aan Halo (TMP-Halo, TH), wordt dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) met een lichtgevoelige linker, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), tussen TMP en Haloligand gebruikt31. Dit komt omdat het minder tijd kost voor TNH (~ 5 minuten) om in de cel te diffunderen dan TH (~ 20 minuten). De hier getoonde resultaten kunnen ook worden verkregen met behulp van TH. Wanneer u TNH gebruikt, moet u ervoor zorgen dat u de dimerizer niet blootstelt aan licht om NOVC-decolleté te voorkomen. Behandel TNH in een donkere kamer met een dim roodlichtlamp, bewaar de dimerizer in amberkleurige plastic buizen en wikkel de container met TNH of behandelde cellen met aluminiumfolie. Beeldvorming TNH met DIC is veilig.
  2. Neem een aliquot van 10 mM dimerizer van −80 °C en verdun in beeldmedium tot een voorraadconcentratie van 10 μM en bewaar bij −20 °C.
  3. Indien klaar voor gebruik, verdun dimerizers van 10 μM stockoplossing tot een uiteindelijke werkconcentratie van 100 nM in groeimedium (voor vaste beeldvorming) of beeldvormingsmedium. Behandel cellen met 100 nM dimerizers (eindconcentratie) op het podium voor live beeldvorming of incubateer gedurende 4-5 uur voor immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).
    OPMERKING: De concentratie van de gebruikte dimerizers beïnvloedt de dimerisatie-efficiëntie en dus de fasescheiding. De dimerizerconcentratie die maximale dimerisatie-efficiëntie mogelijk maakt, hangt af van het celtype en de ankereiwitconcentratie, dus deze moet voor verschillende experimenten worden bepaald. Een eenvoudige manier is om cellen te incuberen die het ankereiwit en mCherry-eDHFR tot expressie brengen (zonder te fuseren met het fasescheidende eiwit of gefuseerd tot een niet-fasescheidende mutant) en de dimeerconcentratie te identificeren waarbij de hoogste mCherry-intensiteit aan het anker wordt bereikt. Een meer systematische benadering is om cellen te incuberen die het anker alleen tot expressie brengen met verschillende concentraties dimerizers en vervolgens met een Halo-bindende kleurstof om de dimerizerconcentratie te bepalen waarbij de Halo-bindende kleurstofintensiteit begint te plateau (d.w.z. alle Halo-gesmolten ankers worden bezet door de dimerizer en niet meer overgelaten voor de Halo-bindende kleurstof)32.
  4. Om dimerisatie om te keren, incubeer cellen met dimerizers gedurende 2-5 uur (met of zonder live beeldvorming) of totdat de gewenste druppelgrootte is bereikt en voeg 100 μM vrije TMP (eindconcentratie) verdund in beeldvormingsmedium toe aan cellen.

