Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Samenvatting

Beeldvormingstechnieken zijn fundamenteel om celorganisatie en -machines in biologisch onderzoek en de aanverwante gebieden te begrijpen. Onder deze technieken maakt cryo zachte röntgentomografie (SXT) het mogelijk om hele cryo-geconserveerde cellen in het watervenster X-ray energiebereik (284-543 eV) in beeld te brengen, waarbij koolstofstructuren intrinsiek hogere absorptie hebben dan water, waardoor de 3D-reconstructie van de lineaire absorptiecoëfficiënt van het materiaal in elke voxel mogelijk is. Kwantitatieve structurele informatie op het niveau van hele cellen tot 10 μm dik is dan op deze manier haalbaar, met een hoge doorvoer en ruimtelijke resolutie tot 25-30 nm halve toonhoogte. Cryo-SXT heeft bewezen relevant te zijn voor het huidige biomedische onderzoek, door 3D-informatie te verstrekken over cellulaire infectieprocessen (virus, bacteriën of parasieten), morfologische veranderingen als gevolg van ziekten (zoals recessieve genetische ziekten) en ons te helpen de werking van geneesmiddelen op cellulair niveau te begrijpen, of specifieke structuren in de 3D-cellulaire omgeving te lokaliseren. Bovendien, door gebruik te maken van de instelbare golflengte bij synchrotronfaciliteiten, kan spectro-microscopie of zijn 3D-tegenhanger, spectro-tomografie, ook worden gebruikt om specifieke elementen in de cel in beeld te brengen en te kwantificeren, zoals calcium in biomineralisatieprocessen. Cryo-SXT biedt aanvullende informatie aan andere biologische beeldvormingstechnieken zoals elektronenmicroscopie, röntgenfluorescentie of fluorescentie van zichtbaar licht en wordt over het algemeen gebruikt als partnermethode voor 2D- of 3D-correlatieve beeldvorming bij cryogene omstandigheden om functie, locatie en morfologie te koppelen.

Inleiding

Cryo-SXT kan een centrale rol spelen in biologisch beeldvormingsonderzoek omdat het 3D-mediumresolutie (25-30 nm halve toonhoogte) volumes van gehydrateerde hele cellen 1,2,3,4,5,6 biedt. In het energiebereik van het watervenster, tussen de koolstof- en de zuurstofabsorptie K-randen (4,4-2,3 nm), absorberen koolstofrijke cellulaire structuren 10 keer meer dan het zuurstofrijke medium dat hen doordringt en omringt. In dit energiebereik kunnen verglaasde cellen tot 10 μm dikte worden afgebeeld zonder de noodzaak van sectie of kleuring, wat leidt tot kwantitatieve contrastprojecties met hoge absorptie, die, in combinatie met monsterrotatiemogelijkheden, de tomografische reconstructie van de cellulaire structuur mogelijk maken. Cryo-SXT vult een niche in termen van specimenafmetingen en ruimtelijke resolutie die niet gemakkelijk toegankelijk is met een andere beeldvormingstechniek.

Kortom, het absorptiecontrast van cryo-SXT is kwantitatief, aangezien de demping van de fotonen door het monster van dikte t als volgt voldoet aan de wet van Beer-Lambert: , waarbij I₀ de invallende intensiteit vertegenwoordigt en μ_l de lineaire absorptiecoëfficiënt, die afhankelijk is van de golflengte λ en het denkbeeldige deel β van de brekingsindex van het monster ( ). De verzwakking is een functie van de biochemische samenstelling en de dikte van de structuren die in beeld worden gebracht, waarbij elke biochemische component een specifieke röntgen lineaire absorptiecoëfficiënt heeft μ_l (LAC). Dit betekent dat elke tomografie voxel waarde afhankelijk is van de chemische elementen en hun concentratie in die voxel⁷. Dit maakt de natuurlijke discriminatie van verschillende organellen mogelijk, zoals kernen, nucleoli, lipidelichamen of mitochondriën, of verschillende verdichtingstoestanden van chromatine uitsluitend op basis van hun inherente LAC-waarden gereconstrueerd ^2,8,9.

Daarnaast is cryo-SXT een high throughput techniek waarbij tomogrammen in enkele minuten worden verzameld. Dit maakt specifiek mesoschaalbeeldvorming van celpopulaties mogelijk die kunnen worden vastgelegd op belangrijke tijdstippen zoals deling, differentiatie en apoptose, maar ook bij verschillende responstoestanden zoals die geïnduceerd door chemische blootstelling aan specifieke medicamenteuze therapieën of aan pathogene infecties. Gegevens die op die belangrijke punten worden verzameld, leveren een 3D-beschrijving van het systeem met een getrouw verslag van de ruimtelijke organisatie van de verschillende cellulaire organellen op die specifieke momenten.

Gewoonlijk wordt cryo-SXT gebruikt in combinatie met andere technieken volgens correlatieve benaderingen die het mogelijk maken om specifieke kenmerken, gebeurtenissen of macromoleculen binnen de 3D-cellulaire omgeving^te lokaliseren 4,10,11,12,13,14,15,16, of harde röntgenfluorescentiegegevens ^17,18 . Correlatieve benaderingen bij cryogene omstandigheden zijn van het grootste belang om een zo compleet en waardevol mogelijk beeld van het systeem van belang te krijgen. Een beknopte samenvatting van de typische workflow bij de Mistral (Alba) en B24 (Diamond) cryo-SXT beamlines is geschetst in figuur 1.

