Methodenartikel

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

DOI:

10.3791/62221

⸱

26 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen uitgescheiden door mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn gesuggereerd als veelbelovende kandidaten voor kraakbeenletsels en artrosebehandeling. Exosomen voor klinische toepassing vereisen grootschalige productie. Daartoe werden menselijke synoviale vloeistof-MSC's (hSF-MSC's) gekweekt op microcarrierparels en vervolgens gekweekt in een dynamisch driedimensionaal (3D) kweeksysteem. Door gebruik te maken van 3D dynamische cultuur, heeft dit protocol met succes grootschalige exosomen verkregen uit SF-MSC-cultuursupernatanten. Exosomen werden geoogst door ultracentrifugatie en geverifieerd door een transmissie-elektronenmicroscoop, nanodeeltjestransmissietest en western blotting. Ook werd de microbiologische veiligheid van exosomen gedetecteerd. Resultaten van exosoomdetectie suggereren dat deze aanpak een groot aantal good manufacturing practices (GMP)-grade exosomen kan produceren. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artrosebehandeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artrose (OA), als gevolg van gewrichtskraakbeen en onderliggende botafbraak, blijft een ernstige uitdaging die leidt tot invaliditeit 1,2. Zonder bloed- en zenuwtoevoer is het zelfgenezend vermogen van kraakbeen minimaal als het eenmaal gewond isgeraakt 3,4. In de afgelopen decennia hebben therapieën op basis van autologe chondrocytenimplantatie (ACI) enige vooruitgang geboekt bij de behandeling van artrose5. Voor chondrocytenisolatie en -uitbreiding is het oogsten van klein kraakbeen uit het niet-gewichtdragende gebied van het OA-gewricht noodzakelijk, waardoor verwondingen aan het kraakbeen ontstaan. Ook vereist de procedure een tweede operatie om de uitgebreide chondrocyten te implanteren6. Zo worden eenstapstherapieën voor artrosebehandeling zonder kraakbeenletsels uitgebreid onderzocht.

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn voorgesteld als veelbelovende alternatieven voor behandeling met artrose 7,8. Afkomstig van meerdere weefsels, kunnen MSC's differentiëren in chondrocyten met specifieke stimulatie. Belangrijk is dat MSC's immuunresponsen kunnen moduleren via anti-ontsteking9. Daarom hebben MSC's aanzienlijke voordelen bij de behandeling van artrose door kraakbeendefecten te repareren en de immuunrespons te moduleren, vooral in het ontstekingsmilieu. Voor de behandeling van artrose hebben MSC's uit synoviale vloeistof (SF-MSC's) onlangs veel aandacht getrokken vanwege hun sterkere chondrocytendifferentiatievermogen dan andere MSC-bronnen10,11. Met name in de orthopedische kliniek is de extractie van inflammatoire SF uit de gewrichtsholte een routinetherapie om het pijnsymptoom van OA-patiënten te verlichten. Geëxtraheerde inflammatoire SF wordt meestal weggegooid als medisch afval. Zowel patiënten als artsen zijn klaar om autologe MSC's geïsoleerd uit de inflammatoire SF te beschouwen als OA-behandeling met zeer weinig ethische conflicten. SF-MSC-therapie is echter gecompromitteerd als gevolg van tumorogene risico's, langdurige opslag en verre verzendbarrières.

Exosomen, uitgescheiden door vele celtypen, waaronder MSC's, dragen het grootste deel van de bio-informatie van de moedercel. Het is diepgaand onderzocht als een celvrije therapie12,13. Volgens de bijgewerkte bronnen die beschikbaar zijn op de website van de overheid van klinische studies (ClinicalTrials.gov), worden uitgebreidere exosoom klinische studies geïnitieerd en uitgevoerd op het gebied van kanker, hypertensie en neurodegeneratieve ziekten. SF-MSC exosoombehandeling kan een spannende en uitdagende studie zijn om met artrose om te gaan. Good manufacturing practice (GMP)-grade en grootschalige exosoomproductie zijn essentieel voor klinische vertaling. Kleinschalige exosoomisolatie is op grote schaal uitgevoerd op basis van tweedimensionale (2D) celcultuur. Grootschalige exosoomproductiestrategieën moeten echter worden geoptimaliseerd. In deze studie werd een grootschalige productiemethode voor exosomen ontwikkeld, gebaseerd op massale SF-MSC-cultuur in xenovrije omstandigheden. Na ultracentrifugatie van celkweeksupernatanten werden de veiligheid en functie van exosoom gevalideerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Een schematisch diagram van exosomen geïsoleerd uit het hSF-MSCs in vitro protocol is weergegeven in figuur 1.