3. Immunofluorescentie (IF)

  1. Zaad 105 cellen op 12 mm diameter ronde dekselglazen bedekt met poly-D-lysine in 6-well plaat. Transfecteer vervolgens de twee plasmiden (Halo-GFP-TRF1 met mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDHFR-SIM mutant) en wacht 24-48 uur voordat u overgaat tot immunofluorescentie.
    OPMERKING: Wacht meer dan een dag nadat transfectie een hogere expressie kan verkrijgen.
  2. Verdun dimerizers met groeimedium om een eindconcentratie van 100 nM te bereiken, voeg verdunde dimerizers toe aan cellen en incubeer bij 37 °C gedurende 4-5 uur.
    OPMERKING: Fasescheiding wordt snel geïnduceerd na het toevoegen van dimerizers (< 30 minuten). Langere incubatie helpt druppels grof te worden tot grotere maten. Het volgen van druppelgroei met live beeldvorming kan worden gebruikt om de tijd te bepalen die druppels nodig hebben om een gewenste toestand te bereiken.
  3. Fixeer cellen in PBS-oplossing die 4% formaldehyde en 0,1% Triton X-100 bevat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om cellen te permeabiliseren. Was cellen 3 keer met PBS.
    OPMERKING: Na deze stap kan het worden gepauzeerd en kunnen cellen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
    Let op: Formaldehyde is schadelijk bij inademing en als het wordt ingeslikt, irriteert het ook de ogen, het ademhalingssysteem en de huid en is het een mogelijk gevaar voor kanker. Noodzaak om persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen, gebruik alleen in een chemische zuurkast. Doe het na gebruik ook in een afvalcontainer, gooi het niet in de gootsteen.
  4. Was coverslips twee keer met 50 μL TBS-Tx en eenmaal met 50 μL Antilichaamverdunningsbuffer (AbDil). TBS-Tx is gemaakt door TBS, 0,1% Triton X-100 en 0,05% Na-azide. AbDil is gemaakt door TBS-Tx, 2% BSA en 0,05% Na-azide.
  5. Incubeer elke coverslip met 50 μL primaire anti-PML (1:50 verdunning in AbDil) / anti-SUMO1 (1:200 verdunning in AbDil) / anti-SUMO2/3 antilichaam (1:200 verdunning in AbDil) bij 4 °C in een bevochtigde kamer gedurende de nacht. mCherry-antilichaam kan ook worden gebruikt (1:200 verdunning in AbDil) om het mCherry-signaal voor FISH te detecteren.
    OPMERKING: FISH dooft het mCherry fluorescerende signaal, waardoor het moeilijk is om cellen getransfecteerd met mCherry plasmiden te onderscheiden van cellen die niet getransfecteerd zijn in FISH-experimenten. Het gebruik van mCherry-antilichaam wordt geadviseerd. Als alternatief kan men een stabiele cellijn maken die eDHFR-bevattend eiwit tot expressie komt.
  6. Was coverslips 3 keer met AbDil om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.
  7. Incubate cellen met secundair antilichaam [anti-muis IgG (H + L) secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647 voor PML en SUMO, anti-konijn IgG (H + L) secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 555 voor mCherry, beide bij 1:1000 verdunning in AbDil] gedurende 1 uur in een donkere doos bij kamertemperatuur.
  8. Was coverslips 3 keer met TBS-Tx.
  9. Label dia's, verdun DAPI in montagemedia om de DAPI-eindconcentratie van 1 μg/ml te bereiken. Leg vervolgens 2 μL verdunde DAPI op de dia. Draai de coverslips om en plaats ze op DAPI drop, streef naar extra vloeistof van de rand van de coverslip.
  10. Sluit af met nagellak, laat het drogen en spoel vanaf de bovenkant van de deklip met water. Bewaar in de vriezer voor beeldvorming.

4. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

  1. Zaad 105 cellen op 12 mm diameter ronde dekselglazen bedekt met poly-D-lysine in 6-well plaat. Transfecteer cellen met Halo-TRF1 en mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDHFR-SIM mutante plasmiden en wacht 24-48 uur voordat u doorgaat naar FISH. De dimerisatiestap is dezelfde als beschreven in 3.2.
    OPMERKING: Hier is TRF1 niet gefuseerd met GFP, zodat het groene kanaal wordt vrijgemaakt voor telomeer DNA-sonde.
  2. Fixeer cellen met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was 4 keer met PBS. Ga voor IF-FISH vanaf hier naar het IF-protocol en na het afwassen van secundair antilichaam in IF (3.8), refix cellen met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was drie keer met PBS.
  3. Dehydrateerde coverslips in een ethanol serie (70%, 80%, 90%, 2 minuten elk).
  4. Incubeer coverslips met 488-telC PNA-sonde (1:2000 verhouding) in 5 μL hybridisatieoplossing bij 75 °C gedurende 5 minuten. Hybridisatieoplossing bevat 70% gedeioniseerd formamide, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% blokkerend reagens. Incubeer vervolgens een nacht in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
  5. Was coverslips met wasbuffer (70% formamide, 10 mM Tris) 2 minuten gedurende 3 keer bij kamertemperatuur en monteer met 1 μg / ml DAPI in montagemedia voor beeldvorming.
    OPMERKING: Het FISH-protocol is een gepubliceerd protocol33'34.