Bovendien kan, gebruikmakend van de golflengteafstemmingscapaciteit bij synchrotronfaciliteiten, spectroscopische informatie worden verkregen naast de structurele informatie met behulp van de specifieke differentiële absorptie van bepaalde elementen in het monster. Een voorbeeld hiervan is de locatie van calcium in de studie van biomineralisatieprocessen in cellen 19,20,21. Door 2D-beelden te maken op verschillende fotonenenergieën (spectra) of tomogrammen hieronder en aan de röntgenabsorptierand van belang, kunnen de pixels of voxels die het geselecteerde element bevatten, worden geïdentificeerd. Spectra maakt ook differentiërende chemische toestanden mogelijk (d.w.z. de evolutie van amorf calcium naar hydroxyapatiet zoals in het vorige biomineralisatievoorbeeld²⁰). Kwantificering van verschillende elementen is mogelijk in 2D en 3D. Spectroscopische beeldvorming van verglaasde cellen wordt meestal gedaan in het watervenster, maar is ook mogelijk bij andere energiebereiken als het watergehalte laag genoeg is of als andere monstervoorbereidingsprotocollen, waaronder uitdroging, worden gebruikt²². Een gedetailleerd spectroscopie stap-voor-stap protocol valt buiten de focus van het protocol hierin.

In wat volgt, richt het protocol zich op het kort samenvatten van de belangrijkste monstervoorbereidingsstappen, hoewel elk systeem mogelijk individuele verfijning nodig heeft, gevolgd door een gedetailleerde stapsgewijze gegevensverzamelingsprocedure voor cryo zachte röntgentomografie.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. De netondersteuning voorbereiden
   1. Bestraal de roosters gedurende 3 uur met UV met de koolstoffilm naar boven gericht voor sterilisatie.
   2. Optioneel: Als u problemen ondervindt met cellen die niet aan het raster zijn gekoppeld, voert u een van de volgende stappen uit.
      1. Hydrofiliseer de koolstofondersteuningsfolie door plasmabehandeling van de roosters om de monsterspreiding en een betere celhechting te vergroten.
         1. Plaats roosters koolstofzijde naar boven in de gloeie-ontladingskamerapparatuur en stel het rooster bloot aan het plasma gedurende 30 s tot 15 minuten (met ar of / en O₂), afhankelijk van de apparatuur.
      2. Functionaliseer de roosters met Poly-L-lysine (PLL)
         1. Voeg afzonderlijke druppels van 60 μL PLL toe in een petrischaaltje en plaats het rooster bovenop de PLL-druppel met de koolstoffilm naar beneden gericht. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en dep de PLL met een filtreerpapier.
      3. Functionaliseer de roosters met foetaal runderserum (FBS).
         1. Dompel de roosters 's nachts onder in FBS. Dompel de roosters in een bufferoplossing om te wassen en laat het rooster op een filterpapier staan om overtollige vloeistof te verwijderen.
2. Groeiende hechtende cellen op roosters
   1. Kweek cellen in een celkweekschaal van 100 mm om 80%-90% confluentie te bereiken (figuur 2A).
   2. Zaad 1-5 x 10⁵ cellen/ml (waarde aanpassen aan systeem) bovenop de Au-roosters in een P60 petrischaaltje (3 ml totaal).
      NOTITIE: De toevoeging van de celsuspensie moet zeer zorgvuldig gebeuren met de koolstoffilm van het raster naar boven gericht in een celkweekschaal van 60 mm. Bereid meerdere roosters per conditie, één voorwaarde per P60 Petrischaal (Figuur 2B).
   3. Laat de cellen bezinken totdat de samenvloeiing op het raster meerdere cellen bereikt (1 tot 10 afhankelijk van de celgrootte) in elk maasvak (afhankelijk van de cellijn kan dit tot 24 uur duren).
      NOTITIE: Voorafgaand aan het bevriezen moeten de roosters worden gecontroleerd met een zichtbare lichtmicroscoop (VLM), waarbij de integriteit van de koolstoffilm en de celconfluentie in elk raster worden geëvalueerd (figuur 2C). Wacht tot de juiste celdichtheid op het rooster is bereikt. Als het rooster te confluent is of de koolstoffolie kapot is, begin dan opnieuw.
3. Afzetting van cellen in suspensie op rasters
   1. Kies een voorbereid Au- of Cu-rooster met het pincet uit de dompelvriezer (zie rubriek 1.6).
   2. Bereid een suspensie van 1-5 x 10⁵ cellen (optische dichtheidsabsorptie van 0,3 in het geval van bacteriën) en voeg 4 μL van de bereide suspensie toe aan het rooster.
   3. Incubeer het rooster met de druppel gedurende enkele minuten horizontaal om afzetting van de cellen mogelijk te maken en plaats vervolgens het pincet dat het rooster vasthoudt in de klimaatgestuurde vitrificatiekamer die is ingesteld op de juiste temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden (stap 1.6.1).
4. Optioneel: fluorescerend labelen van de monsters
   NOTITIE: Het kan nuttig zijn om sommige organellen van het monster fluorescerend te labelen. Afhankelijk van de interesse kunnen specifieke fluoroforen of cellen die stabiel een fluorescerend eiwit tot expressie brengen of getransfecteerd zijn voor voorbijgaande expressie van een interessant eiwit worden gebruikt. Dit maakt eenvoudige detectie van cellen mogelijk met behulp van cryo-epifluorescentiemicroscopie en helpt bij het vinden van cellen die van belang zijn voor latere röntgenbeeldvorming. In wat volgt, beschrijft het protocol alleen het gebruik van fluoroforen.
   1. Bereid een werkoplossing voor de fluorofoor voor (zie de aanbeveling van de fabrikant) en volg het specifieke protocol.
   2. Voeg de fluoroforen toe aan de petrischaal met de roosters en meng voorzichtig.
   3. Laat incuberen in een donkere omgeving en ga direct naar stap 1.6 nadat de incubatie is voltooid.
      OPMERKING: Het is belangrijk om klaar te zijn om te vitrificeren zodra de incubatie is voltooid om niet-specifieke tagging en bijgevolg wazig fluorescerend signaal te voorkomen.
5. Au nanodeeltjes (NP's) voorbereiding voor tomogram projectie uitlijning
   1. Neem één aliquot van 1 ml van de Au fiducial stock solution (100 nm bij Mistral of 250 nm bij B24) en centrifugeer met lage snelheid (om aggregatie te voorkomen) gedurende 1 minuut om de NP's in staat te stellen te pelleteren.
      NOTITIE: Indien mogelijk heeft het de voorkeur om de fiducialen 's nachts of meer op natuurlijke wijze te laten bezinken, om aggregatie te voorkomen.
   2. Verwijder het supernatant. Suspensuspensie de NP's onmiddellijk voorafgaand aan het invriezen opnieuw in een serumvrij medium van 20 μL of bufferoplossing om een homogene oplossing te verkrijgen.
      NOTITIE: Sonicatie en vortexing wordt aanbevolen om de oplossing te helpen homogeniseren.
6. Roosters voor het invriezen van dompelen
   LET OP: Vloeibare stikstof kan koude brandwonden veroorzaken en de juiste beschermende uitrusting moet worden gedragen (lange laboratoriumjas, veiligheidsbril, handschoenen, lange broek en gesloten schoenen). Ethaan is zeer explosief en moet uit de buurt van vonken of open vuur worden gehouden.
   1. Volg de instructies van de fabrikant om het dompelvriezerinstrument voor te bereiden en te gebruiken.
      NOTITIE: Vochtigheid is meestal ingesteld op 80% -90%; de temperatuur is afhankelijk van het celtype (gist maximaal 30 °C, zoogdiercellen 37 °C, insectencellen 28 °C, enz.).
   2. Neem een rooster met het montagepincet van de petrischaal bij de rand, zorg ervoor dat u het rooster niet buigt en monteer het op het vriesapparaat. Zorg ervoor dat de cellen uit de buurt van het vloeipapier staan.
   3. Optioneel: was het rooster drie keer in buffer in het geval van aanhangende cellen.
   4. Voeg 1,5 μL Au NP-fiducials toe aan de cellen (door het gat aan de rechterkant van de kamer) en laat 30 s bezinken voordat u het rooster dept en stort.
      NOTITIE: In het geval van cellen in suspensie, voeg Au NP-fiducials toe aan het rooster terwijl het nog in horizontale positie staat voordat u het pincet monteert en laat ze genoegen nemen met 30 s. Blotting is cruciaal voor roosters van hoge kwaliteit. De debietafstand moet worden gekalibreerd voordat u begint; vlakheid van vloeipapier is belangrijk voor reproduceerbaar dempen (volg de instructies van de fabrikant). De deegtijd moet voor elk celtype worden beoordeeld.
   5. Bereid meerdere roosters per conditie voor. Breng het rooster over en bewaar bij cryogene temperaturen om vitrificatie te behouden.
7. Rasters screenen met cryo-microscopie van zichtbaar licht
   1. Breng de roosters onder vloeibare stikstof van de cryoboxen over naar een standaard cryocassette (drie posities voor 3 mm TEM-roosters) in een voorgekoelde cryotrap (zie instructies van de fabrikant).
   2. De cryocassette wordt op de cryotrapbrug geplaatst en de cryotrap wordt op een breedveldige epifluorescentielichtmicroscoop gemonteerd.
   3. Stel de rasters bij -196,5 °C in beeld met behulp van een lange werkafstandsdoelstelling (10x, 50x, 100x) om geschikte cellen voor cryo-SXT-beeldvorming te lokaliseren en de rasterkwaliteit te beoordelen (aanwezigheid van dik ijs, integriteit van de koolstofondersteuningsfilm, aanwezigheid van fluorescerend signaal, enz.).
   4. Lokaliseer de cellen van belang met behulp van heldere veld- en / en fluorescentiebeeldvorming.
      OPMERKING: Leg in dit stadium de beelden vast als er een gekoppelde camera op de microscoop aanwezig is. Gebruik het voor beeldcorrelatie.
   5. Breng na het screenen de roosters terug naar de cryo-boxen in een vloeibare stikstofopslag dewar.
      NOTITIE: Als er geen goede monsters worden gevonden, herhaalt u de monstervoorbereidingsstappen waarbij een van de parameters wordt gewijzigd. Meestal zijn de parameters die moeten worden gewijzigd de dempingstijd, in het geval dat het ijs te dik is of de samenvloeiing, als er te veel cellen per mesh-vierkant zijn.

