Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62269

⸱

4 maart 2021

 ,  ,  , 
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

Samenvatting

Organoïden bieden een veelbelovend platform om ziektemechanismen en behandelingen te bestuderen, direct in de context van menselijk weefsel met de veelzijdigheid en doorvoer van celkweek. Volwassen menselijke retinale organoïden worden gebruikt om potentiële farmaceutische behandelingen te screenen voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte macula teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

We hebben onlangs aangetoond dat MacTel kan worden veroorzaakt door verhoogde niveaus van een atypische lipidesoort, deoxysphingolipiden (deoxySLs). Deze lipiden zijn giftig voor het netvlies en kunnen het verlies van fotoreceptoren veroorzaken dat optreedt bij MacTel-patiënten. Om geneesmiddelen te screenen op hun vermogen om deoxySL-fotoreceptortoxiciteit te voorkomen, genereerden we menselijke retinale organoïden uit een niet-MacTel-geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -lijn en rijpten ze tot een post-mitotische leeftijd waar ze alle neuronale afstammingscellen van het netvlies ontwikkelen, inclusief functioneel volwassen fotoreceptoren. De retinale organoïden werden behandeld met een deoxySL-metaboliet en apoptose werd gemeten in de fotoreceptorlaag met behulp van immunohistochemie. Met behulp van dit toxiciteitsmodel werden farmacologische verbindingen die deoxySL-geïnduceerde fotoreceptordood voorkomen, gescreend. Met behulp van een gerichte kandidaatbenadering hebben we vastgesteld dat fenofibraat, een medicijn dat vaak wordt voorgeschreven voor de behandeling van hoog cholesterol en triglyceriden, ook deoxySL-toxiciteit in de cellen van het netvlies kan voorkomen.

Het toxiciteitsscherm identificeerde met succes een door de FDA goedgekeurd medicijn dat fotoreceptordood kan voorkomen. Dit is een direct bruikbare bevinding vanwege het zeer ziekterelevante model dat is getest. Dit platform kan eenvoudig worden aangepast om een willekeurig aantal metabole stressoren en potentiële farmacologische interventies te testen voor toekomstige behandelingsontdekking bij netvliesaandoeningen.

Inleiding

Het modelleren van menselijke ziekten in celkweek en diermodellen heeft waardevolle hulpmiddelen opgeleverd voor de ontdekking, wijziging en validatie van farmacologische therapieën, waardoor ze van kandidaat-geneesmiddel naar goedgekeurde therapie kunnen gaan. Hoewel een combinatie van in vitro en niet-menselijke in vivo modellen al lang een cruciaal onderdeel is van de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, slagen ze er vaak niet in om de klinische prestaties van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen te voorspellen1. Er is een duidelijke behoefte aan de ontwikkeling van technologieën die de kloof overbruggen tussen simplistische menselijke cellulaire monoculturen en klinische proeven. Recente technologische vooruitgang in zelfgeorganiseerde driedimensionale weefselculturen, organoïden, hebben hun trouw aan de weefsels die ze modelleren verbeterd, waardoor ze veelbelovende hulpmiddelen zijn in de pijplijn voor de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen2.

Een groot voordeel van menselijke celkweek ten opzichte van niet-menselijke in vivo modellen is het vermogen om de specifieke fijne kneepjes van het menselijk metabolisme te repliceren, die aanzienlijk kunnen variëren, zelfs tussen gewervelde dieren van hogere orde zoals mensen en muizen3. Deze specificiteit kan echter worden overschaduwd door een verlies aan weefselcomplexiteit; Dit is het geval voor netvliesweefsel waar meerdere celtypen ingewikkeld met elkaar verweven zijn en een uniek symbiotisch metabolisch samenspel hebben tussen cellulaire subtypen die niet kunnen worden gerepliceerd in een monocultuur4. Menselijke organoïden, die een facsimile van complexe menselijke weefsels bieden met de toegankelijkheid en schaalbaarheid van celkweek, hebben het potentieel om de tekortkomingen van deze ziektemodelleringsplatforms te overwinnen.

Retinale organoïden afgeleid van stamcellen hebben bewezen bijzonder trouw te zijn in het modelleren van het complexe weefsel van het menselijke neurale netvlies5. Dit heeft het retinale organoïde model tot een veelbelovende technologie gemaakt voor de studie en behandeling van netvliesaandoeningen 6,7. Tot op heden heeft veel van de ziektemodellering in retinale organoïden zich gericht op monogene retinale ziekten waarbij retinale organoïden zijn afgeleid van iPSC-lijnen met ziekteverwekkende genetische varianten7. Dit zijn over het algemeen zeer penetrante mutaties die zich manifesteren als ontwikkelingsfenotypen. Er is minder effectief gewerkt aan verouderingsziekten waarbij genetische mutaties en omgevingsstressoren van invloed zijn op weefsel dat zich normaal heeft ontwikkeld. Neurodegeneratieve verouderingsziekten kunnen complexe genetische overerving en bijdragen van omgevingsstressoren hebben die inherent moeilijk te modelleren zijn met behulp van kortdurende celculturen. In veel gevallen kunnen deze complexe ziekten echter samensmelten op gemeenschappelijke cellulaire of metabole stressoren die, wanneer getest op een volledig ontwikkeld menselijk weefsel, krachtige inzichten kunnen bieden in neurodegeneratieve ziekten van veroudering8.

