Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Samenvatting

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Samenvatting

In vitro driedimensionale (3D) celkweekmodellen, zoals organoïden en sferoïden, zijn waardevolle hulpmiddelen voor vele toepassingen, waaronder ontwikkelings- en ziektemodellering, medicijnontdekking en regeneratieve geneeskunde. Om deze modellen volledig te benutten, is het cruciaal om ze op cellulair en subcellulair niveau te bestuderen. Het karakteriseren van dergelijke in vitro 3D-celkweekmodellen kan echter technisch uitdagend zijn en vereist specifieke expertise om effectieve analyses uit te voeren. Hier biedt dit artikel gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste in vitro 3D-celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters. Deze protocollen zijn van toepassing op een breed scala aan organoïden en sferoïden die verschillen in hun cel-van-oorsprong, morfologie en kweekomstandigheden. Van het oogsten van 3D-structuren tot beeldanalyse, deze protocollen kunnen binnen 4-5 dagen worden voltooid. In het kort worden 3D-structuren verzameld, gefixeerd en vervolgens verwerkt door paraffine-inbedding en histologische / immunohistochemische kleuring, of direct immunoactief gelabeld en voorbereid voor optische clearing en 3D-reconstructie (200 μm diepte) door confocale microscopie.

Inleiding

In de afgelopen decennia hebben de ontwikkelingen in stamcelbiologie en in vitro 3D-cultuurtechnologieën een revolutie in de biologie en geneeskunde ingeluid. Celmodellen met een hogere complexiteit in 3D zijn erg populair geworden omdat ze cellen in staat stellen te groeien en te interageren met een omringend extracellulair raamwerk, waarbij aspecten van levende weefsels, waaronder hun architectuur, celorganisatie en interacties, of zelfs diffusiekenmerken, nauw worden samengevat. Als zodanig kunnen 3D-celkweekmodellen unieke inzichten bieden in het gedrag van cellen in zich ontwikkelende of zieke weefsels in vitro. Organoïden en sferoïden zijn beide meercellige 3D-structuren, variërend van enkele micrometers tot millimeters, en zijn de meest prominente in vitro 3D-structuren. Beide kunnen worden gekweekt in een ondersteunende steiger, waaronder (i) hydrogels afgeleid van dieren (keldermembraanextract, collageen), planten (alginaat / agarose), of gesynthetiseerd uit chemicaliën, of (ii) inerte matrices die poriën bevatten om celproliferatie en groei te bevorderen.

Organoïden en sferoïden kunnen zich ook ontwikkelen zonder de aanwezigheid van een ondersteunende steiger door te vertrouwen op cellen om zichzelf in clusters te assembleren. Dit is afhankelijk van verschillende technieken, zoals het gebruik van niet-klevende materialen om celaanhechting, oppervlaktespanning en zwaartekracht te remmen (bijv. hangende valtechnieken), of constante cirkelvormige rotatie van bloedvaten (bijv. Spinnercultuur). In alle gevallen vergemakkelijken deze technieken cel-cel- en celmatrixinteracties om de beperkingen van de traditionele monolaagcelcultuur te overwinnen¹. De termen "organoïden" en "sferoïden" zijn in het verleden door elkaar gebruikt, maar er zijn belangrijke verschillen tussen deze twee 3D-celkweekmodellen. Organoïden zijn in vitro 3D cellulaire clusters afgeleid van pluripotente stamcellen of weefselspecifieke stamcellen, waarin cellen zich spontaan organiseren in voorlopers en gedifferentieerde celtypen en die ten minste enkele functies van het orgaan van belang samenvatten². Sferoïden omvatten een breder scala aan meercellige 3D-structuren gevormd onder niet-adherente omstandigheden en kunnen ontstaan uit een grote diversiteit aan celtypen zoals onsterfelijke cellijnen of primaire cellen³. Vandaar dat organoïden, inherent aan hun intrinsieke stamceloorsprong, een hogere neiging hebben tot zelfassemblage, levensvatbaarheid en stabiliteit dan sferoïden.