2. Laden in de Transmissie X-Ray Microscoop (TXM)

1. Koel de transferkamer met vloeibare stikstof totdat deze < 100 K bereikt, koel het werkstation (figuur 3A) en zet de verwarming van de rand van het werkstation aan. Wacht tot het stopt met koken.
2. Plaats de benodigde cryoboxen met roosters op de overeenkomstige locaties in het werkstation (figuur 3A). Besteed aandacht aan het veilig overbrengen onder cryo-omstandigheden.
3. Laad de geselecteerde roosters in de eerder gekoelde monsterhouders (figuur 3B); laad de houders op de shuttle en bescherm ze met de afdekkingen (figuur 3C).
4. Laad de shuttle in de overslagkamer met < 100 K en pomp deze naar beneden tot een laag vacuüm (figuur 3D).
5. Bevestig de overslagkamer aan de TXM (figuur 4A) en laad de shuttle van de overslagkamer in de TXM volgens de vacuümprocedure op het scherm (figuur 4B).
6. Zodra de shuttle binnen is met de monsters, kan de TXM-robotarm één monsterhouder tegelijk naar de monsterfase brengen (figuur 4C).

3. Beeldvorming met behulp van de TXM-software

OPMERKING: Rasters in de monsterfase worden eerst afgebeeld met behulp van een online zichtbare lichtmicroscoop (VLM) om het raster in helderheidsveld- en / of fluorescentiemodus in kaart te brengen voordat ze met röntgenstralen worden afgebeeld. Gebruik het joystickpictogram dat overeenkomt met het tabblad Motion Control in het deelvenster linksboven om Motion Control te openen.