De maculaire degeneratieve ziekte met late aanvang, macula teleangiëctasieën type II (MacTel), is een goed voorbeeld van een genetisch complexe neurodegeneratieve ziekte die samensmelt op een gemeenschappelijk metabolisch defect. MacTel is een zeldzame retinale degeneratieve ziekte van veroudering die resulteert in fotoreceptor en Müller glia verlies in de macula, wat leidt tot een progressief verlies in het centrale zicht 9,10,11,12,13. In MacTel zorgt een onbepaalde, mogelijk multifactoriële, genetische overerving voor een gemeenschappelijke vermindering van circulerende serine bij patiënten, wat resulteert in een toename van een neurotoxische lipidesoort genaamd deoxysfingolipiden (deoxySL)14,15. Om te bewijzen dat accumulatie van deoxySL giftig is voor het netvlies en om potentiële farmaceutische therapieën te valideren, hebben we dit protocol ontwikkeld om fotoreceptortoxiciteit in menselijke retinale organoïden te testen14.

Hier schetsen we een specifiek protocol voor het differentiëren van menselijke retinale organoïden, het vaststellen van een toxiciteits- en reddingstest met behulp van organoïden en het kwantificeren van uitkomsten. We geven een succesvol voorbeeld waarbij we de weefselspecifieke toxiciteit van een vermoedelijk ziekteverwekkend middel, deoxySL, bepalen en het gebruik van een veilig generiek medicijn, fenofibraat, valideren voor de mogelijke behandeling van deoxySL-geïnduceerde retinale toxiciteit. Eerder werk heeft aangetoond dat fenofibraat de afbraak van deoxySL kan verhogen en de circulerende deoxySL bij patiënten kan verlagen, maar de werkzaamheid ervan bij het verminderen van deoxySL-geïnduceerde retinale toxiciteit is niet getest16,17. Hoewel we een specifiek voorbeeld presenteren, kan dit protocol worden gebruikt om het effect van een aantal metabole / omgevingsstressoren en potentiële therapeutische geneesmiddelen op netvliesweefsel te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontdooien, passeren en uitbreiden van iPSC's / SER's

OPMERKING: Gebruik voor alle celkweekstappen best practices om een steriele celcultuur te behouden.

  1. Bedek een 6-well celkweekplaat met keldermembraanmatrixmedium.
    1. Om 1x van dit medium te bereiden, volgt u de productspecificaties of verdunt u 75 μL koudmatrixmedium met 9 ml DMEM/F12. Voeg 1,5 ml vers bereid 1x medium per putje toe in een 6-well plaat. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
    2. Zuig het keldermembraanmatrixmedium af en spoel elk goed af met 3 ml DMEM/F12. Voeg 2 ml DMEM/F12 toe en incubeer bij 37 °C tot gebruik. Gebruik het bord op de dag dat het wordt bereid.
  2. Bereid een 10 mM stockoplossing van gesteenterremmer (Y-27632 dihydrochloride) in PBS en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
  3. Ontdooi een injectieflacon met iPSC's/SER's in DMEM/F12-medium en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g . Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in mTeSR medium. Plaat 1 injectieflacon met cellen op een gecoate 6-well put in mTeSR-media met 10 μM gesteenterremmer (Y-27632 dihydrochloride) en incubeer 's nachts in de incubator. De volgende dag, zuig uit de media en voeg alleen mTeSR toe.
    OPMERKING: Verander elke dag van media totdat deze voorbij is.
  4. Bereid 0,5 mM EDTA in PBS door 500 μL 0,5 M EDTA in 500 ml PBS te verdunnen.
  5. Passagecellen wanneer ze 80-90% confluency bereiken. Splits cellen 1:3 of 1:6 per put, afhankelijk van de groeisnelheid van de cellen.
    1. Om aangehechte cellen van de plaat te verwijderen, zuigt u media af en incubeert u met 0,5 mM EDTA in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de EDTA-oplossing en til de cellen op door met kracht 1 ml mTeSR-medium op cellen uit te werpen met een p1000-pipet.
    2. Blijf mTeSR-medium en -cellen opzuigen en krachtig uitwerpen, tot 5x, om de aangehechte resterende cellen te verwijderen. Plaatcellen op een verse keldermembraan matrix-gecoate 6-well plaat, met mTeSR medium. Blijf dagelijks media vervangen totdat de platen weer 80-100% samenvloeiing bereiken.
  6. Zodra cellen zijn uitgebreid tot een volledige 6-putplaat en 80-100% confluency hebben bereikt, zet je één put opzij om de cellijn uit te breiden voor latere differentiaties of om te bevriezen voor cryopreservatie. Gebruik de resterende vijf putten om het differentiatieproces te beginnen door embryoïde lichamen te maken.

2. Het maken van embryoïde lichamen (EB's)

OPMERKING: EB-vormings- en differentiatiemediarecepten zijn afgeleid van protocollen in Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 en Zhong et al.19.