Niettemin zijn deze twee modellen in wezen 3D-structuren die zijn samengesteld uit meerdere cellen, en de technieken die zijn ontwikkeld om ze te bestuderen lijken dus erg op elkaar. Krachtige beeldvormingsbenaderingen op het resolutieniveau van één cel zijn bijvoorbeeld nodig voor het onderzoeken van de cellulaire complexiteit van zowel organoïden als sferoïden. Hier, door de expertise van deze groep en die van leiders op het gebied van organoïden⁴ samen te vatten, beschrijft dit artikel gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van tweedimensionale (2D) en 3D whole-mount kleuring, beeldvorming en analyses van de cellulaire en subcellulaire samenstelling en ruimtelijke organisatie van organoïden en sferoïden variërend van 100 μm tot enkele millimeters. Inderdaad, deze procedure presenteert twee verschillende en complementaire soorten kleuring en beeldvormingsacquisitie om een grote verscheidenheid aan maten en soorten in vitro 3D-celkweekmodellen te analyseren. Het gebruik van de ene (3D whole-mount analyse) of de andere (2D sectie analyse) zal afhangen van het bestudeerde model en de gezochte antwoorden. 3D-analyse met volledige mount door confocale microscopie kan bijvoorbeeld worden toegepast om cellen in 3D-cultuur tot 200 μm diep te visualiseren, ongeacht de totale grootte van de 3D-structuur, terwijl de analyse van 2D-secties inzicht biedt in monsters van elke grootte, zij het op 2D-niveau. Deze procedure is met succes toegepast op een verscheidenheid aan organoïden ^4,5 en sferoïden afgeleid van menselijke en muizencellen, afkomstig uit verschillende embryonale kiemlagen. Het overzicht van de procedure is weergegeven in figuur 1. De belangrijkste fasen, de relaties tussen hen, beslissende stappen en de verwachte timing worden aangegeven.

Figuur 1: Schematisch overzicht van de procedure. In vitro 3D-celkweekmodellen worden verzameld en gefixeerd en vervolgens voorbereid voor 3D-kleuring van de hele montage (optie a) of ingebed in paraffine voor 2D-sectie en kleuring (optie b). Voor 3D-kleuringsexperimenten met hele mounts worden vaste 3D-structuren immuungelabeld na de fixatiestap. Een optionele optische clearingstap kan worden uitgevoerd om de beeldkwaliteit en de diepte van optische microscopie te verbeteren door lichtverstrooiing tijdens beeldverwerking te verminderen. Beelden worden vastgelegd op een omgekeerde confocale microscoop of een confocaal high content systeem en geanalyseerd met behulp van de juiste software. Voor paraffine-inbedding worden 3D-structuren direct verwerkt (optie b.1 voor grote structuren ≥ 400 μm) of opgenomen in een gel (b.2; kleine structuren ≤ 400 μm) voor dehydratie en paraffine-inbedding. Paraffineblokken worden vervolgens gesneden en gekleurd (histologische of immunochemische kleuring). Beelden van 2D-secties worden verkregen op een digitale diascanner of een rechtopstaande microscoop en geanalyseerd op een beeldanalyseplatform met behulp van snelle digitale kwantitatieve analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Een verlies van ≤25% van het oorspronkelijke aantal 3D-structuren moet worden verwacht tijdens de stappen met reagenswisselingen en wassen in de volgende procedure. Plan om een laatste aantal van ten minste tien 3D-structuren te gebruiken, met een grootte variërend van 100 tot 500 μm, per geteste toestand om kwalitatieve en kwantitatieve beeldanalyses uit te voeren. Snijd indien nodig voor grotere structuren de uiteinden van 1 ml pipetpunten om te voorkomen dat de structuren breken. Voor alle stappen geldt dat als de sedimentatie van de 3D-structuur te lang is, cellen voorzichtig worden gesponnen met 50 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Afhankelijk van het onderzochte probleem moeten de voor- en nadelen van een dergelijke draaiende stap worden overwogen, omdat centrifugatie de vorm van de 3D-structuren in gevaar kan brengen. Vermijd draaien bij >100 × g.