1. Het raster in beeld brengen met de online VLM.
   1. Heldere veldmozaïek acquisitie
      1. Selecteer de VLM-camera (vergrootglas > VLM) en schakel de VLM-ledbron in voor heldere veldbeeldvorming (Microscoop > Acquisitie -> Acquisitie-instellingen > Broninstellingen en selecteer Transmissie).
      2. Draai het monster tot -60 graden om de VLM-doelstelling te bereiken (Motion Control > Sample > Sample θ) en verplaats het monster naar de verwachte gecentreerde posities (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
      3. Tijdens het verwerven van beelden in stappen van 20 tot 50 μm eerst om het raster ruwweg scherp te brengen (Microscoop > Acquisitie > Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Continue > Start; Motion Control > Voorbeeld en wijzig Voorbeeld Z).
      4. Verfijn de focus met kleinere stappen tot 5 μm totdat de cellen en/of de gaten van de koolstofondersteuningsfilm scherp zijn (Microscoop > Acquisitie > Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Continue > Start; Motion Control > Sample en change Sample Z) en start de verwerving van een volledige mozaïekkaart van het raster in de heldere veldmodus. Gebruik de standaardwaarden voor het mozaïek. (Microscoop > Acquisitie > Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Mozaïek > Start).
         NOTITIE: Een mozaïekkaart is gemaakt van afzonderlijke afbeeldingen. Het aantal afbeeldingen (aantal kolommen, rijen en de stapgrootte in X en Y) moet worden ingesteld om het hele raster te visualiseren. De stapgrootte is afhankelijk van de grootte van het gezichtsveld (FoV). De standaardwaarden worden hier gebruikt. Als het raster niet goed gecentreerd is in het X-Y-vlak ten opzichte van de volledige mozaïek FoV, stop dan de acquisitie, corrigeer de X- en Y-coördinaten van het monster en herhaal de acquisitie.
   2. Fluorescentiemodus mozaïek acquisitie
      1. Schakel de VLM-geleide bron uit voor heldere veldbeeldvorming (Microscoop > Acquisitie - > Acquisitie-instellingen > Broninstellingen en selecteer Transmissie) en selecteer de LED-lichtbron die overeenkomt met de gewenste excitatiegolflengte (rood, groen of blauw) en het bijbehorende optische filter handmatig op de set-up.
      2. Verfijn de focus op het fluorescentiebeeld (Microscoop > Acquisitie -> Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Continue > Start; Motion Control > Monster bemonsteren en wijzigen monster Z) en verkrijgt vervolgens een mozaïekkaart met behoud van de positionele parameters (X en Y) van het heldere veldmozaïek (Microscoop > Acquisitie - > Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Mozaïek > Start).
      3. Schakel de LED-lichtbron uit
      4. Optioneel: Annoteer op basis van de heldere veld- en fluorescentiemozaïekkaarten de eerder geïdentificeerde interessegebieden (ROI) (stap 1.7.4) of nieuwe ROI (X-Y-posities in de afbeelding).
2. X-ray mozaïek acquisitie
   1. Selecteer de CCD-röntgendetector (vergrootglas > selecteer Pixis), breng het monster naar 0 graden rotatie (Motion Control > Sample and change Sample θ) en verplaats de röntgenstralingsoptiek (Condensor en Zone Plate) naar de uitgelijnde posities (Motion Control > Condenser > condensor z veranderen; Motion Control > zoneplaat en verander zoneplaat Z).
      NOTITIE: Koel de CCD-chip af tot -65 °C voordat u de foto maakt (Microscoop > Cameratemperatuur > Pixis en wijzig de ingestelde temperatuur naar -65 °C en klik op Toepassen).
   2. Verplaats het monster naar het midden van het netvierkant van een van de geselecteerde ROI(Motion Control > Sample en wijzig Sample X, Sample Y).
   3. Gebruik binning 2 en exit spleet op 5 μm om bestraling en 1 s belichting bij Mistral te minimaliseren, en binning 1 en 60 μm bij B24, pas de focus aan met behulp van sample Z-vertaling (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings en verander binning; Motion Control > XS en verander XS; Microscoop > Acquisitie > Acquisitie Instellingen> Acquisitie Modi > Continue > Start; Motion Control > Voorbeeld en wijzig Voorbeeld Z). Begin in stappen van 5 μm en verfijn het tot stappen van 0,5 μm, totdat de cel of de koolstoffoliegaten goed in focus zijn.
   4. Verkrijg een mozaïekkaart van het maasplein (Microscoop > Acquisitie -> Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodus > Mozaïek > Start).
      NOTITIE: Mozaïekacquisitieparameters kunnen op dezelfde manier worden bepaald als voor de VLM-mozaïeken (punt 3.1.1.4). De stapgrootte is afhankelijk van de vergroting die vooraf is geselecteerd door de beamline-staf.
   5. Verplaats het monster naar een Flat-Field (FF) positie (een leeg gebied binnen het raster, bij voorkeur een gat in de koolstofsteun) (Motion Control > Sample en verander Sample X, Sample Y).
   6. Stel de belichtingstijd in op 1 s bij Mistral en 0,5 s bij B24 (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings en wijzig Exposure Time) en verkrijg een enkele afbeelding (Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Single > Start).
   7. Normaliseer (deel) het verkregen mozaïek door de FF-afbeelding om de transmissie te verkrijgen (met waarden tussen 0 en 1) en sla het genormaliseerde mozaïek op (klik op het pictogram in de rechterbovenhoek rechts aan de rechterkant van de afbeelding om het menu te openen>kies het tabblad Referentie> klik op Enkele referentie en blader door de specifieke FF).
3. Voorbereiding op het verzamelen van een röntgenkantelserie
   NOTITIE: Zoek de rotatieas voor elk interessegebied dat wordt afgebeeld.
   1. Maak een selectie van gebieden in de mozaïeken om tomografie uit te voeren, d.w.z. door een vierkante vorm te plaatsen (klik op Gereedschap aan de linkerkant van het afbeeldingsvenster) met de grootte van de FoV in de röntgenmozaïekkaart.
