Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Samenvatting

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 2016¹, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Samenvatting

Oogaandoeningen treffen miljoenen mensen wereldwijd, maar de beperkte beschikbaarheid van menselijke weefsels belemmert hun studie. Muismodellen zijn krachtige hulpmiddelen om de pathofysiologie van oogziekten te begrijpen vanwege hun overeenkomsten met de menselijke anatomie en fysiologie. Veranderingen in het retinale pigmentepitheel (RPE), waaronder veranderingen in morfologie en functie, zijn veel voorkomende kenmerken die door veel oogaandoeningen worden gedeeld. Succesvolle isolatie en cultuur van rpe-cellen van primaire muizen is echter zeer uitdagend. Dit artikel is een bijgewerkte audiovisuele versie van het protocol dat eerder in 2016 door Fernandez-Godino et al. werd gepubliceerd om primaire RPE-cellen van de muis efficiënt te isoleren en te cultiseren. Deze methode is zeer reproduceerbaar en resulteert in robuuste culturen van sterk gepolariseerde en gepigmenteerde RPE monolagen die enkele weken op Transwells kunnen worden gehandhaafd. Dit model opent nieuwe wegen voor de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan oogziekten. Bovendien biedt het een platform om therapeutische benaderingen te testen die kunnen worden gebruikt om belangrijke oogziekten te behandelen met onvervulde medische behoeften, waaronder erfelijke netvliesaandoeningen en maculadegeneraties.

Inleiding

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 2016¹, beschrijft een methode om muis retinale pigmentepitheelcellen (RPE) efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De RPE is een monolaag in het oog tussen het neurale netvlies en het membraan van de Bruch. Deze enkele laag bestaat uit sterk gepolariseerde en gepigmenteerde epitheelcellen die worden verbonden door nauwe verbindingen, met een zeshoekige vorm die lijkt op een honingraat². Ondanks deze schijnbare histologische eenvoud voert de RPE een breed scala aan functies uit die van cruciaal belang zijn voor het netvlies en de normale visuele cyclus^2,3,4. De belangrijkste functies van de RPE monolaag omvatten lichtabsorptie, voeding en vernieuwing van fotoreceptoren, verwijdering van metabole eindproducten, controle van de ionenhomeostase in de subretinale ruimte en onderhoud van de bloed-retinale barrière^2,3. De RPE speelt ook een belangrijke rol in de lokale modulatie van het immuunsysteem in het oog^{5,6,7,8,9,10,11}. Degeneratie en/of disfunctie van de RPE zijn veel voorkomende kenmerken die worden gedeeld door veel oogaandoeningen zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis, albinisme, diabetische retinopathie en maculadegeneratie^12,13,14,15. Helaas is de beschikbaarheid van menselijke weefsels beperkt. Gezien hun zeer geconserveerde genetische homologie met mensen, vertegenwoordigen muismodellen een geschikt en nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van oogaandoeningen^16,17,18,19. Bovendien biedt het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen voordelen zoals genetische manipulatie en medicijntests die de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor deze visiebedreigende^aandoeningenkunnen versnellen 9^,11.

Bestaande methoden die beschikbaar zijn voor rpe-isolatie en -cultuur van muizen missen reproduceerbaar en vatten de RPE-functies in vivo niet met voldoende betrouwbaarheid samen. Cellen hebben de neiging om pigmentatie, zeshoekige vorm en transepitheliale elektrische weerstand (TER) binnen een paar dagen in cultuur^13,20te verliezen . Aangezien het vaststellen van deze primaire RPE-celculturen van muizen een uitdagend proces is, is dit geoptimaliseerde protocol gemaakt op basis van andere protocollen om RPE-cellen te isoleren van ratten en menselijke ogen^{21,22, 23} om de muisogen te ontleden, de RPE te verzamelen en de RPE-cellen van de muis in vitro te culteren.

Protocol

De richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek werden gevolgd.

OPMERKING: Deze methode is succesvol gebleken bij muizen met verschillende genetische achtergronden, waaronder C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, en albino muizen, op verschillende leeftijden. Gebruik bij voorkeur muizen van 8 tot 12 weken oud om RPE-cellen te verkrijgen. RPE-cellen van oudere muizen verspreiden zich minder in cultuur en jongere muizen hebben steeds minder cellen, waardoor het bundelen van ogen van verschillende dieren levensvatbare culturen vereist.