1. Verzameling en fixatie van 3D-celkweekmodellen

OPMERKING: Pas op dat u de 3D-structuren, die alleen losjes aan de buiswand worden bevestigd, niet aspirateert.

1. Oogsten van 3D-celkweekmodellen ingebed in een matrix
   OPMERKING: Deze sectie beschrijft het herstel van 3D-structuren gekweekt in druppels van een keldermembraanextract uit murine Engelbreth-Holm-Swarm-sarcoom (BME), maar kan worden aangepast aan andere matrices. Zie de discussie voor cruciale punten met betrekking tot ECM.
   1. Verwijder het kweekmedium uit de putten zonder de 3D-matrix te verstoren. Verf de binnen- en buitenkant van een pipetpunt van 1 ml vooraf met eiwit (hierna voorgecoate tip van 1 ml genoemd) door de volledige lengte van de tip in 0,1% runderserumalbumine (BSA) te dopen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (hierna PBS-BSA 0,1% oplossing genoemd) en 1 ml van deze oplossing tweemaal op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Deze precoating voorkomt dat de cellen aan de punt blijven plakken en minimaliseert verlies.
   2. Bekleed de binnenkant van een centrifugebuis (15 ml) met eiwit (hierna voorgecoate centrifugebuis genoemd) door herhaaldelijk te vullen met PBS-BSA 0,1% oplossing en de buis te legen.
      OPMERKING: Dit voorkomt dat de cellen aan de buis blijven plakken en minimaliseert verlies.
   3. Gebruik de voorgecoate tip van 1 ml zorgvuldig de 3D-structuren van de put met behulp van 1 ml ijskoude 1x PBS en breng de suspensie met de 3D-structuren voorzichtig over naar de voorgecoate centrifugebuis.
   4. Voeg voorzichtig 13 ml ijskoude 1x PBS toe en laat de 3D-structuren minstens 10 minuten op ijs bezinken.
      OPMERKING: Draai indien nodig gedurende 5 minuten bij 50 × g bij 4 °C. Vermijd het draaien van >100 × g, omdat dit de vorm van de 3D-structuren in gevaar brengt.
   5. Verwijder het supernatant. Gebruik een voorgecoate tip van 1 ml om de 3D-structuren voorzichtig te resuspenseren in 1 ml ijskoude 1x PBS. Herhaal stap 1.1.4 tot en met 1.1.5 om een homogene pellet te verkrijgen zonder 3D-matrixresidu.
      OPMERKING: Efficiënte matrixverwijdering wordt beïnvloed door het type matrix, het aantal en de grootte van 3D-structuren en vereist optimalisatie voor verschillende cultuuromstandigheden. Voor 3D-structuren die in BME zijn gekweekt, duurt het herstel van de matrixverwijdering meestal 45-60 minuten.
   6. Breng met behulp van een voorgecoate tip van 1 ml de 1 ml 1x PBS-suspensie met de 3D-structuren over naar een voorgecoate centrifugebuis van 1,5 ml en ga verder met sectie 1.3.
2. Oogsten van drijvende 3D-celkweekmodellen
   1. Gebruik een voorgecoate tip van 1 ml om de 3D-structuren zorgvuldig te verzamelen en over te brengen naar een voorgecoate centrifugebuis van 1,5 ml. Laat de 3D-structuren bezinken of draai gedurende 5 minuten op 50 × g bij RT.
   2. Verwijder het supernatant. Gebruik een voorgecoate tip van 1 ml om de 3D-structuren te resuspenderen in 1 ml 1x PBS. Ga verder met paragraaf 1.3.
3. Fixatie van 3D-celkweekmodellen
   1. Laat de 3D-structuren bezinken. Verwijder het supernatant voorzichtig; onder een zuurkast, resuspenseer de 3D-structuren voorzichtig in 1 ml formaline met behulp van een voorgecoate punt van 1 ml.
      OPMERKING: Formaline bevat formaldehyde, wat gevaarlijk is. Manipuleer de chemische stof in een chemische kap. Draag rubberen handschoenen en een veiligheidsbril.
   2. Incubeer de 3D-structuren gedurende 30 minuten bij RT.
      OPMERKING: Een fixatiestap van 30 minuten met formaline is vereist voor immunostaining van een breed scala aan 3D-structuren (variërend in grootte, vorm en oorsprong). Over het algemeen zijn langere fixatietijden (>3 uur) echter beter geschikt om de fluorescentie van reportereiwitten te behouden.
   3. Laat de 3D-structuren bezinken, of draai gedurende 5 minuten op 50 × g bij RT. Verwijder voorzichtig het formaline en vervang het door 1 ml 1x PBS. Herhaal deze wasstap in 1x PBS twee keer. Bewaar de monsters bij 4 °C en ga verder met rubriek 2 of rubriek 3.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de cellen kunnen op 4 °C worden gehouden voor langdurige opslag (>1 jaar).