      NOTITIE: Houd bij het selecteren van gebieden rekening met de afstand tot de rand (≥10 μm) en andere cellen om overlapping van cellen tijdens rotatie te voorkomen. Controleer bovendien de toestand van de cel (verwachte celvorm, ijsdikte, succes van vitrificatie, fiduciale verspreiding, enz.).
   2. Voorbeelduitlijning op de rotatieas
      NOTITIE: De gerapporteerde procedure is iteratief. De iteratie convergeert sneller met behulp van ± hoeken van 60° als maximale rotatiehoeken (θ_M). Als ze niet toegankelijk zijn, gebruik dan hoeken die zo dicht mogelijk bij ± 60° liggen.
      1. Stel de camera in op binning 2, belichtingstijd 1 s (Microscoop > Acquisitie > Acquisitie-instellingen > Camera-instellingen en wijzig belichtingstijd; binning wijzigen; Microscoop > Acquisitie > Acquisitie Modi > Continue > Start), stel de uitgangsspleet in op 5 μm.
         NOTITIE: Minimaliseer de dosis zoveel mogelijk door te werken met een minimale opening van de uitgangsspleet.
      2. Met de rotatie op 0°, ga je naar het eerder geselecteerde gebied met behulp van de X- en voorbeeld Y-translatie en concentreer je je op de functie van de cel om in de rotatieas te plaatsen met behulp van de voorbeeld Z-translatie (Motion Control > Sample en change Sample x; Voorbeeld y; Voorbeeld z).
      3. Draai het monster naar + θ_M (Motion Control > Sample en wijzig Sample θ) en teken een lijn (L+) (klik op de knop met het lijngereedschap aan de rechterkant van het afbeeldingsvenster) op de functie van de cel die u op de rotatieas wilt plaatsen.
      4. Roteer naar -θ_M (Motion Control > Sample en wijzig Sample θ) en teken een lijn (L-) (klik op de knop met het lijngereedschap aan de rechterkant van het afbeeldingsvenster) op de functie van de cel die u op de rotatieas wilt plaatsen.
      5. Gebruik bij +θ_M of -θ_M de vertaling van voorbeeld Z om de geselecteerde functie naar de middelste positie tussen beide lijnen te verplaatsen (Motion Control > Sample en change Sample Z).
      6. Herhaal de procedure vanaf stap 3.3.2.3 iteratief totdat een minimumafstand L+ tot L- is bereikt.
         NOTITIE: De afstand tussen de twee lijnen L+ en L- moet kleiner zijn ten opzichte van de vorige iteratie.
      7. Bij monster θ = 0 (Motion Control > Sample and change Sample θ) verplaats je sample X tweemaal de afstand die nodig is om de geselecteerde functie in het midden van beide lijnen te plaatsen (Motion Control > Sample en change Sample X). Verplaats de zoneplaat (ZP) X om de functie terug te brengen naar het midden van de FoV (Motion Control > ZP en wijzig ZP X). Voer deze stap slechts één keer per rooster uit.
      8. Optimaliseer de ZP Z-positie opnieuw ten opzichte van de nieuwe rotatieas door een ZP Z-focale serie op te nemen (verzamelingen beelden op verschillende ZP Z-posities, meestal in stappen van 0,3 μm) (Microscoop > Acquisitie-> Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Focal Series > Start) en verplaats de ZP Z naar de positie waar het monster scherp is (Motion Control > Zone Plate en verander Zone Plate z).
      9. Stel de parameters in voor de acquisitie van de kantelserie.
         NOTITIE: Het maximale hoekbereik wordt uiteindelijk beperkt door de brandpuntsafstand van de ZP (±70 of ±65 graden voor respectievelijk een ZP van 40 nm of 25 nm voor een vlak monster). Optimaliseer de signaal-ruisverhouding (S/N) en stralingsschade om de blootstellingstijd te bepalen. Gebruik voor tomografie verschillende belichtingstijden op verschillende hoekbereiken.
      10. Bepaal het hoogste rotatiehoekbereik, voor het geval schaduw optreedt voordat de maximale rotatiehoek is bereikt.
      11. Stel de camera binning in op 1 (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Camera Settings en wijzig Binning), open de exit spleet op 15 μm bij Mistral (Motion Control > XS en verander XS) en stel de rotatie in op 0° (Motion Control > Sample en change Sample θ).
      12. Verkrijg een enkele afbeelding met een belichtingstijd van 1 s (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Acquisition Modes > Single > Start) en schat de belichtingstijd die nodig is voor elke kantelhoek van de tomografie.
4. Tomografie acquisitie
   1. Ga naar de negatieve maximale hoek +0,1 (ga bijvoorbeeld voor ZP 25 nm naar -65,1°) (Motion Control > Sample en wijzig Sample θ).
   2. Stel het aantal afbeeldingen in als het totale aantal hoeken (rekening houdend met de afbeelding onder hoek 0) en het hoekbereik (Microscoop > Acquisitie-> Acquisitie-instellingen > Acquisitiemodi > Tomografie en wijzig het aantal afbeeldingen; wijzig vervolgens Hoek begin en hoekeinde).
   3. Stel de gedefinieerde belichtingstijd in en start de acquisitie (Microscoop > Acquisitie - > Acquisitie-instellingen > Camera-instellingen en wijzig belichtingstijd en klik vervolgens op Start).
   4. Ga naar de FF-positie (Motion Control > Sample en verander Sample X; verander vervolgens Sample Y) en verkrijg 10 FF-afbeeldingen (Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Average en verander het aantal afbeeldingen en klik vervolgens op Start).
      NOTITIE: Bij Mistral is spectromicroscopie of energieafhankelijke microscopie mogelijk bij het verkrijgen van projecties terwijl de energie over een absorptierand van belang wordt gescand. De uiteindelijke output is een stapel 2D-projecties, die in elke pixel een röntgenabsorptiespectrum (XAS) bevatten, d.w.z. beelden met chemische informatie. Uitbreiding naar 3D combineren van spectroscopie met tomografie is in principe mogelijk. De totale vereiste dosis kan een beperking zijn en dan kunnen specifieke strategieën zoals differentiële absorptiebeeldvorming vereist zijn.