  1. Bereid 1x Dispase-oplossing en Neurale Inductiemedia (NIM) voor zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid 10 mg/ml 5x stockoplossing van Dispase door het poeder op te lossen in DMEM/F12. Steriel filter met een filter van 0,22 μm. Bewaar 1 ml aliquots bij -20 °C tot gebruik.
    2. Bereid met behulp van de 5x Dispase-oplossing 1 ml / put van 2 mg / ml Dispase in DMEM / F12. Verwarm de oplossing gedurende 30 minuten op 37 °C.
    3. Bereid NIM voor door DMEM/F12 aan te vullen met 1% N2-supplement, 1% MEM NEAA en 2 mg/ml heparine bij 180 E/mg. NIM kan maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.
  2. Bereid en verwarm 16 ml 3:1 mix van mTeSR:NIM (12mL:4mL) oplossing tot kamertemperatuur.
  3. Verwijder gedifferentieerde cellen en voeg warme Dispase-oplossing toe.
    1. Verwijder differentiërende cellen uit de iPSC's/SER-celcultuur. Schraap onder een dissectiescoop ondoorzichtige witte kolonies af met een p10-pipetpunt. Zuig mTeSR medium uit de kweekputten. Hiermee worden de gedifferentieerde klonten verwijderd die zojuist zijn afgeschraapt.
    2. Voeg onmiddellijk de voorverwarmde Dispase-oplossing toe en incubeer bij 37 °C totdat de meeste randen van de celkolonies onder een microscoop beginnen op te krullen. Dit duurt 4-8 minuten.
      OPMERKING: De incubatietijd voor cellen in Dispase moet voor elk laboratorium worden bepaald. De duur kan verschillen tussen cellijnen en een langere incubatie is vereist voor cellen die 3 dagen of langer zijn geplateerd. Langzaam groeiende iPSC's / SER's die meer dan 3 dagen nodig hebben om confluentie te bereiken, zullen zich met grotere kracht aan de plaat gaan hechten, waardoor het moeilijk wordt om de cellen op te tillen. Voor langzaam groeiende cellen, probeer cellen op 1: 2 te passeren voor uitbreiding in een volledige 6-well plaat om de tijd van plating tot confluentie te verkorten.
  4. Zuig de oplossing aan en voeg voorzichtig ten minste 2 ml DMEM/F12-medium per put toe. Voeg DMEM/F12 medium langzaam toe aan de zijkant van de put en zorg ervoor dat de cellen niet losraken.
    1. Aspirateer DMEM/F12 medium voeg vervolgens krachtig vers 1 ml DMEM/F12 direct toe aan de cellen om celkolonies van de plaat op te tillen. Met een p1000 pipet herhaaldelijk DMEM/F12 opzuigen en krachtig uitwerpen in de put, tot 5x, om zoveel mogelijk celkolonies los te maken.
      OPMERKING: Differentiërende/gedifferentieerde iPSC's/SER's kleven meer aan de plaat dan ongedifferentieerde iPSC's/SER's. Cellen die niet loskomen met herhaald pipetteren kun je het beste achterlaten. Overtollig pipetteren doodt cellen en vermindert de efficiëntie van EB-productie. Celklonten hebben tussen de 100-400 cellen per klomp.
  5. Breng drijvende kolonies over naar een conische buis van 15 ml en spoel putten met een extra 1 ml DMEM / F12-medium per put om resterende drijvende kolonies te verzamelen.
  6. Laat de drijvende kolonies niet langer dan 5 minuten bezinken door de zwaartekracht. Eenmaal geregeld, verwijder alles behalve 1-2 ml supernatant. Zorg ervoor dat u de zachte pellet aan de onderkant niet roert.
  7. Resuspensie van de pellet in voorverwarmd 3:1 mTeSR:NIM-medium en breng over in een T75-kolf met ultralaag aanbouwmodel. Incubeer 's nachts om EB's te laten vormen. Dit wordt beschouwd als Dag 0 van differentiatie.
  8. Verander media geleidelijk naar NIM om de differentiatie van EB's in neurale voorlopers te beginnen.
    1. Verwijder de volgende dag media en vervang deze door 10 ml 1:1 mTeSR:NIM medium. Om media uit de vrij zwevende EB-cultuur te verwijderen, kantelt u de kolf omhoog zodat de EB's zich in de onderste hoek van de kolf verzamelen. Zuig het supernatant af en zorg ervoor dat u geen van de EB's in de pellet aan de onderkant opzuigt.
    2. Vervang de volgende dag de media door 10 ml 1:3 mTeSR:NIM medium.
    3. Vervang de volgende dag de media door een volledig NIM-medium. Blijf elke 2 dagen media vervangen met NIM-medium tot 7 dagen na de behandeling met Dispase.