2.3D hele mount kleuring, beeldvorming en analyse van 3D-celkweekmodellen

OPMERKING: Omdat de organoïden losjes aan de buiswand zijn bevestigd, moet u ze voorzichtig hanteren, omdat alle volgende reagensveranderingen monsterverlies kunnen veroorzaken. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat de juiste controles voor vlekken beschikbaar zijn. Positieve en negatieve controles kunnen cellen zijn, waarvan bekend is dat het eiwit van belang respectievelijk overexpressie of afwezig is. Incubeer monsters zonder het primaire antilichaam om te bepalen of het waargenomen signaal te wijten is aan niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam. Omdat sommige cellen de neiging hebben om hoge niveaus van autofluorescentie te vertonen, gebruikt u controles zonder secundaire antilichamen om te bepalen of de waargenomen fluorescentie afkomstig is van autofluorescentie op de achtergrond. Immunolabeling en fluorescerende reportervisualisatie kunnen worden gecombineerd.

1. 3D hele mount vlekken
   1. Bereid de permeabilisatie-blokkerende (PB) oplossing door 1x PBS aan te vullen met 0,1% -1% van een niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen), 1% dimethylsulfoxide, 1% BSA en 1% ezelserum (of van het dier waarin de secundaire antilichamen zijn grootgebracht).
      OPMERKING: Optimaliseer zorgvuldig de concentratie van de niet-ionische oppervlakteactieve stof, afhankelijk van de lokalisatie van het doelwit: membraan (0-0,5%), cytoplasma (0,5-1%) en kern (1%). Deze oplossing kan maximaal 1 maand bij 4°C bewaard worden. BSA werkt meestal goed voor de blokkerende stap, maar voer in geval van hoge achtergrondgeluiden een empirische test uit om de best mogelijke resultaten te verkrijgen voor een bepaalde combinatie van antilichamen.
   2. Breng de organoïden over van de centrifugebuis van 1,5 ml naar een buis van 0,5 ml met behulp van een voorgecoate punt van 1 ml. Laat de organoïden bezinken, verwijder voorzichtig de 1x PBS en vervang deze door 0,5 ml PB-oplossing. Incubeer de organoïden met zachte horizontale agitatie (30-50 rpm) gedurende 1 uur bij RT.
   3. Laat de organoïden bezinken, verwijder voorzichtig de PB-oplossing en was tweemaal in 1 ml PBS-BSA 0,1% gedurende 3 minuten.
      OPMERKING: Door 3 minuten te wachten, kunnen de structuren aan de onderkant van de buis bezinken.
   4. Verwijder voorzichtig de PBS-BSA 0,1% en voeg 250 μL primair antilichaam verdund in de juiste concentratie in PB:1x PBS (1:10) oplossing toe. Om 10 ml PB:1x PBS (1:10) oplossing te bereiden, verdunt u 1 ml PB-oplossing in 9 ml 1x PBS. Incubeer gedurende 2-3 dagen met zachte horizontale agitatie (30-50 rpm) bij 4 °C.
      OPMERKING: Een geschikte incubatietijd van antilichamen is cruciaal voor een geschikte antilichaampenetratie, omdat 3D-structuren soms grote afmetingen kunnen bereiken.
   5. Laat de organoïden bezinken en verwijder voorzichtig de primaire antilichaamoplossing. Was 5x in PBS-BSA 0,1% gedurende 3 min per wasbeurt en vervolgens 2x in 1 ml PBS-BSA 0,1% gedurende 15 minuten per wasbeurt met zachte horizontale beweging.
   6. Voeg 250 μL secundair antilichaam verdund met 1:250 toe in PB:1x PBS (1:10) oplossing. Incubeer gedurende 24 uur bij 4°C met zachte horizontale agitatie (30-50 rpm). Bescherm voor deze stap de monsters tegen licht.
   7. Voeg 250 μL Hoechst 33342 (20 μM stamoplossing) verdund op 1:1000 in PB:1x PBS (1:10) oplossing toe en incubeer nog eens 2 uur bij 4 °C met zachte horizontale beweging (30-50 rpm).
   8. Laat de organoïden bezinken en verwijder voorzichtig de oplossing die secundair antilichaam + Hoechst 33342 bevat. Was de organoïden 5x in 1 ml 1x PBS gedurende 3 minuten per wasbeurt en vervolgens 2x in 1 ml 1x PBS gedurende 15 minuten per wasbeurt met zachte horizontale beweging (30-50 tpm).