4. Data-analyse

OPMERKING: Alle gegevensanalyse wordt uitgevoerd met beschikbare open software en scripts die zijn ontwikkeld met geautomatiseerde pijplijnen.

1. Bij Mistral
   1. Pipeline converteert tomografiestacks van txrm-extensie (TXM-software-extensie) naar hdf5 (open source hiërarchisch gegevensformaat) met alle benodigde metadata, normaliseert vervolgens de stack met het FF-gemiddelde en de machinestroom en deconvoleert ten slotte de stacks door de gemeten puntspreidingsfunctie van het optische systeem voor een specifieke Fresnel zoneplaat (ZP) lens en energie^{23, 24}. Zoek voor deconvolutie de juiste k = 1/SNR-waarde (afhankelijk van de dikte van het monster). Voor het script ontwikkeld bij Mistral, typ het commando: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " energy " - dx= " pixel size " - k= " 1/SNR " - t=-1.
   2. Voor het script dat bij Mistral is ontwikkeld voor automatische uitlijning, typt u het commando: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5".
      OPMERKING: Een aantal softwaretoepassingen kan worden gebruikt voor het uitlijnen van de projecties op een gemeenschappelijke rotatieas met behulp van de Au NP-fiducials^25,26. Uitlijning van de projecties vereist subpixelnauwkeurigheid. Automatische uitlijning kan alleen bevredigend zijn als Au NP-fiducials voldoende zijn (>7) en goed verspreid over het gezichtsveld. Handmatige uitlijning is vaak a posteriori nodig om de automatische uitlijning te corrigeren voor het bereiken van de hoogst mogelijke nauwkeurigheid.
   3. Als u de uitgelijnde genormaliseerde stapel wilt reconstrueren, gebruikt u een van de verschillende beschikbare algoritmen.
      OPMERKING: De uitgelijnde stapel kan in enkele minuten worden gereconstrueerd met behulp van Weighted Back Projection (WBP) of Simultaneous Iterative Reconstruction Techniques (SIRT). Om de lineaire absorptiecoëfficiënten (LAC) te behouden, heeft Algebraic Reconstruction Techniques (ART) echter de voorkeur²⁷. ART vereist meer rekentijd, dus SIRT²⁸ wordt als eerste gedaan voor een snelle reconstructie van de automatisch uitgelijnde kantelserie (30 iteraties in enkele minuten). Zodra de uitlijning bevredigend is, zal ART worden gebruikt.
2. Bij B24
   1. Een op maat gemaakte pijplijn converteert txrm-gegevensbestanden naar standaard Tiffs met alle benodigde metagegevens en verzendt ze vervolgens naar een batch runtomo-workflow die de datasets op drie manieren verwerkt: WBP, SIRT en patch.

Resultaten

Het voorbereiden van monsters voor cryo-SXT kan een uitdaging zijn. Zelfs binnen hetzelfde steekproefraster is het mogelijk om gebieden te hebben die ideaal zijn en gebieden die niet-ideaal zijn, zoals te zien is in figuur 5, die twee vierkanten van hetzelfde Au finder-raster toont. Het ideale monster moet enkele cellen hebben in het midden van een vierkante maas, ingebed in een dunne laag ijs en omgeven door goed gedispergeerde Au fiducial markers die worden gebruikt voor de uitlijning van kantelprojecties voorafgaand aan tomografiereconstructie. Figuur 5A toont een fibroblastachtige cel (NIH 3T3) die aan veel van deze criteria voldoet. Een enkel segment uit een 3D-reconstructie met behulp van ART²⁷ van het gebied gemarkeerd met het rode vak dat het gezichtsveld (FoV) aangeeft, wordt weergegeven in figuur 5B. Veel verschillende organellen zoals mitochondriën (M), endoplasmatisch reticulum (ER), blaasjes (V) en de kern (N) kunnen worden onderscheiden dankzij de kwantitatieve reconstructie van de LACs. Bovendien is de signaal-ruisverhouding van de reconstructie zeer hoog, waardoor een hoog contrast van de cellulaire functies kan worden bereikt. Aan de andere kant toont figuur 5C een vierkant met een hogere celdichtheid. Hierdoor is het vlekken meestal minder efficiënt, wat leidt tot een dikkere ijslaag of zelfs vitrificatieproblemen. In sommige gevallen kan dit al worden waargenomen bij het screenen van het raster met behulp van epifluorescentiemapping voorafgaand aan de röntgenbeeldvorming, en die rasters moeten ten koste van alles worden vermeden. In figuur 5C is een scheur in het raster en het verglaasde ijs waarneembaar door het hele gaasvierkant (gemarkeerd door de rode pijlen). Elke beeldvorming in de buurt van scheuren moet worden vermeden vanwege waarschijnlijke instabiliteit van het raster bij blootstelling aan de bundel. Bovendien kunnen scheuren een teken zijn van dik ijs, zoals het geval was in dit gebied. Een kantelreeks werd opgenomen in het gebied gemarkeerd met het rode vak. In figuur 5D wordt een enkel segment uit de bijbehorende 3D-reconstructie weergegeven. Hoewel sommige grotere structuren kunnen worden herkend, gaan fijne details verloren in het lawaai en de korrelige textuur als gevolg van de slechte verglazingskwaliteit van het dikke ijs, zoals specifiek te zien is, bijvoorbeeld op de bovenste mitochondriën die door de pijl worden gewezen.