3. Plating van EB's en het initiëren van neurale retinale differentiatie

  1. Een week na de behandeling met Dispase, plaat vrij zwevende EB's op een 6-well plaat bedekt met groeifactor-gereduceerd keldermembraanmatrixmedium. Om de plaat te coaten, raadpleegt u stap 1.1.
    1. Aspiraat gebruikte media van EB's en vervang door 12 ml NIM.
    2. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van EB's in elke put door de EB-bevattende media te roeren om de EB's te resuspenderen, verwijder vervolgens snel 1/6e van de media (2 ml) en doseer in één put. Herhaal dit voor de resterende putjes.
    3. Schud de plaat voor het broeden voorzichtig, heen en weer en dan van links naar rechts, om de EB's gelijkmatig te verdelen. Als de EB's in het midden klonteren, zullen ze niet goed differentiëren.
      OPMERKING: Platingdichtheid is van cruciaal belang voor differentiatie. Zorg ervoor dat je meer dan 30 EB's per put plaatst. Als de productie van EB's niet efficiënt was, verdeel EB's dan in minder putten.
  2. Verander de media dagelijks met NIM medium. Houd het niveau van de media in de putten op ~ 3 ml. Verwijder bij het wisselen van media alle media behalve 1 ml om de vergulde EB's niet uit te drogen en voeg 2 ml media voorzichtig toe aan de zijkant van de put om de cellen niet van de plaat te tillen.
  3. Negen dagen na de plating van EB's, begin met het veranderen van de media van NIM naar Retinal Differentiation Media (RDM) in de loop van twee dagen.
    1. Bereid RDM voor door het volgende te mengen: 48% DMEM/F12 (1:1) en 48% DMEM aangevuld met 2% B27 supplement zonder vitamine A, 1% MEM NEAA en 1% Pen-Strep. Filter steriliseren met behulp van 0,20 μm filter. RDM kan maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.
    2. Schakel de eerste dag over naar een 1:1 mix van NIM:RDM. Wijzig op de tweede dag de media in RDM. Alle volgende dagen, voedingscellen RDM.
      OPMERKING: In de komende weken zullen vergulde EB's neurale retinale voorlopers vormen die zichtbaar gepigmenteerde RPE beginnen te genereren.

4. Het maken van vrij zwevende organoïden en het onderhouden van vrij zwevende organoïde culturen

  1. Gefragmenteerde EB's 28 dagen na de eerste Dispase-behandeling (21 dagen na EB-plating) met behulp van een steriel scalpel om een 1-2 mm2-rooster in vergulde EB's te snijden. Dit zal de retinale voorloperkolonies in kleine stukjes scheiden, zodat ze later in de ontwikkeling niet te groot en necrose worden door onvoldoende uitwisseling van voedingsstoffen in hun centrum.
  2. Vergulde EB's loskoppelen.
    1. Voeg hiervoor eerst 2 ml extra RDM toe aan elke put. Zuig vervolgens ~ 1000 μL media uit de putten met behulp van een p1000-pipet. Werp nu met kracht de media rechtstreeks op vergulde EB's met de punt volledig ondergedompeld.
    2. Herhaal dit totdat alle cellen van de plaat zijn getild. Houd de punt onder water tijdens het uitwerpen van media en duw de pipetzuiger niet voorbij de eerste stop om bellen te voorkomen.
  3. Resuspendeerde ontluikende EB-brokken in een steriele plastic Erlenmeyer van 125 ml en vul de kolf met ~ 40 ml RDM-media. Plaats de kolf op een orbitale schudder die in een standaard incubator is geplaatst. Stel de snelheid van de schudder in op 130-140 RPM (snelheidsinstelling 3).
    OPMERKING: Het kweken van organoïden op een shaker voorkomt dat ze aan elkaar plakken tijdens het kweken bij een hogere concentratie organoïden. Bioreactoren bereiken ook dezelfde doelen, maar een shaker is minder duur.
  4. Voer organoïden met een gedeeltelijke mediaverandering, waarbij ongeveer 12 ml RDM 2-3 keer per week wordt vervangen, afhankelijk van hoe geel de media worden. Vroege organoïden zullen niet veel voeding nodig hebben, maar naarmate ze groeien, zullen ze vaker mediaveranderingen met meer media nodig hebben.
  5. Snoei organoïden om de twee weken om niet-retinale, overwoekerde en stervende organoïden te verwijderen. Dit voorkomt verspilling van media en verbetert de gezondheid van de resterende retinale organoïden.
    1. Breng cellen uit hun kolf over op een 6-puts plaat of schaal van 10 cm met behulp van een pipet van 5 ml. Houd organoïden die gestratificeerd neuro-epitheel vertonen (figuur 1A, sterretje). Deze organoïden zijn transparant en wit.
    2. Sorteer en verwijder slecht gevormde of overwoekerde retinale organoïden en niet-retinale organoïden met een pipet van 5 ml. Deze zullen over het algemeen ondoorzichtig en geelachtig zijn (figuur 1A). Verwijder ook alles wat er niet uitziet als een gelaagd neuro-epitheel. De eerste paar snoeibeurten zullen arbeidsintensief zijn, maar zullen elke volgende keer veel gemakkelijker worden naarmate organoïden groter en homogener worden (figuur 1B).

