$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Gegevens downloaden
- Download de gegevens van de toetreding PRJNA386367 uit de NCBI-databank. Selecteer uit de gegevens van de toetreding PRJNA386367 de rhizosfeer-, rhizoplane- en endosfeermicrobioomgegevens van rijstplanten die in 2014 gedurende 14 weken in een ondergedompeld rijstveld in Arbuckle, Californië zijn geteeld.
OPMERKING: De gegevens over de rhizosfeer, rhizoplane en endosfeermicrobioom werden gepresenteerd door de OTUs-tabel in de toetredingstabel PRJNA386367.
2. Optimale bepaling van de vermogenswaarde
OPMERKING: Het WGCNA-pakket bevat alle volgende functionele parameters. WGCNA is een R-pakket voor gewogen correlatienetwerkanalyse. De belangrijkste opdrachtregels verwijzen naar het supplement S1.
- Open in de R-taalomgeving de Rstudio-software en installeer het WGCNA-pakket.
- Laad de gegevens en gebruik de functie goodSamplesGenes om de juistheid van de gegevens te controleren. Voer de opdrachtregels uit:
"gsg = goedSamplesGenes(datExpr0, uitgebreid = 3)
gsg$allOK "
Klik op Uitvoeren.
- Controleer op uitschieters en bewaar monsters die aan de vereisten voldoen. Wanneer het controleresultaat WAAR is, gaat u verder met de volgende stap. Sla het resultaat op.
- Gebruik de functie PickSoftThreshold om de schaalvrije index R2 van de twee groepen gegevens onder verschillende vermogenswaarden te berekenen. Voer de opdrachtregel uit:
"sft = pickSoftThreshold(datExpr0, powerVector = powers, verbose = 5)"
Klik op Uitvoeren.
- Visualiseer de resultaten (Figuur 1). Voer de opdrachtregel uit:
"plot(sft$fitIndices[,1], -teken(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",
main = plakken("ES_Scale onafhankelijkheid"));
tekst(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
labels=powers,cex=cex1,col="rood");
abline(h=0,9,col="rood")
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
xlab="Zachte drempel (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n",
main = plakken("ES_Mean connectiviteit"))
tekst(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red")"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: Het uitgangspunt van het gewogen correlatienetwerkalgoritme is dat de gevestigde co-expressienetwerkstructuur voldoet aan de normen van het schaalvrije topologiecriterium, waardoor de robuustheid ervan toeneemt. Een schaalloze index dichter bij 1 geeft een netwerkstructuur aan die dichter bij het schaalvrije netwerk ligt.
- Selecteer de vermogenswaarde wanneer de schaalvrije index R2 groter is dan 0,9 en ga verder met de volgende analysestap.
OPMERKING: Wanneer de schaalvrije index dicht bij 1 ligt, ligt de netwerkstructuur dichter bij het schaalvrije netwerk. Bij het analyseren van twee of meer netwerken is het noodzakelijk om ervoor te kiezen om elk netwerk dicht bij de vermogenswaarde van het schaalvrije netwerk te brengen om te voldoen aan de vergelijkbaarheid tussen de co-uitgedrukte netwerken.
3. Aanleg van een co-expressienetwerk en module-identificatie
OPMERKING: Op basis van de bovenstaande berekende vermogenswaarde wordt het co-occurrence netwerk opgebouwd. De belangrijkste opdrachtregels verwijzen naar het supplement S2.
- Gebruik de hulpfunctie in het WGCNA-pakket om ondertekende parameters toe te voegen voor de opbouw van een symbolisch co-occurrence netwerk. Voer de opdrachtregel uit:
"adjacency = hulpvaardigheid (datExpr0, macht = softPower)"
Klik op Uitvoeren.
- Pas de TOM-gelijkenisfunctie toe om een topologisch overlappend netwerk te ontwikkelen en het ongelijksoortige netwerk te berekenen. Voer de opdrachtregel uit:
"TOM = TOMsimilarity(hulpvaardigheid);
dissTOM = 1-TOM"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: De ondertekende parameter is toegevoegd om het netwerktype topologieoverlapping in te stellen.