1. Bereiding van reagentia en membraaninzetstukken

1. Bereid de volgende reagentia voor.
   1. HBSS-H− (HBSS zonder calcium, zonder magnesiumbuffer + 10 mM HEPES): Voeg 1 ml 1 M HEPES toe aan 99 ml HBSS- (zonder Ca/Mg) buffer. Bewaren bij 4 °C tot 1 maand.
   2. BEREID HBSS-H+ (HBSS met calcium, met magnesiumbuffer + 10 mM HEPES): Voeg 1 ml 1 M HEPES toe aan 99 ml HBSS+ (met Ca/Mg) buffer. Bewaren bij 4 °C tot 1 maand.
   3. Bereid hyaluronidaseoplossing (1 mg/ml): Voeg 10 mg hyaluronidase toe aan 10 ml HBSS-H− en filtreer het met een steriel spuitfilter van 0,4 μm met een spuit van 10 ml. Bereid vers voor gebruik en laat het op kamertemperatuur (RT; 20-25 °C).
   4. Bereid FBS-oplossing voor: Meng 20% FBS met HBSS-H+. Voeg 2 ml FBS toe aan 8 ml HBSS-H+. Vers bereiden voor gebruik.
   5. Bereid RPE medium: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutamine 1/100 (v/v), penicilline-streptomycine 1/100 (v/v) en niet-essentiële aminozuuroplossing 1/100 (v/v/v) v), hydrocortison (20 μg/L), taurine (250 mg/L) en triiodo-thyronine (0,013 μg/L) in alfa MEM + 5% FBS of zonder FBS^1,23,24. Indien gewenst kan FBS worden geactiveerd; er zijn geen verschillen waargenomen. Bereid je vers voor op RPE-isolatie. Voor celkweekonderhoud, bewaren bij 4 °C tot 1 maand.
   6. Bereid trypsine-EDTA: Bereid kleine aliquots voor eenmalig gebruik (~ 8 ml) verse trypsine-EDTA (0,25%) en vries ze in bij -20 oC. Ontdooi ze bij RT voor elk gebruik. Vermijd vries-dooi cycli.
2. Bereid de membraaninzetstukken voor (bijv. Transwell-inzetstukken).
   1. Equilibreren van de 6,5 mm membraaninzetstukken met RPE-medium gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C, in een incubator met 5% CO 2-beluchte. Gebruik één membraaninzetstuk om RPE-cellen uit twee muisogen te zaaien.
   2. Vervang na incubatie het medium van het onderste compartiment door 700 μL PBS.
   3. Verwijder het medium uit het bovenste compartiment en bekleed het membraaninzetstuk met 100 μL 10 μg/ml muisleamine (in PBS) gedurende ten minste 2 uur bij RT (kortere incubaties kunnen leiden tot een slechte hechting van de cellen aan het inzetstuk).
   4. Coat een extra membraan insert te gebruiken als een blanco voor TER metingen.

2. Dissectie en enucleatie van de muisogen

1. Euthanaseer de muizen door CO_{2-verstikking} door ze in een CO_2-kamer te plaatsen en langzaam CO₂ vrij te geven met een vulsnelheid van 30-70% van het kamervolume per minuut.
2. Plaats de schuine, gekartelde uiteinden van de micro-tang aan elke kant van het muisoog en druk voorzichtig om de oogbol te proptose (enucleatie).
3. Sluit de tang die rond de oogbol is geplaatst. Trek vervolgens voorzichtig terwijl u vooruit en achteruit beweegt om het hele oog met de oogzenuw los te maken van de oogspieren, zodat er geen bindweefsel aan de sclera blijft gehecht.
4. Spoel de enucleated oogbol af in 70% ethanol voordat u ze in één put van een zes-put plaat met 3 ml HBSS-H− op ijs plaatst.
5. Herhaal stap 2.2 tot en met 2.4 om het tweede oog van de muis te verwijderen. Ga binnen 30 minuten verder met de volgende stappen.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om slechts twee ogen tegelijk te verleidenen/ontleden totdat enige ervaring is opgedaan.

3. Verzameling van de RPE

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap. Om uitgebreide incubaties op ijs te voorkomen, wat kan leiden tot RPE-celdood, verzamel niet meer dan twee ogen tegelijk.