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de monsters uitgebreid te wassen om achtergrondgeluid of signaalverlies te voorkomen.
   9. Bewaar de monsters in PBS bij 4 °C totdat het beeld is verkregen. Ga verder met paragraaf 2.2.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters kunnen enkele maanden bij 4 °C worden bewaard, beschermd tegen licht.
2. Monstervoorbereiding voor confocale beeldvorming
   1. Breng met behulp van een voorgecoate tip van 1 ml de organoïden voorzichtig over in 50 μL van de 1x PBS per put in een 96-well zwarte polystyreen microplaat. Ga verder met stap 2.2.3 of paragraaf 2.3.
      OPMERKING: In dit stadium kan het monster tegen licht worden beschermd en gedurende vele weken bij 4 °C worden bewaard.
   2. Verrekening
      OPMERKING: De clearingstap is optioneel en kan worden gebruikt om organoïden te labelen of om endogene fluorescentie te detecteren. Clearing kan 3D-structuurkrimp veroorzaken, maar verandert de algemene morfologie niet, behalve voor bolvormige mono-gelaagde organoïden met grote lumen⁴. Sla voor deze cystische organoïden de opruimstap over en voer deep-tissue imaging uit⁶.
      1. Bereid 2,5 M glycerol-fructose clearingoplossing met 50% v/v glycerol, 11% v/v gedestilleerd water en 45% g/v fructose door ten minste één nacht op een magneetroerder te mengen totdat de oplossing volledig is opgelost en homogeen. Bewaren bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 1 maand.
      2. Verwijder zoveel mogelijk 1x PBS zonder de organoïden aan te raken. Voeg 200 μL van de opruimoplossing toe met behulp van een pipetpunt van 1 ml na het verwijderen van het uiteinde en resuspenseer voorzichtig om de vorming van bellen te voorkomen. Incubeer bij RT gedurende ten minste 12 uur en ga verder met rubriek 3.
         OPMERKING: Omdat de clearingoplossing stroperig is, zijn kleine volumes moeilijk te hanteren. Om de hantering te vergemakkelijken, moet u ervoor zorgen dat de oplossing op RT staat en langzaam pipetteer. Voor een optimale clearing laat u het monster ten minste 24 uur in de clearingoplossing bezinken voordat u het in beeld brengt. Als 3D-structuren drijven op het moment van verwerving, voer dan een optionele spin uit gedurende 10 minuten bij < 100 × g bij RT, of geef meer tijd (één tot enkele dagen) om ze te laten bezinken. Het protocol kan in deze stap worden gepauzeerd voordat het overgaat tot beeldvorming als het wordt beschermd tegen licht en wordt bewaard bij 4 ° C (weken) of -20 ° C (maandenlang).
3. Beeldacquisitie en -analyse
   OPMERKING: Beeldsectietechnologie is vereist om 3D-structuren in beeld te brengen.
   1. Gebruik confocale microscopen en geef de voorkeur aan onderdompelingsdoelen met een hoger numeriek diafragma (NA) in vergelijking met lucht. Kies vergrotingsdoelstellingen (10x, 20x, 40x) op basis van de grootte van 3D-structuren, beeldreconstructie (stitching) en oplossingen die voor de analyse worden gebruikt.
   2. Houd bij het selecteren van de acquisitiemodus rekening met de scherptediepte van het doel dat wordt gebruikt om de stap voor Z-stapeling te definiëren; zorgen voor optimale 3D-rendering.
      OPMERKING: Beeldanalyseoplossingen variëren en de analyse moet worden aangepast aan de gebruikte software. Dit analyseprotocol is bijvoorbeeld opgesteld op basis van een analysesoftware met een hoog gehalte (zie Materiaaltabel en Aanvullende Figuur 1 voor details) en biedt gegevens over objectsegmentatie, berekening van eigenschappen en celpopulatieselectie binnen een 3D gereconstrueerd object.

