Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Epitheliale dysregulatie is een knooppunt voor een verscheidenheid aan menselijke aandoeningen en kwalen, waaronder chronische wondvorming, ontsteking en meer dan 80% van alle menselijke kankers. Als voeringsweefsel is het huidepitheel vaak onderhevig aan letsel en heeft het zich evolutionair aangepast door de cellulaire plasticiteit te verkrijgen die nodig is om beschadigd weefsel te herstellen. In de loop der jaren zijn verschillende inspanningen geleverd om epitheliale plasticiteit te bestuderen met behulp van in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen. Deze inspanningen zijn echter beperkt in hun vermogen om de verschillende fasen van epitheliale celplasticiteit samen te vatten. We beschrijven hier een protocol voor het genereren van 3D epidermale sferoïden en epidermale sferoïde-afgeleide cellen van primaire neonatale menselijke keratinocyten. Dit protocol schetst het vermogen van epidermale sferoïde culturen om functioneel verschillende stadia van keratinocyt generatieve plasticiteit te modelleren en toont aan dat epidermale sferoïde re-plating heterogene normale menselijke keratinocyten (NHKc) culturen kan verrijken voor integrinα6hi/EGFRlo keratinocyt subpopulaties met verbeterde stamachtige kenmerken. Ons rapport beschrijft de ontwikkeling en het onderhoud van een systeem met hoge doorvoer voor de studie van de plasticiteit van keratinocyt en epidermale regeneratie van de huid.
Inleiding
Het zoogdier gelaagde epitheel is de meest complexe epitheelarchitectuur in alle levende systemen en is meestal onderhevig aan schade en letsel. Als beschermend weefsel is gelaagd epitheel geëvolueerd om een complexe en effectieve weefselschaderespons te genereren. Bij letsel moeten deze cellen afstammingsplasticiteitsprogramma's activeren, waarmee ze naar de gewonde plaats kunnen migreren en reparatie1,2,3kunnen uitvoeren. Deze veelzijdige reactie vindt plaats in verschillende opeenvolgende stappen die slecht begrepen blijven.
Een belangrijk obsta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor het verzamelen en hanteren van huidmonsters en isolatie van menselijke keratinocyten is herzien door de IRB van de Universiteit van South Carolina (UofSC) en geclassificeerd als "onderzoek waarbij geen menselijke proefpersonen betrokken waren", omdat de voorhuidmonsters chirurgische teruggooi waren die werden geproduceerd tijdens routinechirurgische procedures (besnijdenis van pasgeboren jongens) en volledig verstoken waren van identificerende informatie. Het protocol werd ook regelmatig herzien en goedgekeurd door het UofSC Biosafety Committee en al het laboratoriumpersoneel onderging een opleiding in laboratoriumbioveiligheid. Alle procedures werde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tijdens de huidepdermosfeertest worden NHKc-culturen gezaaid in met agarose bedekte putten van een 96-putplaat (figuur 1A). Sferoïdevormende cellen moeten zichzelf binnen 48 uur aggregeren. Autonome sferoïde vorming kan al na 24 uur worden beoordeeld met behulp van een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop. huid epidermosfeer vorming en re-plating assay model verschillende fasen van epidermale weefsel regeneratie (Figuur 1B). Figuur 2<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van 3D-sferoïde kweeksystemen heeft een breed nut gehad bij het beoordelen van celstamheid. Het is aangetoond dat deze systemen de verrijking van weefselstamcellenverbeteren 13, maar hun nut voor de studie van menselijke epidermale stamcellen is beperkt onderzocht. Hier beschrijven we een strategie voor het verrijken van menselijke keratinocytstamcellen met behulp van 3D-cultuurtechnieken. In dit systeem worden NHKc gekweekt als zelfassemblage multicellulaire sferoïde suspensuspensen, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financiële relaties om openbaar te maken.
Dankbetuigingen
De UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bood toegang tot beeldvormings- en celsorteerapparatuur en technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door subsidie 1R21CA201853. De MCF en de IRF ontvangen gedeeltelijke steun van NIH-subsidie P20GM103499, SC INBRE. Het MCF ontvangt ook steun van NIH-subsidie P20GM109091. Yvon Woappi werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-06A1 (PREP) en R25GM076277 (IMSD), en door een Fellowship door het Grace Jordan McFadden Professors Program aan UofSC. Geraldine Ezeka en Justin Vercellino werden ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-10A1 (PREP) bij UofSC. Sean M. Bloos werd on....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Affymetrix platform | Affymetrix | Voor microarray experimenten | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st bibliotheekbestand | Affymetrix | Proces | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | Voor microarray experimenten | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Gebruikt voor RNA isolatie |
| Analysis Console Software versie 3.0.0.466 | Analyseer celtype specifieke transcriptiereacties met behulp van eenrichtings tussen-onderwerp analyse van variantie | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | Voor flow cytometrie | |
| Console Software versie 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor het bevestigen van gegevenskwaliteit | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 verdunning |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Voor cel media |
| FITC-geconjugeerd anti-integrineα6 | Abcam | ab30496 | Voor FACS analyse |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor het bevestigen van gegevenskwaliteit | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor het wassen en kleuren van gehybridiseerde arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor hybridisatie en amplificatie van totaal RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | Voor hybridisatie en amplificatie van totaal RNA | Versterk gelabelde monsters | |
| GeneChip Hybridization Wash, en Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor het wassen en kleuren van gehybridiseerde arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G systeem | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scannen van gehybridiseerde arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Voor amplificatie van biotinylering van totaal RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | Voor cel media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | Voor cel media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | Voor cel media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Gebruikt voor RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Gebruikt voor RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Aangevuld met 1% Penicilline/Streptomycine, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0,4% boviene serum albumine (BSA), en 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Aangevuld met 1% Penicilline/Streptomycine, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0,4% boviene serum albumine (BSA), en 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basaal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basaal media met HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cel Cultuur Chamber Slide, ZWARTE Muren op Glas Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | Voor immunokleuring |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 verdunning |
| PE-geconjugeerd anti-EGFR ( San Jose, CA; catalogusnummer ) | BD Pharmingen | 555997 | Voor FACS analyse |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmide vector | Addgene | 20672 | Voor transfectie |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | Voor transfectie |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | Voor microarray experimenten | |
| Thermo Scientific™ Steriele Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | Voor cel media |
| Zeiss Axiovert 135 fluorescentiemicroscoop | Zeiss | Gebruik met Axiovision Rel. 4.5 software |
Referenties
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dyna....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