5. Behoud van volwassen organoïden en differentiëren ze tot een post-mitotisch netvliesweefsel

  1. Op dag 56 (week 8) na de eerste behandeling met Dispase voor EB-vorming (28 dagen na het kweken van losgeraakte EB's in een kolf) verandert u organoïde media in RDM+. Dit zal extra voedingsstoffen leveren aan volledig volwassen organoïden als netvliesweefsel.
    1. Bereid 100 mM taurine in PBS. Bewaar aliquots in -20 °C tot gebruik.
    2. Bereid RDM + voor door RDM aan te vullen met 10% FBS, 100 μM Taurine en 2 mM commercieel glutaminesupplement. Filter steriliseren met behulp van 0,20 μm filter.
    3. Blijf 2-3 keer per week RDM+-media vervangen.
  2. In week 17-18 (post-Dispase behandeling) worden organoïden van de Erlenmeyer overgebracht naar een ultralage 6-putplaat met behulp van een pipet van 5 ml. Blijf de eerste week dagelijks snoeien en scheiden van organoïden totdat organoïden niet meer aan elkaar plakken. Optimale dichtheid is 10-15 organoïden per put. Verander 2-3 keer per week van medium.
    OPMERKING: Verminder het aantal organoïden per put als ze zich vaak aan elkaar hechten of als de media erg geel worden tussen mediaveranderingen.
  3. Verwacht dat organoïden volledig post-mitotisch worden in week 185 wanneer neurale retinale cellen overal aanwezig zijn. Controleer in week 24 op de vorming van rudimentaire buitenste segmenten aan de buitenkant van de organoïde. Zorg er in week 26-28 voor dat de buitenste segmenten aan de buitenkant van de organoïden dik zijn (figuur 1C). Voer toxiciteitstests uit na week 26 wanneer organoïden buitenste segmenten hebben gedefinieerd die een volwassen differentiatietoestand betekenen.
    OPMERKING: Gebruik alleen goed gedifferentieerde retinale organoïden voor toxiciteitstest. Het uitvoeren van toxiciteitstest op organoïden met goed gedefinieerde buitensegmenten zal hun identificatie mogelijk maken.

6. Deoxysphinganine (deoxySA) en medicamenteuze behandeling

OPMERKING: Hier wordt een enkele behandeling van fenofibraat gepresenteerd om deoxySA-toxiciteit te redden gedurende de periode van 4 dagen (figuur 2). Concentratie van deoxySA toegevoegd aan organoïden, duur van deoxySA-behandeling op organoïden en het type geneesmiddel dat wordt gebruikt om toxiciteit14 te redden, kunnen echter worden gewijzigd volgens de experimentele behoeften om toxiciteit en toxiciteitsredding te testen.

  1. Bereid 1 mM stockoplossing van deoxySA in ethanol. Bewaren bij -20 °C gedurende 1 maand. Als alternatief kan een stockoplossing van deoxySA worden bereid in DMSO.
  2. Voer een seriële verdunning van deoxySA uit om een geschikte toxische concentratie van deoxySA te bepalen voor het redden van geneesmiddelen.
    OPMERKING: Bepaal eerst een concentratie deoxySA die zal resulteren in voldoende celdood om een reddingseffect te meten. Als de concentratie te hoog is, zal de toxische reactie resulteren in desintegratie van de organoïde en zal er geen redding worden waargenomen. Als de toxische respons te laag is, zal het moeilijk zijn om een significant reddingseffect waar te nemen. De toxische reactie van deoxySA kan variëren van laboratorium tot laboratorium en batch-tot-batch van deoxySA.
    1. Verdun 1 mM deoxySA stockoplossing tot concentraties van 0,5 μM, 1 μM en 2 μM in elk 3 ml RDM+. Voeg 3 μL ethanol toe aan RDM+ om een controlebehandeling voor te bereiden.
    2. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een steriele sonde om 4 groepen organoïden te selecteren met een minimum van 5 organoïden per groep. Splits de groepen in afzonderlijke putjes van een ultralage opzetplaat met 6 putten. Selecteer organoïden die ongeveer dezelfde grootte en vorm hebben.
    3. Zuig zoveel mogelijk RDM+ van de organoïden af. Voeg aan elke bron van organoïden één concentratie deoxySA toe in RDM+. Voeg voertuigbesturing toe aan de vierde put van organoïden.
    4. Vervang na twee dagen kweken in deoxySA of medium de media door vers bereide overeenkomstige deoxySA-verdunningen in RDM+.
    5. Ga op de vierde dag van de behandeling verder met stap 7 om organoïden te verwerken en te testen op celdood. Zodra een deoxySA-concentratie is geselecteerd, gaat u verder met stap 6.3 om te behandelen met fenofibraat.
      OPMERKING: Doelceldood in de geselecteerde deoxySA-behandelingsgroep is 5 - 20 TUNEL-positieve cellen per 10.000 μm2. De organoïden mogen niet desintegreren door de aanraking van een sonde in de loop van de behandeling.
  3. Behandel organoïden met de geselecteerde toxische dosis deoxySA en fenofibraat.
    1. Bereid een 40 mM stockoplossing van fenofibraat in DMSO. Bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
    2. Bereid de medicamenteuze behandelingsmedia voor: Verdun in 3 ml RDM+ 1 mM deoxySA-stamoplossing tot 1 μM deoxySA en verdun 40 mM fenofibraat-stamoplossing tot 20 μM.
    3. Bereid deoxySA-behandelingsmedia voor: Verdun in 3 ml RDM+ 1 mM deoxySA-stamoplossing tot 1 μM deoxySA en voeg 1,5 μL DMSO toe.
    4. Bereid de controlemedia voor: Voeg in 3 ml RDM+ 3 μL ethanol en 1,5 μL DMSO toe.
    5. Selecteer onder een dissectiemicroscoop met behulp van een steriele sonde drie groepen organoïden met een minimum van vijf organoïden per groep. Splits de groepen in afzonderlijke putjes van een ultralage opzetplaat met 6 putten.
    6. Voeg de voorbereide behandelingen (deoxySA, deoxySA + fenofibraat of controle) toe aan de organoïden. Vervang na twee dagen de media in de putjes met vers bereide RDM+ aangevuld met bijbehorende deoxySA/fenofibraat/controleoplossingen.
    7. Ga op de vierde dag van de behandeling verder met stap 7 om organoïden te verwerken en te testen op celdood (figuur 2).