3. 2D-sectie, kleuring, beeldvorming en analyse van 3D-celkweekmodellen

OPMERKING: 3D-celkweekmodellen variëren in grootte. Ga verder met rubriek 3.1 of 3.2 voor een efficiënte inbedding van paraffine (figuur 2). Geef voldoende tijd voor sedimentatie van de 3D-structuur voordat er wasbeurten en reagensveranderingen plaatsvinden. Pas op dat u de organoïden die aan de onderkant van de buis zweven, niet aanzuigt. Voor het insluiten van paraffine raadpleegt u figuur 2 voor richtlijnen.

1. Paraffine inbedding van grote (Ø ≥ 400 μm) 3D celkweekmodellen
   1. Op de dag voor de inbedding, prewarm twee 150 ml kolven gevuld met paraffine (paraffinebaden), een kleine metalen inbeddingsvorm per monster en fijne tangen tot 65 °C.
   2. Breng met behulp van een voorgecoate tip van 1 ml de organoïden in 1x PBS voorzichtig over op een glazen buis met platte bodem met een met polytetrafluorethyleen beklede flesdop. Laat de organoïden bezinken, verwijder voorzichtig de 1x PBS en vervang deze door 70% ethanol. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten.
   3. Laat de organoïden bezinken en verwijder voorzichtig de 70% ethanol. Vervang het door 1 ml kant-en-klare eosine Y-oplossing. Veeg met de buis en bevlek gedurende ten minste 30 minuten. Verwijder voorzichtig de eosine-oplossing en droog de organoïden uit in drie opeenvolgende wasbeurten met 1 ml 100% ethanol gedurende ~ 30 minuten elk.
      OPMERKING: Ethanol, een ontvlambare en vluchtige vloeistof, veroorzaakt ernstige irritatie van de ogen en luchtwegen. Manipuleer het in een zuurkast en draag een beschermende oogbril.
   4. Verwijder voorzichtig de 100% ethanol en verwijder onder een chemische kap de organoïden in 3 opeenvolgende wasbeurten met 1 ml xyleen gedurende ~ 30 minuten elk.
      OPMERKING: Xyleen is een giftige, ontvlambare vloeistof waarvan de dampen irritatie kunnen veroorzaken. Manipuleer het in een zuurkast. Vermijd direct contact met de huid en draag rubberen handschoenen en een beschermende oogbril.
   5. Bereid onder een chemische kap een witte microtwinweefselcassette voor door een stuk biopsiepad (eerder gedrenkt in xyleen) in een van de compartimenten van de cassette te plaatsen. Breng de 3D-structuren voorzichtig over met behulp van een voorgecoate 2 ml plastic Pasteur-pipet naar het biopsiepad. Bedek ze met een ander biopsiekussen gedrenkt in xyleen om te voorkomen dat de organoïden bewegen en sluit de cassette.
   6. Als er meerdere monsters zijn verwerkt, plaats de cassette dan in een xyleenbad in afwachting van verdere verwerking. Zodra alle monsters in cassettes zijn overgebracht, plaatst u de cassettes gedurende 30 minuten bij 65 °C in een voorbewarmd paraffinebad. Breng de cassettes 's nachts over in een vers voorgewarmd paraffinebad.
   7. Neem na paraffine-impregnatie een voorbewarmde insluitvorm en voeg de verwarmde paraffine eraan toe. Plaats het biopsiekussen met de 3D-structuren in de mal en roer het voorzichtig totdat alle organoïden op de bodem van de mal vallen. Plaats de 3D-structuren zeer voorzichtig in het midden van de mal met behulp van voorgewarmde fijne tangen. Ga verder met paragraaf 3.3.