5. Live beeldvorming

  1. Wanneer cellen klaar zijn voor beeldvorming, monteer je coverslips in magnetische kamers met cellen die worden onderhouden in een beeldmedium van 1 ml zonder fenolrood op een verwarmd podium in een omgevingskamer.
  2. Stel microscoop en omgevingscontroleapparatuur in. Beelden werden verkregen met een draaiende schijf confocale microscoop met een 100x 1.4 NA objectief, een Piezo Z-Drive, een electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera, en een laser merge module uitgerust met 455, 488, 561, 594 en 647 nm lasers bestuurd door imaging software. Uitgangsvermogens voor alle lasers zijn 20 mW gemeten aan het vezeleinde.
  3. Lokaliseer cellen met helder GFP-signaal op telomeren en diffuus gelokaliseerd mCherry-signaal in het nucleoplasma. Zoek ongeveer 20 cellen, onthoud elke positie met x-, y-, z-informatie en stel parameters in voor timelapse-beeldvorming met een afstand van 0,5 μm voor een totaal van 8 μm in Z en een tijdsinterval van 5 minuten gedurende 2-4 uur voor zowel GFP- als mCherry-kanalen. Gebruik 30% van 594 nm en 50% van 488 nm vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 200 ms en camerawinst 300.
    OPMERKING: Het uitgangsvermogen van laserunits is 20 mW. Heldere GFP-foci duiden op een grotere ankergrootte die condensaten gemakkelijker kan nucleeren. Zoek cellen met een breed bereik van mCherry-signaal omdat fasescheiding afhankelijk is van de SIM-concentratie in de cel. Cellen met een te zwak of te helder mCherry-signaal mogen niet uit elkaar gaan. Om fotobleken te voorkomen, gebruik niet te veel laservermogen of een te lange belichtingstijd.
  4. Begin met beeldvorming en neem een eenmalige lus als voordimeerisatie. Pauzeer beeldvorming, voeg 0,5 ml beeldvormend medium met 15 μL van 10 μM dimerizer toe aan de beeldvormingskamer op het podium, zodat de uiteindelijke dimerizerconcentratie 100 nM is. Hervat de beeldvorming.
  5. Wanneer u klaar bent om dimerisatie om te keren, pauzeert u de beeldvorming, voegt u 0,5 ml beeldmedia met 2 μL van 100 mM stock TMP toe aan de beeldvormingskamer op het podium om 100 μM TMP eindconcentratie te krijgen. Ga door met het afbeelden van cellen gedurende 1-2 uur.

6. Vaste beeldvorming

  1. Dezelfde microscoop ingesteld als live beeldvorming, podiumverwarming is niet nodig. Gebruik 488 nm om telomeer FISH in beeld te geven, 561 nm voor mCherry IF en 647 nm voor PML of SUMO IF.
    OPMERKING: Als u geen mCherry-antilichaam gebruikt, geeft u gewoon direct een beeld van mCherry-eiwit, maar signaal misschien zwak vanwege het blussen in FISH.  Gebruik nog steeds 561 nm in plaats van 594 nm laser om mCherry in beeld te geven om signaaldoorbloeding van Cy5 naar mCherry te voorkomen.
  2. Zoek ongeveer 30-50 cellen met een rood signaal (mCherry of mCherry IF) om te selecteren op getransfecteerde cellen.
  3. Er werden beelden gemaakt met een afstand van 0,3 μm voor een totaal van 8 μm in Z voor het verzamelen van meer signalen. Gebruik 80% van 647 nm, 80% van 561 nm en 70% van 488 nm vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 600 ms en camerawinst 300.

7. Verwerk time-lapse-afbeeldingen

  1. Binair definiëren voor telomeren
    Kies één cel met alle tijd- en z-stack-informatie, kies alleen het GFP-kanaal en maak een binaire laag door drempel te definiëren. Pas de onderste en bovenste waarden van de drempel aan en gebruik functies zoals "Glad", "Schoon" en "Gaten vullen" om te zien hoe goed de drempel de gewenste objecten door alle tijdspunten oppikt.
  2. Achtergrond aftrekken
    Kies alle kanalen, teken rechthoekige interessegebied (ROI) op de achtergrond (afgezien van de cel). Definieer deze ROI als achtergrond en trek vervolgens de achtergrondintensiteit af.
  3. Koppel telomeer binair aan telomeer intensiteit
    Kies telomeer binair en koppel het aan het GFP-kanaal voor het berekenen van de GFP-intensiteit in de binaire objecten als telomeerintensiteit.
  4. Bereken het aantal en de intensiteit van telomeren in de loop van de tijd
    Geef op welke informatie moet worden geëxporteerd, zoals tijd, object-id, gemiddelde intensiteit, somintensiteit en exportgegevens. Gebruik figuurplotsoftware om de geëxporteerde tabel te lezen en cijfers van het telomeergetal en de telomeerintensiteit te genereren (vat de intensiteit samen over het volume in elk telomeer en vervolgens het gemiddelde over alle telomeren in een cel) in de loop van de tijd.