1. Gebruik een ontledende stereomicroscoop, Dumont #5 tang en een schuine schaar om al het bindweefsel, bloed en spieren die aan de oogbol blijven zitten zorgvuldig schoon te maken zonder snijwonden in de sclera te maken. Vervang de 3 ml HBSS-H− buffer regelmatig, indien nodig, om het oog fris en schoon te houden en de verontreiniging van de RPE-culturen te voorkomen.
2. Gebruik de oogzenuw als handvat om de oogbol vast te houden en maak een gat in het midden van het hoornvlies met een scherp koolstofstaal #11 mes.
3. Gebruik Dumont #5 schaar om drie incisies in het hoornvlies te maken door het bovengenoemde gat, zodat er voldoende ruimte is om de lens te verwijderen.
4. Houd de oogzenuw vast en oefen lichte druk uit op de ora serrata met de basis van de schuine schaar totdat de lens volledig naar buiten komt. Laat het irisepitheel op zijn plaats om te voorkomen dat het neurale netvlies en RPE tijdens de incubatie losraken. Plaats het oog in de HBSS-H-buffer.
5. Herhaal stap 3.1-3.4 om het tweede oog te ontleden.
6. Incubeer de ogen zonder lenzen in hyaluronidase-oplossing in een 12-put plaat bij 37 °C gedurende 45 minuten in een incubator met 5% CO_2-beluchte(1,5 ml / put) om het neurale netvlies van de RPE los te maken.
7. Plaats elk oog in een nieuwe put en incubeer het gedurende 30 minuten op ijs met 1,5 ml koude HBSS-H + buffer per put om de hyaluronidase-activiteit te stoppen. Verleng de incubatie niet langer dan 45 minuten.
8. Was en plaats elk oog in een kweekschaal van 35 mm met verse HBSS-H+ buffer en snijd het hoornvlies door de oorspronkelijke incisies tot het de ora serrata bereikt met behulp van een Vannas-schaar van 8 cm. Snijd vervolgens onder de ora serrata om het irisepitheel en het hoornvlies te verwijderen.
9. Houd de oogschelprand/ora serrata met gebogen pincet vast en trek met behulp van schuine microforceps het neurale netvlies weg om ervoor te zorgen dat de RPE-laag niet wordt doorgesneden. Snijd vervolgens de interne gehechtheid aan de oogzenuw door. Als sommige RPE-cellen aan het neurale netvlies blijven zitten, verleng dan de incubatietijd, maar niet langer dan 45 minuten in totaal.
10. Snijd de oogzenuw door en breng elke oogschelp over naar een andere 12-putplaat met 1,5 ml verse trypsine-EDTA per put. Zorg ervoor dat de oogschelpen geopend en volledig ondergedompeld blijven in de trypsine. Incubeer de oogschelpen bij 37 °C gedurende 45 minuten in een CO_{2-incubator van} 5%.
11. Verzamel elke oogschelp samen met eventuele RPE-vellen die tijdens de trypsine-incubatie zijn losgemaakt en breng ze over in een 12-putplaat met 1,5 ml FBS-oplossing per put. Als RPE-vellen in de trypsineoplossing blijven zitten, gebruik dan een micropipet om ze met FBS-oplossing naar de put over te brengen.