1. Menselijke SF-MSC's cultuur en identificatie

  1. Oogst 20 ml SF met behulp van een spuit en naald van klinische artrosepatiënten.
    1. Desinfecteer het kniegewricht van de artrosepatiënt. Punctie van de quadriceps femoris pees buiten de patella in de gewrichtsholte met een 7 # naald.
    2. Extraheer 10 ml van de gewrichtsvloeistof. Bedek de prikplaats met de transfusiestok en druk gedurende 5 minuten aan.
  2. Gooi het SF-supernatant na centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C weg.
  3. Resuspendeer de celpellet met 10 ml 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi de PBS weg.
  4. Resuspendeer de pellet met 10 ml humaan MSC-kweekmedium bij een celdichtheid van 5 x 104 cellen /ml (zie materiaaltabel) en plaats de suspensie vervolgens in een schaal van 100 mm.
  5. Incubeer het gerecht bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.
  6. Verwijder na 48 uur de niet-hechtende cellen door het medium te vervangen en was met 1x PBS. Vervang het medium elke 3 dagen gedurende 2 weken.
  7. Verzamel de celkweek supernatanten.
  8. Identificeer SF-MSC's met behulp van flowcytometrie.
    1. Vergist de derde generatie (P3) SF-MSC's, centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en verzamel de celpellet.
      OPMERKING: Een passage wordt herkend als de subcultuur van de cellen naar een ander kweekgerecht. De primaire cellen geïsoleerd uit SF en gezaaid op gerechten worden gelabeld als passage nul (P0). Bij ongeveer 75% samenvloeiing worden de cellen verteerd en losgemaakt van de gerechten, gezaaid op andere gerechten en geëtiketteerd als P1.
    2. Voeg 400 μL blokkeerbuffer (1% BSA in 1x PBS) toe aan de celpellet (5 x 104) en laat deze 15 minuten staan bij kamertemperatuur (RT).
    3. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 100 μL 1x PBS.
    4. Voeg 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonaal fluorescerend antilichaam (verdunningsverhouding 1:100) (zie Materiaaltabel) per buis toe en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
    5. Was twee keer met 1x PBS en gooi het supernatant weg. Verzamel de celpellet en resuspendeer in 100 μL 1x PBS.
    6. Detecteer op een flowcytometer tot 10.000 cellen met behulp van filters van 525/50 en 585/40 om de fluoroforen te detecteren.

2.3D bioreactor celcultuur

  1. Microcarrier voorbereiding
    1. Zwol de droge 0,75 g microdragers op (zie materiaaltabel) en hydrateer in 1x Dulbecco's Fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (50 ml/g microdragers) gedurende ten minste 3 uur bij RT.
    2. Decanteer het supernatant en was de microdragers gedurende 5 minuten in verse DPBS (50 ml/g microdragers). Gooi de PBS weg en vervang deze door verse 1x DPBS (50 ml/g microdragers).
    3. Steriliseer de microdragers door autoclaveren (121 °C, 15 min, 15 psi). Laat de gesteriliseerde microdragers bezinken, decanteer het supernatant.
    4. Spoel de microdragers kort af in het kweekmedium (50 ml /g microdragers) bij RT. Laat de microdragers bezinken, gooi het supernatant weg.
  2. Perfusie bioreactor
    1. Steriliseer de bioreactor door autoclaveren (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Tel het aantal SF-MSC's en wijs 2,5 x 107 SF-MSC's en microdragers toe aan de bioreactor doordrenkt met GMP-grade MSC kweekmedium (250 ml).
    3. Zet de bioreactor in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C. Draai de bioreactor met een snelheid van 15 rpm. Verander het cultuurmedium elke 6 dagen.
    4. Verzamel de celkweek supernatanten en microdragers voor verdere analyse na kweek gedurende 14 dagen.