7. Inbedding en cryosectie van organoïden

  1. Bereid verse 4% PFA door 1 ml 16% PFA-ampul toe te voegen aan 3 ml PBS.
  2. Verwijder RDM+ media uit organoïden en spoel eenmaal af met PBS. Verwijder zoveel mogelijk PBS uit organoïden. Voeg 2 ml vers bereide 4% PFA (in PBS) toe aan de organoïden en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Na 15 minuten incubatie, spoel organoïden tweemaal met 2 ml PBS en was vervolgens gedurende 10 minuten in PBS.
    OPMERKING: Voer fixatie uit in een chemische zuurkast en gooi PFA-oplossing weg en twee daaropvolgende PBS-spoelingen in een correct geëtiketteerde PFA-afvalcontainer die in de zuurkast is opgeslagen.
  4. Zuig alle PBS aan en voeg vervolgens 20% sucrose in PBS toe aan de vaste organoïden. Zorg ervoor dat de organoïden in de sucrose-oplossing worden gemengd en niet in een PBS-bubbel bovenop blijven. Bewaar de organoïden in de sucrose-oplossing totdat ze naar de bodem van de sucrose-oplossing zinken, d.w.z. ~ 1 uur bij kamertemperatuur. Vaste organoïden kunnen 's nachts in sucrose-oplossing bij 4 °C worden bewaard.
  5. Sluit de organoïden in OCT-oplossing in een cryosectiemal in. Meerdere organoïden per aandoening kunnen in één mal worden ingebed. Oriënteer de organoïden en zorg ervoor dat hun beste retinale gebieden worden doorsneden op de cryostaat en dat het midden van de organoïden zich allemaal ongeveer in hetzelfde vlak bevindt. Vries de ingebedde organoïden in bij -20 °C. Ingebedde organoïden kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.
    OPMERKING: Organoïden zijn moeilijk te zien in bevroren LGO; richt RPE-clusters op de zijkant van de mal die naar het blad is gericht om organoïde identificatie te vergemakkelijken.
  6. Cryosectie organoïden in 10-14 μm dikke secties en hechten secties aan poly-L lysine behandelde dia's. Controleer tijdens het cryosectioneren herhaaldelijk de dia's onder een microscoop om secties te identificeren die het midden van de organoïden bevatten. Verzamel alleen de middelste plakjes van de organoïden waar alle lagen gelijkmatig zijn weergegeven (figuur 2A-C, figuur 3). Eenmaal doorsneden, kunnen dia's jarenlang in een schuifdoos bij -80 °C worden bewaard.
    OPMERKING: Plakjes die aan de uiteinden van de organoïde worden genomen, zullen de buitenste fotoreceptoren overbemonsteren en zijn niet geschikt voor kwantificering. Organoïden van gemiddelde grootte leveren 10-15 plakjes van het midden van de organoïde die een doorsnede van de gelaagde retinale lagen vertegenwoordigt.