4. Isolatie van RPE-cellen van primaire muizen

1. Houd elke oogschelp bij de oogzenuw vast en schud deze met de voorkant naar beneden in de 12-putplaat met 1,5 ml 20% FBS in HBSS-H+ totdat de volledige ontkoppeling van de RPE-vellen is bereikt.
2. Verzamel alle RPE-vellen en RPE-clusters met een micropipet en plaats ze in een buis van 15 ml. Vermijd witte stukjes sclera of choroïde, die de culturen kunnen besmetten. Pool twee ogen van dezelfde muis in één buis.
3. Centrifugeer het mengsel op 340 x g gedurende 2 min bij RT en gooi het supernatant weg.
4. Resuspendeer de RPE pellet voorzichtig in 1 ml trypsine-EDTA (0,25%) en incubeer het mengsel gedurende 1 minuut in een waterbad bij 37 °C om de RPE-vellen in afzonderlijke cellen op te splitsen. Na incubatie, voorzichtig pipet op en neer 10x met een micropipet, het vermijden van bellenvorming tijdens pipetten.
5. Voeg 9 ml vers bereid RPE-medium toe om de trypsine te verdunnen en te inactiveren en centrifugeer het mengsel gedurende 2 minuten bij RT op 340 x g.
6. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celkorrel zorgvuldig in 150 μL RPE-medium met 5% FBS met behulp van een micropipet, zodat cellen homogeen worden geresuspendeerd en belvorming tijdens het pipetten wordt vermeden.
7. Neem laminine-gecoate membraaninzet vanaf stap 1.2, verwijder PBS uit de onderste kamer en voeg 700 μL RPE-medium toe.
8. Verwijder de lag uit de bovenste kamer van het membraaninzetstuk en verdeel de RPE-celsuspensie druppelgewijs en gelijkmatig naar het midden van de kamer, waarbij bellenvorming tijdens het pipetten wordt vermeden.
9. Plaats de membraaninzet in een CO_2-incubator van 5% bij 37 °C en laat minstens 24 uur ongestoord staan.
10. Controleer na 24 uur de membraaninzet onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste RPE-cellen aan de insert zijn bevestigd en dat de samenvloeiing ten minste 50% is (figuur 1A). Het is van cruciaal belang om de media niet te veranderen tijdens de eerste 72 uur.

5. Cultuur van gepolariseerde RPE monolagen

1. Houd de geïsoleerde RPE-cellen ten minste 72 uur in cultuur voordat u het RPE-medium ververst om celaanhechting mogelijk te maken. Een celconfluentie van 50% of meer bij het zaaien is fundamenteel voor de vorming van een geschikte gepolariseerde RPE-monolaag.
2. Verander het kweekmedium twee keer per week met vers en voorverwarmd RPE-medium (stap 1.1.5) nadat de cellen zijn bevestigd. Serum kan na de eerste 72 uur uit het kweekmedium worden verwijderd.
   OPMERKING: Na een week in de kweek moeten cellen samenvloeiend, zeshoekig, bi-nucleated, gepigmenteerd en gepolariseerd zijn(figuur 1B),met verwachte celnummers van ongeveer 50.000 cellen per 6,5 mm Transwell insert. Na twee weken in cultuur worden RPE-monolagen met gezonde cellen waargenomen. RPE-culturen vertonen apicale microvilli, basale inplooien en nauwe verbindingen (Figuur 1C).

6. TER-meting

OPMERKING: Voer TER-metingen uit van de RPE-cellen na minimaal 4 dagen in cultuur om een goede integriteit en polarisatie van de RPE-monolaag te garanderen.

1. Reinig de elektroden van de voltohmmeter met 70% ethanol en droog ze zorgvuldig af.
2. Neem de transwells uit de incubator en voer binnen 3 minuten TER-metingen uit om veranderingen als gevolg van temperatuurschommelingen te voorkomen. Om TER te meten, dompelt u de korte elektrode van de voltohmmeter onder in de bovenste kamer en de lange elektrode in de onderste kamer van het membraaninzetstuk. Vermijd contact met de RPE monolayer om celloslating te voorkomen.
3. Om TER te berekenen, trekt u de waarde van de blanco (membraaninzet bedekt met lag zonder cellen) af van het monster. Vermenigvuldig vervolgens de verkregen waarde (in ohm) met het oppervlak van de membraaninzet (0,33 cm² in het geval van 6,5 mm membraaninzetstuk). Het product moet na 72 uur in cultuur ten minste 200 Ω x cm² zijn. TER-waarden moeten na twee weken boven de 400 Ω x cm² meten. Gooi RPE-culturen met lage TER-waarden weg.

Resultaten

Dit protocol is gebruikt om RPE-cellen te isoleren en te gekweekt van genetisch gemodificeerde muizen¹. Er zijn geen verschillen waargenomen tussen muizenstammen of geslacht. De resultaten hebben bijgedragen aan het begrijpen van enkele belangrijke aspecten van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan oogziekten, zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie, de meest voorkomende oorzaak van gezichtsverlies bij ouderen⁹. RPE-cellen die volgens dit protocol werden geïsoleerd, w...

Discussie

Terwijl verscheidene methodes voor muis RPE celisolatie en cultuur vóór^{1, 13,20,22,26, 27}waren ontwikkeld, gebruikte de methode van Fernandez-Godino eerst membraaninzetstukken die de efficiënte groei van de cellen RPE in cultuur voor week^1,9toestaan . Een andere belan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504