3. Exosoomidentificatie en veiligheidsdetectie

  1. Ultracentrifugatie
    1. Centrifugeer het celkweeksupernatant bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant; gooi het cellulaire vuil weg.
    2. Centrifugeer de supernatanten bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant; gooi de grotere blaasjes (apoptotische lichamen en enkele grotere microvesicles) weg.
    3. Centrifugeer het supernatant opnieuw bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om grotere blaasjes te verwijderen; verzamel de pellets en resuspendeer in 40 ml 1x PBS.
    4. Centrifugeer de geresuspendeerde pellets bij 120.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellets die exosomen bevatten in 500 μL van 1x PBS.
  2. Analyse van nanodeeltjes (NTA)
    OPMERKING: Voor elke run werd 500 μL van het monster in de kamer geïnjecteerd met een stroomsnelheid van 30 μL/min. Voer de analyse uit bij 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Verdun de vers geïsoleerde exosoommonsters met steriele 1x PBS tot 1 ml met 107-10 9 / ml deeltjes en injecteer ze in het analysesysteem voor het volgen van nanodeeltjes (zie materiaaltabel).
    2. Stel het opname- en analysesysteem handmatig in volgens het protocol van de fabrikant. Visualiseer de deeltjes door laserlichtverstrooiing en leg hun Brownse beweging vast op digitale video.
    3. Analyseer de opgenomen videobanden met behulp van software (zie Materiaaltabel) op basis van het volgen van ten minste 200 individuele deeltjes per run.
  3. Transmissie-elektronenmicroscopie
    1. Bevestig de exosomen in 4% paraformaldehyde (in koude 1x DPBS) gedurende 5 min.
    2. Monteer 5 μL van de exosomen op koperen roosters. In dit experiment is de concentratie van exosomen 1 mg/ml gekwantificeerd door een eiwittestkit (zie materiaaltabel).
    3. Integreer de exosomen in 3% fosfotungsticzuur gedurende 10 minuten op ijs. Verwijder het overtollige zuur en droog de monsters bij RT.
    4. Beeld de exosoommonsters af met een TEM bij een acceleratiespanning van 100 kV.
  4. Western blotting
    1. Voeg 300 μL lysisbuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) en proteaseremmerscocktail (zie Materiaaltabel) toe aan de exosomen.
    2. Meng de exosomen in de lysisbuffer door op en neer te pipetteren en laat het 20 minuten op ijs staan.
    3. Centrifugeer het mengsel bij 9,391 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit (zie Materiaaltabel).
    4. Voeg 100 μL 4x eiwitlaadbuffer toe en verwarm gedurende 10 min bij 100 °C.
    5. Laad 15 μL eiwitten in een concentratie van 10 mg/ml en laat het uitvoeren door gel-elektroforese (120 V, 70 min) en elektroblotting bij 100 V, 60 min bij 4 °C.
    6. Detecteer de niet-exosoomspecifieke markers (calnexin) en exosomale biomarkers (CD9, CD63 en CD81) door fluorescerende western blotting (zie Materiaaltabel).
  5. Veiligheidstest
    1. Voor de detectie van bacteriën, schimmels en Mycobacterium tuberculosis volgt u de stappen 3.5.2-3.5.5.
    2. Zaai 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een bloedagagplaat (zie materiaaltabel) en incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 24 uur.
    3. Zaad 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een sabouraud agar medium plaat (zie materiaaltabel) en incubeer bij 35 °C gedurende 48 uur.
    4. Zaai 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een Lowenstein-Jensen kweekmediumplaat (zie Materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 weken.
    5. Detecteer het verschijnen van bacteriën, schimmels en Mycobacterium tuberculosis kolonies door macroscopische observatie.
      OPMERKING: Criteria voor het evalueren van de veiligheid van exosomen zijn de afwezigheid van micro-organismen op de kweekplaat.
    6. Volg voor mycoplasmadetectie de stappen 3.5.7-3.5.9.
    7. Resuspensie de exosomen in 50 μL bufferoplossing in de kit en verwarm bij 95 °C gedurende 3 minuten.
    8. Versterk het Mycoplasma in exosoomoplossing met behulp van een PCR Mycoplasma-detectiekit (zie Materiaaltabel).
    9. Detecteer de PCR-producten op 1,5% agarose gel-elektroforese (30 min, 120 V).