8. TUNEL-kleuring voor apoptotische cellen

  1. Ontdooi bevroren dia's gedurende 30 minuten bij 37 °C. Het onmiddellijk plaatsen van dia's op 37 °C voorkomt condensatie. Weefselmonsters gedrenkt in zuiver water kunnen het weefsel vervormen. Een incubatie van 37 °C verbetert ook de hechting van weefsel aan de glasplaat.
  2. Maak een doorlopende rand op de glasplaat rond de weefselsecties met behulp van een hydrofobe pen. Dit zorgt voor een grens en zorgt voor voldoende fixatie en antilichaamincubaties met een klein volume aan oplossingen. Voeg ongeveer 100-200 μL toe (het volume vult het hydrofobe gebied zonder over te lopen) vers bereide 4% PFA gedurende 20 minuten. Voer fixatie uit in een chemische zuurkast en gooi de PFA-oplossing weg in de correct geëtiketteerde PFA-afvalcontainer die in de zuurkast is opgeslagen.
  3. Spoel de dia's eenmaal af in PBS en was ze vervolgens gedurende 25 minuten in PBS op kamertemperatuur.
  4. Bereid het TUNEL-mengsel. Ontdooi zowel violette als blauwe injectieflacons uit de in situ celdooddetectiekit. Verwijder 100 μL violette injectieflaconoplossing (kan worden gebruikt voor een negatieve controle) en combineer de resterende 450 μL oplossing uit de violette injectieflacon met 50 μL oplossing uit de blauwe injectieflacon. Meng goed en houd in het donker. Elke set injectieflacons (500 μL totaal) kan 5-10 glaasjes vlekken.
  5. Permeabiliseer weefselplakken.
    1. Permeabilisatieoplossing voorbereiden: PBS met 0,1% TritonX-100 en 0,1% natriumcitraat
    2. Verwijder PBS van voorbeelddia's en voeg vervolgens Permeabilization Solution toe aan monsters. Incubeer gedurende 2 minuten op ijsblok of bij 4 °C. Daarna eenmaal spoelen in PBS en vervolgens wassen in PBS gedurende 10 minuten.
  6. Verwijder PBS en droog zoveel mogelijk oplossing weg met behulp van de hoek van een gevouwen weefsel. Voeg 50-100 μL bereid TUNEL-mengsel toe aan de monsters, afhankelijk van de grootte van het gebied dat door de hydrofobe pen wordt getrokken. Dek af met glazen afdekplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur in het donker.
    OPMERKING: Alle incubaties en wasbeurten voor de volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd om bleken van fluoroforen te voorkomen. Gebruik een donkere doos of bedek de dia's met aluminiumfolie om licht te blokkeren.
  7. Label de fotoreceptoren. Spoel eenmaal met PBS en was vervolgens gedurende 20 minuten in PBS. Verwijder PBS en voeg vervolgens primair Recoverin-antilichaam (konijn anti-Recoverin) verdund 1:500 in PBS toe met 0,1% Tween en 5% ezelsserum. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
  8. Na het verwijderen van het primaire antilichaam, eenmaal spoelen in PBS en vervolgens wassen in PBS gedurende 20 minuten. Voeg secundair antilichaam toe, ezel anti-konijn met een oranje of rode fluorofoor, verdund 1:1.000 in PBS met 0,1% Tween en 5% ezelsserum en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Spoel eenmaal met PBS en was vervolgens gedurende 20 minuten in PBS. Voeg DAPI toe op 1:1000 in PBS, incubeer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  9. Spoel eenmaal met PBS en was vervolgens gedurende 20 minuten in PBS. Verwijder PBS en voeg het montagemedium toe. Voeg afdekslip toe, sluit af met nagellak en laat in het donker drogen. Dia's kunnen maximaal 1 week bij 4 °C in een donkere container worden bewaard.
    OPMERKING: Voor de beste beeldkwaliteit maak je de volgende dag foto's.

9. Het in beeld brengen van organoïde plakjes en het kwantificeren van de dood.

OPMERKING: Beeldvorming vereist een confocale microscoop met mogelijkheden om onderscheid te maken tussen drie fluorofoorkanalen. Dit experiment maakt gebruik van groene (Alexa Fluor 488), oranje (Alexa Fluor 555) en UV (DAPI) kanalen. Elke combinatie van fluoroforen kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat emissies niet in de andere kanalen terechtkomen.

  1. Zoek retinale secties voor beeldvorming en kwantificering. Gebruik onder een lage vergroting van de microscoop (5x of 10x) Recoverin-kleuring, die het cytoplasma van fotoreceptoren labelt, en DAPI-kleuring, die de kernen van alle cellen labelt, om een gebied van de gesneden organoïde te lokaliseren dat intact, goed gevormd en in een vlak is dat een representatieve doorsnede van de organoïde bemonstert (figuur 2 en figuur 3 ). Zoek een sectie met een duidelijke buitenste nucleaire laag van fotoreceptoren die ten minste een paar cellen dik is, en een afzonderlijke en afzonderlijke laag kernen die geen Recoverin-kleuring hebben (figuur 2 en figuur 3).
  2. Kader de afbeelding in. Verhoog de vergroting van de microscoop tot een objectief van 20x en kader de dia in om het beeld te vullen met zoveel mogelijk van de fotoreceptorlaag (figuur 3).
  3. Stel het Z-vlak in. Als u een microscoop gebruikt die Z-stacks weergeeft, stelt u de boven- en ondergrenzen van het Z-bereik in om de volledige diepte van het segment weer te geven. Gebruik dezelfde Z-stackdikte voor alle afbeeldingen in een experimentele set, zodat dezelfde hoeveelheid weefsel in alle monsters wordt getest. Als u geen microscoop gebruikt die Z-stacks weergeeft, stelt u de afbeelding scherp op het midden van het segment.
  4. Beeld alle drie de kanalen van fluoroforen in een Z-stack acquisitie. Alle drie de kanalen zijn nodig om een stervende cel positief te identificeren. Afbeelding één gebied per organoïde.
  5. Sla de afbeeldingsset op in een bestandsindeling die de verhouding van het gebied per pixel behoudt.