- Gebruik de functie hclust om de hiërarchische clustermethode voor gemiddelde koppelingen voor hiërarchische clustering te selecteren. Voer de opdrachtregel uit:
"geneTree = hclust(as.dist(dissTOM), methode = "gemiddeld");"
Klik op Uitvoeren.
- Gebruik de functie cutreeDynamic om dynamisch vertakkingssnijden uit te voeren en stel de parameter minClusterSize in op 30. Verkrijg het moduleherkenningsresultaat. Voer de opdrachtregel uit:
"dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM, deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE, minClusterSize = minModuleSize);"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: De minimale modulegrootte mag niet kleiner zijn dan 30.
- Bereken de module eigen van elke OTUs module door de moduleEigengenes functie. Voer de opdrachtregel uit:
"MEList = moduleEigengenes(datExpr0, kleuren = dynamicColors)
ME's = MEList$eigengenes"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: De eigen module vertegenwoordigde het totale OTU-expressieniveau in de module. Het was geen specifieke OTU, maar de eerste hoofdcomponent van elk cluster verkregen door de ontleding van de enkelvoudige netwerkwaarde.
- Voer de clusterfunctie uit op basis van de correlatiecoëfficiënt van module eigen. Gebruik de functie mergeCloseModules om de modules samen te voegen met een waarde lager dan 0,25. Voer de opdrachtregel uit:
"samenvoegen = samenvoegenCloseModules(datExpr0, dynamicColors, cutHeight = MEDissThres, verbose = 3)"
Klik op Uitvoeren.
- Gebruik ten slotte de functie plotDendroAndColors voor visualisatie om het moduletoewijzingsweergavediagram van elk co-expressienetwerk te verkrijgen (figuur 2). Gebruik de tabelfunctie om de moduletoekenning uit te pakken die overeenkomt met elke OTin de moduletoewijzingstabel. Voer de opdrachtregel uit:
"plotDendroAndColors(geneTree, mergedColors, "Samengevoegde dynamiek", dendroLabels = FALSE,
hangen = 0,03,addGuide = WAAR, guideHang = 0,05,
main = "ES_Gene dendrogram en modulekleuren")"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: In het moduletoewijzingsdiagram van het co-expressing-netwerk vertegenwoordigen verschillende kleuren verschillende modules en grijs vertegenwoordigt OTA's die niet in een module kunnen worden ingedeeld. Een groter aantal OTA's in de grijze module geeft aan dat de voorverwerkingskwaliteit in een vroeg stadium van de expressiematrix slecht is.
4. Module vergelijking
OPMERKING: Deze methode kan worden gebruikt om de netwerkmodules van twee ecologische microbiële gemeenschappen te vergelijken. Vergelijk in dit artikel de verschillen van microbiële netwerkmodules tussen endosfeer en rhizoplane, endosfeer en rhizosfeer, rhizosfeer en rhizoplane.
- Conserveringstest
- Laad de parameters en resultaten van de twee gegevenssets die in de vorige stappen zijn opgeslagen.
- Stel het toewijzingsresultaat van de netwerkmodule van een groep microbiële gegevens in als referentiegroep, terwijl de andere groep de testgroep is.
- Gebruik de modulePreservatiefunctie om de waarden van conservatieve statistische parameters Z_summary en mediaanrank te berekenen. Voer de opdrachtregel uit:
"system.time({mp=modulePreservation(multiExpr,
multiColor,referentieNetworks=1,
nPermutatie=100, randomSeed=1,quickCor=0,verbose=3)})"
Klik op Uitvoeren.
OPMERKING: Dit resultaat kan de conservatiefheid tussen modules kwantificeren. Z_summary>10 geeft aan dat twee modules sterk bewaard zijn gebleven, terwijl Z_summary<2 niet-geconserveerde modules aanduidt. medianRank drukt het relatieve behoud van de module uit die wordt beoordeeld op rangschikking. Hogere mediaanRank-waarden duiden op niet-verduurzaamde modules. (De belangrijkste opdrachtregels verwijzen naar het supplement S3.)