4. In vitro exosoom functie detectie

  1. Exosoom labeling
    1. Etiketteer 100 μL exosomen (1 mg/ml) met 1 mM Dil (1000x) (zie Materiaaltabel) en incubeer bij RT gedurende 30 min.
    2. Herstel de exosomen door ultracentrifugatie bij 100.000 x g gedurende 70 minuten. Resuspendeer de pellet in 500 μL van 1x PBS.
  2. Laden van Cy3-miR-140 bootst na in exosomen
    1. Meng 1 μg/μL exosomaal eiwit en 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in een eindvolume van 400 μL elektroporatiebuffer (1,15 mM kaliumfosfaat (pH 7,2), 25 mM kaliumchloride en 21% (v/v) (zie Materiaaltabel).
    2. Breng het mengsel over in koude elektroporatiecuvetten van 0,4 cm en elektroporaat met een capaciteit van 300 V/100 μF met behulp van een gentransfectiesysteem (zie materiaaltabel).
    3. Houd het mengsel onmiddellijk na elektroporatie gedurende 30 minuten op RT om ervoor te zorgen dat het exosoommembraan volledig is hersteld.
    4. Behandel de mengsels met één eenheid RNase A (zie Materiaaltabel) gedurende 20 minuten om de miRNA-nabootsingen buiten de exosomen te elimineren.
    5. Ultracentrifurk het exosoommengsel op 120.000 x g gedurende 90 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de exosomen in 500 μL van 1x PBS.
  3. Exosoom opname assay
    1. Zaai de chondrocyten (1 x 107) in 35 mm confocale gerechten met 1 ml DMEM/F12 met 10% FBS.
    2. Behandel de chondrocyten na 24 uur met DiI-gelabelde exosomen (100 ng/ml) of cy3-miR-140 geladen exosomen (100 ng/ml) gedurende 1 uur.
    3. Was drie keer met 1x PBS en label vervolgens met DAPI (10 ng/ml) gedurende 10 minuten op RT.
    4. Registreer het fluorescentiesignaal in confocale laserscanfluorescentiemicroscopie (CLSM) met behulp van de juiste filters (zie Materiaaltabel).

5. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met behulp van geschikte statistische software.
    OPMERKING: Representatieve gegevens in elk cijfer werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. De Student's t-test werd gebruikt voor de vergelijking van twee groepen met behulp van statistische software. Een one-way ANOVA gevolgd door Tukey's multiple werd uitgevoerd in het geval van vergelijkingen tussen meerdere groepen. P-waarden <0,05 (*), <0,01 (**) of <0,001 (***).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flowcytometrie werd gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren, volgens de minimale criteria om menselijke MSC's te definiëren die worden aanbevolen door de International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat SF-MSC's gekweekt in deze studie voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's. Ze waren negatief voor CD34, CD45 en HLA-DR (minder dan 3%) en positief voor CD73, CD90 en CD105 (boven 95%) (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mesenchymale stamcellen zijn op grote schaal gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun zelfvernieuwing, gedifferentieerd tot weefselcellen met gespecialiseerde functies en paracriene effecten16,17. Met name de paracriene effecten van exosomen hebben veel aandacht getrokken18. Exosomen dragen de bio-informatie van MSC's en vervullen hun biologische functie en overwinnen MSC-tekortkomingen, zoals problematische opslag en verzen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Key Program of Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong Internationaal Samenwerkingsproject (Nr.2021A0505030011); Shenzhen Wetenschaps- en Technologieprojecten (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (Nr.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr.2021A1515010985); Sanming Project van Geneeskunde in Shenzhen (SZSM201612079); Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BCA assay kitThermoFisher23227Eiwitconcentratie test
Blood agar plateNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Bacteriecultuur
CD105 antibodyElabscienceE-AB-F1243CFlowcytometrie
CD34 antibodyElabscienceE-AB-F1143CFlowcytometrie
CD45 antibodyBD Bioscience555483Flowcytometrie
CD63 antibodyAbclonal A5271Western blotting
CD73 antibodyElabscienceE-AB-F1242CFlowcytometrie
CD81 antibodyABclonal A5270Western blotting
CD9 antibodyAbclonal A1703Western blotting
CD90 antibodyElabscienceE-AB-F1167CFlowcytometrie
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5810R
CO2 incubatorThermoCelcultuur
Confocal laser scanning fluorescence microscopyZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Exosoombepaling
EZ-PCR Mycoplasma detection kitBI20-700-20Mycoplasma detectie
FlowcytometrieBeckmanMSC identificatie
Gene Pulser II SystemBio-Rad Laboratories1652660Gentransfectie
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Versie 8.0.2
HLA-DR antibodyElabscienceE-AB-F1111CFlowcytometrie
Lowenstein-Jensen culture mediumNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Mycobacterium tuberculosis cultuur
MesenGroStemRDMGro-500MSC cultuur
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Nanoparticle tracking analyse
NTA 2.3 softwareMalvernData analyse
Odyssey FCGene Company LimitedFluorescent western blotting
OptiPrep electroporation bufferSigmaD3911Gentransfectie
Protease inhibitors cocktailSigmaP8340Proteinase inhibitor
RNase AQiagen158924RNA verwijdering
Sabouraud agar plateNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Schimmel cultuur
TEMJEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)SyntheconRCCS-4HD3D cultuur
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosoombepaling

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Exosomen uit synoviaal vochtmesenchymale stamcellen3D bioreactorkweekisolatie van exosomenmicrocarrier beadsultracentrifugatienanoparticle trackingWestern blottingflowcytometrieexosoommarkers

Gerelateerde artikelen