Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Exosomen uitgescheiden door mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn gesuggereerd als veelbelovende kandidaten voor kraakbeenletsels en artrosebehandeling. Exosomen voor klinische toepassing vereisen grootschalige productie. Daartoe werden menselijke synoviale vloeistof-MSC's (hSF-MSC's) gekweekt op microcarrierparels en vervolgens gekweekt in een dynamisch driedimensionaal (3D) kweeksysteem. Door gebruik te maken van 3D dynamische cultuur, heeft dit protocol met succes grootschalige exosomen verkregen uit SF-MSC-cultuursupernatanten. Exosomen werden geoogst door ultracentrifugatie en geverifieerd door een transmissie-elektronenmicroscoop, nanodeeltjestransmissietest en western blotting. Ook werd de microbiologische veiligheid van exosomen gedetecteerd. Resultaten van exosoomdetectie suggereren dat deze aanpak een groot aantal good manufacturing practices (GMP)-grade exosomen kan produceren. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artrosebehandeling.
Inleiding
Artrose (OA), als gevolg van gewrichtskraakbeen en onderliggende botafbraak, blijft een ernstige uitdaging die leidt tot invaliditeit 1,2. Zonder bloed- en zenuwtoevoer is het zelfgenezend vermogen van kraakbeen minimaal als het eenmaal gewond isgeraakt 3,4. In de afgelopen decennia hebben therapieën op basis van autologe chondrocytenimplantatie (ACI) enige vooruitgang geboekt bij de behandeling van artrose5. Voor chondrocytenisolatie en -uitbreiding is het oogsten van klein kraakbeen uit het niet-gewichtdragende gebied van het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Een schematisch diagram van exosomen geïsoleerd uit het hSF-MSCs in vitro protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Menselijke SF-MSC's cultuur en identificatie
- Oogst 20 ml SF met behulp van een spuit en naald van klinische artrosepatiënten.
- Desinfecteer het kniegewricht van de artrosepatiënt. Punctie van de quadriceps femoris pees buiten de patella in de gewrichtsholte met een 7 # naald.
- Extraheer 10 ml van de gewrichtsvloeistof. Bedek de prikplaats met de trans....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Flowcytometrie werd gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren, volgens de minimale criteria om menselijke MSC's te definiëren die worden aanbevolen door de International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat SF-MSC's gekweekt in deze studie voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's. Ze waren negatief voor CD34, CD45 en HLA-DR (minder dan 3%) en positief voor CD73, CD90 en CD105 (boven 95%) (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De mesenchymale stamcellen zijn op grote schaal gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun zelfvernieuwing, gedifferentieerd tot weefselcellen met gespecialiseerde functies en paracriene effecten16,17. Met name de paracriene effecten van exosomen hebben veel aandacht getrokken18. Exosomen dragen de bio-informatie van MSC's en vervullen hun biologische functie en overwinnen MSC-tekortkomingen, zoals problematische opslag en verzen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Key Program of Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong Internationaal Samenwerkingsproject (Nr.2021A0505030011); Shenzhen Wetenschaps- en Technologieprojecten (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (Nr.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr.2021A1515010985); Sanming Project van Geneeskunde in Shenzhen (SZSM201612079); Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie G....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Eiwitconcentratie test |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0903 | Bacteriecultuur |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flowcytometrie |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flowcytometrie |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flowcytometrie |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flowcytometrie |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flowcytometrie |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Celcultuur | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosoombepaling |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detectie |
| Flowcytometrie | Beckman | MSC identificatie | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gentransfectie |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Versie 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flowcytometrie |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis cultuur |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC cultuur |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analyse |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analyse | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gentransfectie |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | RNA verwijdering |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Schimmel cultuur |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D cultuur |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosoombepaling |
Referenties
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