      OPMERKING: Pas op dat u de 3D-structuren niet verstoort met de tang; duw, maar knijp ze niet.
2. Paraffine inbedding van kleine (Ø ≤ 400 μm) 3D celkweekmodellen
   1. Op de dag voor de inbedding, prewarm twee 150 ml kolven gevuld met paraffine (paraffinebaden), een kleine metalen inbeddingsvorm per monster en fijne tangen tot 65 °C.
   2. Verwijder voorzichtig de 1x PBS uit de organoïde suspensie. Voer voorzichtig 3 wasbeurten uit in 1 ml 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS). Verwijder zoveel mogelijk 1x TBS zonder de organoïden aan te raken.
      OPMERKING: Pas op dat u het monster niet aspirateert. Voer indien nodig een spin van 5 minuten uit bij 50 x g bij RT. Resterende sporen van fosfaat zullen de volgende stappen verstoren, met name het voorkomen van gelpolymerisatie. Gebruik daarom geen PBS-oplossingen tijdens een verwerkingsstap. Voor deze stap werd een commerciële kit, met cassettes, Reagens #1 (heldere vloeistof) en Reagens #2 (gekleurde vloeistof), gebruikt om de paraffine-ingebedde procedure te vergemakkelijken zonder mogelijk kleine fragmenten te verliezen (zie Tabel van materialen). Volg de instructies van de kit. De cassettes zijn voorgemonteerd met backing papers en board inserts die al op hun plaats zitten.
   3. Voeg 2 druppels Reagens #2 toe aan de buis en meng voorzichtig door op de buis te tikken. Voeg 2 druppels Reagens #1 toe en meng opnieuw door te tikken om de gel te laten stollen. Verwijder met behulp van de fijne tang de gel uit de tube en plaats deze in het putje van de cassette.
   4. Onder de zuurkast het monster uitdrogen door de cassette als volgt in opeenvolgende baden te plaatsen (gebruik de kolven van 150 ml en gebruik verse ethanol of xyleen voor elk bad): ethanol 70%, 30 min; ethanol 96%, 30 min; ethanol 100%, drie wasbeurten, elk 30 min; xyleen, drie wasbeurten van elk 30 min.
   5. Plaats de cassettes gedurende 30 minuten bij 65 °C in een voorgewarmd paraffinebad en breng ze een nacht in een vers voorgewarmd paraffinebad. Neem na paraffine-impregnatie een voorbewarmde insluitvorm en voeg er verwarmde paraffine aan toe. Open de cassette, maak de gel voorzichtig los met een fijne tang en plaats de gel met de 3D-structuren op het midden van de insluitvorm. Ga verder met paragraaf 3.3.
3. Veelvoorkomende stappen voor het inbedden van paraffine
   1. Breng de mal voorzichtig over naar een koud gebied om de paraffine in een dunne laag te laten stollen, waardoor de 3D-structuren in de juiste positie blijven. Voeg een tissuecassette toe aan de bovenkant van de vorm en voeg hete paraffine toe om deze plastic cassette te bedekken. Verwijder de mal zodra deze volledig is gestold en ga verder met rubriek 3.4.
      OPMERKING: Paraffineblokken kunnen jarenlang bij kamertemperatuur worden bewaard.