- Gebruik de plotfunctie om de resultaten te visualiseren (figuur 3). De parameters Z_summary en mediaanrankkregen( Tabel 1 ).
OPMERKING: De netwerkmodules die voldoen aan zowel de Z_summary waarde van minder dan 2 als de mediane rankwaarde aan de top, zijn de meest niet-bewaarde module in de twee ecologische microbiële gemeenschappen.
- Gebaseerd op de resultaten van de bovengenoemde twee statistische parameters om de module te identificeren met de meest niet-geconserveerde module van de twee netwerken.
- Correlatieanalyse van het modulelidmaatschap
- Stel de moduletoewijzingsresultaten van de twee netwerken in als respectievelijk de referentie en de testgroep.
OPMERKING: De instellingen moeten hetzelfde zijn als de preservation-test.
- Gebruik de functie corPvalueStudent om de kME-waarde (modulelidmaatschap) van elke OTU in verschillende kandidaatmodules te extraheren.
Voer de opdrachtregel uit:
"Pvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(als.matrix
(ModuleLidmaatschap), Voorbeelden))"
Klik op Uitvoeren.
LET OP: kME staat voor de mate van modulelidmaatschap. ME staat voor module eigen, wat het totale niveau van OTU-expressie in de module vertegenwoordigt. kME is de correlatiecoëfficiënt tussen elke OTU en de ME. Kwantificeer het belang van OTU in het netwerk door de kME-waarde van OTU. (De belangrijkste opdrachtregels verwijzen naar het supplement S4.)
- Gebruik vervolgens de functie verboseScatterplot om de correlatiecoëfficiënt van de kME-waarde van de overeenkomstige OTU's in de twee netwerken te berekenen en teken het correlatieanalysediagram (figuur 4).
Voer de opdrachtregel uit:
"uitgebreidScatterplot (abs (TModuleMembership
[TmoduleGenes, Tcolumn]),
abs(NModuleLidmaatschap[NmoduleGenes, Ncolumn]),
xlab = plakken("kME in", "ES"),
ylab = plakken("kME in", "RP"),
main = plakken("lightyellow"),
cex.main = 1,7, cex.lab = 1,6, cex,as = 1,6, col = modulekleur)"
Klik op Uitvoeren.
- Selecteer de module met de kleinste correlatiecoëfficiënt van de kME-waarde van de OTU van de twee netwerken. Beschouw deze module als het grootste verschil tussen de twee netwerken.
5. Analyse van de microbiële differentiële netwerkmodule
- Verkrijg gegevens van de dominante bacterie phyla door statistische analyse van de OTU-sequentieset van de module met het grootste verschil.
OPMERKING: De OTU-reeks van de module met het grootste verschil wordt samengevat door de taxonomie van phyla. De dominante bacterie phyla was goed voor meer dan 10%.
- Gebruik vervolgens de functie exportNetworkToCytoscape om het bestand te verkrijgen dat de interactierelatiegegevens van de OTU in de grootste differentiële module bevat.
Voer de opdrachtregel uit:
"cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM,
edgeFile = plakken("NEW-ES_CytoscapeInput-edges-", modules , ".txt", sep=""),
nodeFile = plakken("NEW-ES_CytoscapeInput-nodes-", modules, ".txt", sep=""),
gewogen = WAAR,drempel = 0,5, nodeNamen = modProbes,
altNodeNamen = modGenes, nodeAttr = moduleColors[inModule])"
Klik op Uitvoeren.
- Importeer het bestand in Cytoscape. Stel de drempel in op 0,5 en pas indien nodig andere parameters aan.
- Bouw een co-occurrence netwerk van differentiële micro-organismen (Figuur 5).
- Verkregen de informatie van het kerngeslacht dat de belangrijkste regulerende rol in het netwerk heeft.
OPMERKING: Afhankelijk van de kME-waarde van OUT kan het kerngeslacht worden gedefinieerd.
- Ten slotte werden de functies van het kerngeslacht beoordeeld en werd de invloed ervan op het hele verschilnetwerk geanalyseerd.