Figuur 1: Workflow. Schematische workflow gevolgd voorafgaand aan cryo-SXT-gegevensverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Cellen kweken op roosters. (A) Cellen die groeien in een P100 petrischaal met een samenvloeiing van ongeveer 80% -90%. (B) P60 Petrischaal met verschillende roosters na het zaaien van de cellen. (C) Cellen die na 24 uur bovenop een rooster groeien. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Laadroosters op de monsterhouders en in de overslagkamer. (A) Werkstation gevuld met vloeibare stikstof met de shuttle en de cryoboxen klaar voor het laden van de roosters. (B) Monsterhouder in de lader gestoken met het rooster geladen. C) Pendel met de monsterhouder op plaats 3 zonder deksel. D) Werkplek met de overgebrachte kamer bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Monsters laden in de TXM (A) De overdrachtskamer aan de TXM bevestigen. (B) Shuttle binnen de TXM. (C) TXM-robotarm die de monsterhouder in de monsterfase steekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Voorbeeld van cryozachte röntgentomogrammen. Bovenste rij: ideaal monster, (A) 2D-mozaïekweergave van een rastervierkant met een geïsoleerde cel in het midden. (B) Eén segment uit het gereconstrueerde 3D-volume met het gemarkeerde gebied met het rode vak (A). In vergelijking met (D) is het beeld veel vloeiender en zijn er meer details zichtbaar. Onderste rij: niet-ideale monsters, (C) 2D-mozaïekweergave van een rastervierkant met een te hoge celconfluïteit en scheuren in het ijs en rasterfolie (rode pijlen). (D) Eén segment uit het gereconstrueerde 3D-volume met het gebied dat is gemarkeerd met het rode vak in (C). De slechte of suboptimale vitrificatie is te herkennen aan de korrelige textuur van het beeld. N: Kern; M: Mitochondriën; ER: Endoplasmatisch Reticulum; MV: Multivesiculaire lichamen; V: Vacuole; Schaalstaven: A & C 20 μm; B&D 2 μm.VKlik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Monstervoorbereiding is een cruciale stap om zachte röntgentomogrammen van hoge kwaliteit te verkrijgen, omdat hun kwaliteit rechtstreeks afhangt van de kwaliteit van de monsterverglazing en de ijslaagdikte waarin de cel is ingebed. Projecties met een hoge signaal-ruisverhouding zullen worden verzameld in regio's met een dunne ijslaag, waardoor de stralingsdosis die nodig is om de hoogst mogelijke resolutie te bereiken, kan worden geminimaliseerd. Bovendien zal de celconfluentie ook de uiteindelijke tomogramkwaliteit beïnvloeden, omdat men moet voorkomen dat naburige cellen bij rotatie de FoV binnenkomen. Ten slotte zal de juiste dispersie van Au fiducial markers de nauwkeurigheid van de projectie-uitlijning bepalen en uiteindelijk de kwaliteit van het uiteindelijke 3D gereconstrueerde volume bepalen. Merk op dat een goede spreiding van Au fiducials op het net automatisering van de projectie-uitlijningsstap mogelijk maakt, zonder welke een hoge expertise nodig is voor een dergelijke kritieke stap.

Het protocol hierin geeft slechts één mogelijke monstervoorbereidingsstrategie weer, die overeenkomsten vertoont met die welke worden gebruikt in cryo-elektronentomografie (cryo-ET). In beide gevallen zullen protocollen die de veeleisende monstervoorbereiding verbeteren voor een betere reproduceerbaarheid van fundamenteel belang zijn voor het succes van deze technieken, en er worden inspanningen geleverd om dit doel te^{bereiken 29}. Het is vermeldenswaard dat naast het afbeelden van geïsoleerde cellen, delen van weefsel ook kunnen worden gevisualiseerd, op voorwaarde dat het transmissiesignaal door de sectie voldoende is bij hoge kantelhoeken. Meestal impliceert dit secties van enkele micron (minder dan 10 μm).

Om een specifieke structuur of gebeurtenis in een cel in beeld te brengen, moet men ervoor zorgen dat deze specifieke functie zich in de FoV van de kantelreeks bevindt. Aangezien de FoV in cryo-SXT beperkt is tot 10 x 10 μm² tot 15 x 15 μm² afhankelijk van de lens en rekening houdt met een pixeloversampling van de resolutie tot ten minste een factor 2, is deze vaak kleiner dan de volledige celuitbreiding (zie de rode vierkanten aangegeven in figuur 5). Daarom moet de ROI worden gevonden en correct worden gelabeld. Dit gebeurt meestal door middel van fluorescerende tags en zichtbare lichtcorrelatieve benaderingen. 2D-strategieën die epifluorescentie combineren zijn eenvoudig omdat de zachte röntgentransmissiemicroscoop een geïntegreerde on-line fluorescentiemicroscoop voor zichtbaar licht heeft, maar andere benaderingen voor hoge resolutie 2D- of 3D-fluorescentiesignaal zijn ook beschikbaar 4,12,13,15,16 . In die gevallen moet het raster eerst in beeld worden gebracht in specifieke instrumenten zoals superresolutiemicroscopen. Merk op dat de meest efficiënte correlatieve benaderingen die zijn met betrekking tot gegevensverzameling onder cryogene omstandigheden. Dit komt omdat het tijdsverloop tussen kamertemperatuur (RT), beeldvorming van zichtbaar lichtfluorescentie en monsterverglazing bijvoorbeeld het vangen van de juiste cellulaire gebeurtenis op tijd zal belemmeren; bovendien kan de vitrificatieprocedure de cel van belang die bij RT is afgebeeld, loskoppelen van het raster. Zelfs als de meeste correlatieve beeldvormingsbenaderingen zouden kunnen impliceren dat de monsterrasters moeten worden gemanipuleerd en getransporteerd van het ene instrument naar het andere, en ondanks het verhoogde risico op netverontreiniging of schade dat dit met zich meebrengt, is de beloning duidelijk: om specifieke gebeurtenissen of moleculen binnen het cellulaire landschap te kunnen lokaliseren.