8. Verwerk beelden met vaste cellen

  1. Binair definiëren voor APBs
    Kies getransfecteerde cellen voor analyse door te zoeken naar signaal in 561nm-kanaal. Definieer volgens de procedure in 7.1 de drempelwaarde in zowel GFP (telomere DNA FISH) als Cy5 (PML of SUMO IF) kanaal om respectievelijk binair te genereren voor telomeren en PML-lichamen of SUMO. Voeg GFP- en Cy5-binaire lagen samen en creëer een nieuwe laag met deeltjes die beide een GFP- als Cy5-signaal hebben om co-lokalisatie van PML-lichaam op telomeren, dus APBs, weer te geven.
  2. Bereken APB/SUMO aantal en intensiteit
    Trek de achtergrond van de afbeelding af volgens 7.2. Koppel APB/SUMO binaire laag aan Cy5 kanaal na 7.3. Bereken het APB/SUMO-getal en de intensiteit. Export- en plotgegevens volgens 7.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve beelden van telomerische lokalisatie van SUMO geïdentificeerd door telomeer DNA FISH en SUMO-eiwit IF zijn weergegeven in figuur 2. Cellen met SIM-rekrutering verrijkten SUMO1 en SUMO 2/3 op telomeren in vergelijking met cellen met SIM-mutantenrekrutering. Dit geeft aan dat SIM-dimerisatie-geïnduceerde SUMO-verrijking op telomeren afhankelijk is van SUMO-SIM-interacties.

Een representatieve timelapse film van TRF1 en SIM na dimerisatie wordt getoon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol demonstreerde de vorming en oplossing van condensaten op telomeren met een chemisch dimerisatiesysteem. Kinetiek van fasescheiding en druppel-fusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gemonitord met live beeldvorming. Condensaatlokalisatie en samenstelling worden bepaald met DNA FISH en eiwit IF.

Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. De eerste is om de eiwit- en dimerizerconcentratie te bepalen. Het succes bij het induceren van lokale fasescheiding op een genomische lo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (1K22CA23763201 tot H.Z., GM118510 tot D.M.C.) en Charles E. Kaufman Foundation tot H.Z. De auteurs willen Jason Tones bedanken voor het proeflezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium BicarbonateCorningMT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906Bereid 1% in 1x PBS
6 Well Culture PlateVWR10861-554
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-101
Anti-mCherry antibodyAbcamAb183628
Anti-PML antibodySanta Cruzsc966
Anti-SUMO1 antibodyAbcamAb32058
Anti-SUMO2/3 antibodyCytoskeletonAsm23
Blocking ReagentRoche11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9706100
BTX Tube micro 1.5ML VWR89511-258
Circle Cover SlipsThermo Scientific3350
Confocal microscope NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
Dimethyl Sulphoxide Sigma-Aldrich472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10017CV
EMCCD CameraiXon Life 897
EthanolFisher Scientific4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved RegionsGibcoA4766801
Formamide, DeionizedMilliporeSigma46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Laser merge module NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668027
Figure plotting software, MATLABThe MathWorks
Microscope Slide BoxFisher Scientific34487
Nail PolishFisher Scientific50-949-071
Imaging software, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10x, pH 7.4Fisher Scientific70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
Pipet TipsVWR10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope SlidesFisher Scientific22-037-246
Poly-D-Lysine solutionSigma-AldrichA-003-E
Sodium AzideFisher ScientificBP922I-500
Spinning diskYokogawaCSU-X1
Square Cover SlipsThermo Scientific3305
TBS 10x solutionFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPSynthesized by Chenoweth labBeschikbaar op aanvraag
TNHSynthesized by Chenoweth labBeschikbaar op aanvraag
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% SolutionMilliporeSigma64-846-350MLBereid 0.5% in 1x PBS
U2Os cell lineFrom E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesNC9524612

Referenties

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Telomeerclusteringfasescheidingchromatinecondensatenlive cell imagingimmunofluorescentie FISHSUMO SIM interactieproximity labelingPML kernlichaampjes
Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.