Wortels en hun rhizosfeer zijn dynamisch, heterogeen en van cruciaal belang om te begrijpen hoe planten minerale voedingsstoffen en verontreinigingen verkrijgen1,2,3. Wortels zijn de primaire route waarmee nutriënten (bijv. fosfor) en verontreinigingen (bijv. arseen) van de bodem naar planten gaan en dus heeft het begrijpen van dit proces implicaties voor de voedselhoeveelheid en -kwaliteit, de werking van het ecosysteem en fytoremediatie. Wortels zijn echter dynamisch in ruimte en tijd die groeien als reactie op behoeften om voedingsstoffen te verkrijgen en ze variëren vaak in functie, diameter en structuur (bijv. zijwortels, onvoorziene wortels, wortelharen)2. Heterogeniteit van wortelsystemen kan worden bestudeerd op ruimtelijke schalen van cellulair tot ecosysteemniveau en op temporele schalen van elk uur tot decadal. De dynamische en heterogene aard van wortels en hun omringende bodem, of rhizosfeer, vormt dus uitdagingen voor het vastleggen van rhizosfeerchemie in de loop van de tijd. Ondanks deze uitdaging is het noodzakelijk om wortels in hun bodemomgeving te bestuderen om deze kritische plant-bodemrelatie te karakteriseren.
De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om te onderzoeken vanwege steile zuurstofgradiënten die bestaan van bulkgrond naar de wortels, die veranderen in ruimte en tijd. Omdat wortels zuurstof nodig hebben om te respire, hebben wetlandplanten zich aangepast aan de zuurstofarme omstandigheden van wetlandgronden door aerenchym4,5te creëren. Aerenchym zijn uitgeholde corticale weefsels die zich uitstrekken van scheuten tot wortels, waardoor de verspreiding van lucht door de plant in de wortels mogelijk is. Een deel van deze lucht lekt echter in de rhizosfeer in minder gesuberiseerde delen van de wortels, met name in de buurt van laterale wortelverbindingen, minder volwassen wortelpunten en rekzones6,7,8,9. Dit radiale zuurstofverlies creëert een geoxideerde zone in de rhizosfeer van wetlandplanten die de rhizosfeer (bio-geo)chemie beïnvloedt en verschilt van de gereduceerde bulkgrond10,11,12. Om het lot en transport van voedingsstoffen en verontreinigingen in wetland rhizospheres en wortels te begrijpen, is het van cruciaal belang om de chemisch gereduceerde bulkgrond, de geoxideerde rhizosfeer en wortels van wetlandplanten te behouden voor analyse. Omdat de bulkgrond echter verminderde bodembestanddelen bevat die zuurstofgevoelig zijn, moeten wortel- en bodemconserveringsmethoden wortelstructuren behouden en zuurstofgevoelige reacties minimaliseren.
Er bestaan methoden om plantenweefsels te fixeren en de ultrastructuur te behouden voor beeldvorming, maar deze methoden kunnen niet worden toegepast om wortels die in wetlandgrond groeien chemisch te behouden. Voor onderzoeken waarbij alleen de elementaire verdeling binnen plantencellen gewenst is, worden planten doorgaans hydroponisch gekweekt en kunnen wortels gemakkelijk uit de oplossing worden verwijderd, worden bevestigd onder hogedrukbevriezing en vriessubstitutie en worden gesectied voor een verscheidenheid aan beeldvormingstoepassingen, waaronder secundaire ionenmassaspectrometrie met hoge resolutie (nanoSIMS), elektronenmicroscopie en synchrotron x-ray fluorescentie (S-XRF) analyse13, 14,15. Om Fe-plaque aan de buitenkant van wetlandwortels te onderzoeken, moeten deze hydrocultuurstudies kunstmatig fe plaquevorming induceren in oplossing16, die niet nauwkeurig de heterogeniteit van de distributie en minerale samenstelling van Fe-plaquevorming en bijbehorende elementen in situ17,18,19,20 weergeeft. Er bestaan methoden om wetlandgrond en bijbehorende micro-organismen te behouden met vriescoring21, maar het is moeilijk om wortels te verkrijgen met deze techniek. De huidige methoden om wortels in de bodem en hun rhizosferische chemie te visualiseren bestaan uit twee primaire meettypen: elementaire fluxen en totale elementaire concentratie (en speciatie). De eerste wordt meestal gemeten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT)22,23,24, waarbij grond in rhizoboxen wordt geplaatst om de plantengroei in een laboratoriumomgeving te ondersteunen en labiele elementen in de grond diffuus door een gel in een bindingslaag. Deze bindingslaag kan vervolgens worden afgebeeld om de labiele elementen van belang te kwantificeren. Deze techniek kan met succes relaties tussen wortels en de rhizosfeer24,25,26,27illustreren , maar artefacten van wortelgebonden kunnen bestaan door planten in rhizoboxen te kweken, en informatie over het wortelinterieur wordt niet vastgelegd met DGT. Dit laatste omvat het bemonsteren van de wortels en de rhizosfeer, het behoud van het monster en het direct analyseren van de elementaire verdeling op een monstersectie. Voor deze milieubemonstering van de wortels van wetlandplanten en hun omringende rhizosfeer is een zorgvuldige monsterbehandeling vereist om artefacten van monstervoorbereiding te voorkomen.
Hier wordt een protocol beschreven dat wortelstructuren en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Flash-freezing kan de transformaties van zuurstofgevoelige oplossingen drastisch vertragen, maar kan wortels beschadigen en mobilisatie veroorzaken wanneer monsters uitdrogen. Slam-freezing waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken die voorgekoeld zijn met vloeibare stikstof, minimaliseert echter wortelschade en monstervervorming28. De geconserveerde monsters worden vervolgens ingebed in een epoxyhars die As speciation20,29 behoudt en kan worden gesneden en gepolijst voor beeldvorming van wortels in hun rhizosfeergrond. De monsters in dit rapport werden geanalyseerd door S-XRF chemische speciatie beeldvorming na dunne doorsnede. Er kunnen echter ook andere beeldvormingstechnieken worden gebruikt, waaronder laserablatie-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS), deeltjesgeïnduceerde röntgenemissie (PIXE), secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) en laser geïnduceerde breakdown spectroscopie (LIBS) beeldvorming.