Wanneer beeldvorming van de hele cel vereist is, is het mogelijk om verschillende tomogrammen te naaien, op voorwaarde dat de totale toegediende dosis de limiet voor stralingsschade niet overschrijdt. Gewoonlijk ligt de gedeponeerde dosis voor het verzamelen van enkele tomogrammen op dezelfde cel ruim onder de limiet bij de haalbare resolutie (10⁹ Gy) en daarom is er geen specifieke strategie vereist om de dosis te verlagen, hoewel dit steekproef- en experimentafhankelijk is. In het geval van intensieve gegevensverzameling zoals spectrotomografie zou het minimaliseren van de dosis inderdaad vereist zijn en zouden gemakkelijke gegevensverzameling en specifieke verwerkingsstrategieën moeten worden toegepast.

Cryo-SXT heeft verschillende beperkingen, die hier moeten worden vermeld. De eerste is de bekende ontbrekende wig, die inherent is aan het gebruik van platte monstersteunen. Capillaire monstersteunen die een rotatie van 180 graden mogelijk maken, zijn in het verleden gebruikt en worden nog steeds gebruikt in sommige faciliteiten, maar ze hebben ook nadelen zoals een verarmd contrast als gevolg van de glasabsorptie en de beperking van het gebruik van cellen in suspensie. Een manier om het effect van de ontbrekende wig te verminderen, is door dual tilt tomografie uit te voeren. Dat kan tegenwoordig inderdaad bij de Mistral beamline. De tweede beperking wordt ingesteld door de Fresnel-zoneplaatlens die in dergelijke microscopen wordt gebruikt. Dit objectief stelt de ultiem haalbare resolutie en de scherptediepte (DoF) in, beide zijn nauw met elkaar verbonden. Dit impliceert dat het verhogen van de resolutie de DoF zal verminderen, terwijl de dikte van de cel vaak groter zal zijn. Zo heeft een 40 nm lens in theorie een DoF van 3 μm en een resolutie van 24,4 nm halve toonhoogte. Het compromis tussen resolutie en DoF is daarom strategisch en de keuze van het objectief zal afhangen van het type cel^30,31. Ten slotte zijn operationele TLM's wereldwijd verre van ideale microscopen en worden er inspanningen geleverd om de optische systemen te verbeteren om aan de theoretische verwachtingen te voldoen. Ten slotte kan de visualisatie en segmentatie van de gereconstrueerde volumes worden uitgevoerd met specifieke softwaretools 25,32,33,34.

Samenvattend maakt cryo-SXT het mogelijk om cellen kwantitatief af te beelden met een gemiddelde resolutie (25-30 nm halve toonhoogte) en in statistische aantallen (enkele tientallen tomogrammen per dag). Dit maakt het mogelijk om de organisatie, distributie en dimensie van organellen te verkrijgen onder specifieke omstandigheden, bijvoorbeeld tijdens pathogene infectie of ziekten, op precieze tijdstippen of na bepaalde behandelingen. Het is daarom een nuttige aanvullende biologische beeldvormingstechniek voor de meer gebruikelijke elektronen- en zichtbare lichtmicroscopieën, die elk een specifiek bereik van monsterafmetingen en resolutie aanpakken. Cryo-SXT wordt vaak gebruikt in correlatieve benaderingen met fluorescentie van zichtbaar licht, maar andere cryo-correlatieve strategieën zijn ook mogelijk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amira	Thermo Fisher		Software voor segmentatie
Au Holey Carbon Films  zoeker rasters	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2 Au G200F1	Au Holey Carbon Films zoeker rasters
Au nanodeeltjes	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanodeeltjes 100nm	100 nm Au nanodeeltjes (NPs) bij Mistral (Alba)
Au nanodeeltjes	BBI Group, Cardiff, UK	Au nanodeeltjes 250nm	250 nm Au nanodeeltjes (NPs) bij B24 (Diamond)
Axio Scope A1	Zeiss	430035 9060	Fluorescentiemicroscoop
Blotting No.1 filterpapier	Whatman	WHA10010155	Blottingfilter
Bsoft			Software voor projectieuitlijning, reconstructie en visualisatie (Heymann et al., 2008)
Chimera			Software voor segmentatie (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge Set	PELCO easiGlow	91000S	Glow Discharge Cleaning System
Cu Holey Carbon Films  zoeker rasters	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2Cu G200F1	Cu Holey Carbon Films zoeker rasters
Foetaal runder serum	Sigma	F9665	Warmte-inactivatie, sterieel gefilterd, geschikt voor celkweek
ImageJ			Software voor beeldverwerking en analyse in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
IMOD			Software voor projectieuitlijning, reconstructie en visualisatie (Kremer et al., 1996)
Leica EM GP Grid Plunger	Leica	16706401	Automatische Plunge Freezer EM
LINKAM cryo-stage	Linkam Scientific Instruments	CMS 196	Cryo-correlatie microscoopstage
MIB			Software voor segmentatie (Belevich et al. 2016)
P100 Petri schotel	Sigma	P6106	Behandeld voor celkweek en sterieel
P60 Petri schotel	Sigma	D8054	Behandeld voor celkweek en sterieel
Polylysine	Sigma	P4707	Poly-L-lysine oplossing 0,01%, sterieel gefilterd
Zachte X-Ray microscoop 0,25-1,2keV	Xradia	NCT-SB	Transmissie zachte X-Ray microscoop
SURVOS			Software voor segmentatie  (Luengo et al. 2017)
Tomo3d			Software voor reconstructie (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJ			Software voor reconstructie (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data Explorer	Zeiss		TXM software