10. Kwantificeren van stervende cellen

  1. Open afbeeldingsstapels in FIJI (Image J) software. Controleer in het venster Importopties voor bio-indelingen of er geen vakjes onder de sectie 'opsplitsen in afzonderlijke vensters' zijn geselecteerd. Schuiven tussen uitgelijnde afbeeldingskanalen is van cruciaal belang voor het correct identificeren van cellen.
  2. Vlak de Z-stack-afbeeldingsset af door op Afbeelding > Stapels te klikken en selecteer vervolgens 'Z-project' in het vervolgkeuzemenu. Dit creëert een nieuw beeld voor kwantificering. Als de organoïden niet in de Z-serie zijn afgebeeld, slaat u deze stap over.
  3. Selecteer het afbeeldingskanaal met Recoverin-kleuring (rood, in dit voorbeeld). Klik op het gereedschap voor het selecteren van veelhoeken in de werkbalk en schets een continu gebied van fotoreceptoren in de afbeelding (figuur 3A). Klik op analyseren > metingen instellen. Schakel in het pop-upvenster Metingen instellen het selectievakje naast Gebied in, klik op Analyseren en selecteer Meten om het gebied te meten (of druk op "m" als snelkoppeling) van fotoreceptoren om stervende cellen te tellen. De oppervlaktemeting wordt weergegeven in een pop-upmetingsvenster.
  4. Tel de TUNEL-positieve kernen in het eerder geselecteerde fotoreceptorgebied (figuur 3B,C). Klik met de rechtermuisknop op het puntgereedschap in de werkbalk en selecteer meerpuntsgereedschap. Klik alleen in het TUNEL-kanaal op TUNEL-positieve kleuring die overlapt met een DAPI-positieve kernen en Recoverin-kleuring. Schakel tussen de kanalen om positieve cellen te valideren.
  5. Deel het aantal TUNEL-positieve cellen door het gebied om een genormaliseerde waarde te krijgen voor de celdood in fotoreceptoren per organoïde (figuur 2D,E).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Retinale organoïden werden gegenereerd uit een niet-MacTel-controle-iPSC-lijn. Nadat organoïden 26 weken in cultuur waren geweest, werden ze geselecteerd en opgesplitst in experimentele groepen. Organoïden werden behandeld met verschillende concentraties deoxySA om te bepalen of deoxySA giftig is voor fotoreceptoren. Vier concentraties deoxySA werden getest, van 0 tot 1 μM (figuur 2) en organoïden werden gedurende 8 dagen behandeld, met mediaveranderingen om de andere dag. Celdood als reacti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Differentiatieprotocolvariaties
Sinds de uitvinding van zelfvormende optische cups door Yoshiki Sasai's groep20, hebben veel laboratoria protocollen ontwikkeld om retinale organoïden te genereren die kunnen variëren bij bijna elke stap 5,18,19,21. Een uitputtende lijst van protocollen is te vinden in Capowski et al.22. Het diff...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Ondersteund door het Lowy Medical Research Institute. We willen de familie Lowy bedanken voor hun steun aan het MacTel-project. We willen Mari Gantner, Mike Dorrell en Lea Scheppke bedanken voor hun intellectuele inbreng en hulp bij het voorbereiden van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5M EDTAInvitrogen15575020
125mL Erlenmeyer KolbenVWR89095-258
1-deoxysphinganineAvanti860493
B27 Supplement, minus vitamin AGibco12587010
Beaver 6900 Mini-BladeBeaver-VisitecBEAVER6900
D-(+)-SucroseVWR97061-432
DAPIThermo-fisherD1306
Dispase II, poederGibco17105041
DMEM, hoge glucose, pyruvateGibco11995073
DMEM/F12Gibco11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555Thermo-fisherA32794
donkey serumSigmaD9663-10ML
FBS, Heat InactivatedCorning45001-108
FenofibrateSigmaF6020
GlutamaxGibco35050061
HeparineStemcell Technologies7980
In Situ Cell Death Detection Kit, FluorescinSigma11684795910
Matrigel, growth factor reducedCorning356230
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
mTeSR 1Stemcell Technologies85850
N2 SupplementGibco17502048
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Pierce 16% FormaldehydeThermo-fisher28906
Rabbit anti-Recoverin antibodyMilliporeAB5585
Sodium CitrateSigmaW302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter UnitsMilliporeSigmaSE1M179M6
TaurineSigmaT0625
Tissue Plus- O.C.T. compoundFisher Scientific23-730-571
Tissue-Tek CryomoldEMS62534-10
Triton X-100SigmaX100
Tween-20SigmaP1379
Ultra-Low Attachment 6 well PlatesCorning29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-FlaskCorning3814
Vacuum Filtration SystemVWR10040-436
Vectashield-mounting mediumvector LabsH-1000
wax pen-ImmEdgevector LabsH-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)SigmaY0503

Referenties

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047(2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766(2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Maculaire telangiectasiadeoxysfingolipide toxiciteitfotoreceptordoodimmunohistochemiege nduceerde pluripotente stamcellenlipidemetabolismefenofibraatbehandeling
Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.