Figuur 2: Overzicht van de procedure voor paraffine-inbedding van grote en kleine in vitro 3D-celkweekmodellen.
(A) Standaardprocedure voor inbedding van paraffine. Na fixatie en uitdroging worden 3D-structuren gekleurd met eosine om hun visualisatie te vergemakkelijken (linksboven en rechtsonder). 3D-structuren worden zorgvuldig op het biopsiepad (blauw) in de cassette geplaatst met behulp van een 2 ml Pasteur-pipet (midden). Na paraffine-impregnatie worden de 3D-structuren voorzichtig in de vloeibare paraffine gedropt met behulp van een tang en voorzichtig geroerd in het biopsiekussen. Kleine 3D-structuren gaan verloren tijdens deze stap omdat ze niet kunnen worden losgelaten van de pad (rechtsonder: mislukte insluiting). Alleen grote 3D-structuren worden ingesloten (rechtsboven: succesvolle inbedding). Pijlpunten wijzen naar 3D-culturen. (B) Alternatief voor het standaard paraffine-inbeddingsprotocol. Na het repareren van kleine 3D-structuren, wordt een commerciële kit gebruikt om cellen in een gel te houden en hun overdracht naar de mal na paraffine-impregnatie te vergemakkelijken (rechts: succesvolle inbedding). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Bloksectie en kleuring
   1. Snijd secties van 4 μm met behulp van een standaard microtoom en voer standaard histologische en immunohistochemische technieken uit. Ga verder met paragraaf 3.5.
      OPMERKING: Specifieke dia's (zie Materiaaltabel) werden gebruikt voor een betere hechting van secties. De platen kunnen jarenlang bij kamertemperatuur of bij 4 °C worden bewaard.
5. Beeldacquisitie en -analyse
   1. Voer beeldvorming uit met behulp van een digitale diascanner of rechtopstaande microscoop en analyseer gegevens met behulp van een platform voor snelle digitale kwantitatieve analyse die morfologische en multiplexed expressiegegevens rapporteert op cel-voor-celbasis over volledige 3D-structuursecties (zie aanvullende figuur 2 voor details).
      OPMERKING: Het doel 20x wordt routinematig gebruikt door deze groep.

Resultaten

Dit protocol biedt een overzicht van de kritieke stappen voor 2D- en 3D-kleuring van de hele montage, evenals beeldvorming en kwantitatieve analyses van 3D-celkweekmodellen (figuur 3 en figuur 4). Het is van toepassing op een breed scala aan 3D-celkweekmodellen - van sferoïden tot organoïden van verschillende gastheersoorten of weefsels - en maakt het mogelijk om nauwkeurige en kwantitatieve informatie te verkrijgen over architectuur, celorganisatie en interacties op cellulair en subcellulair niveau (figuur 3 en figuur 4). Laboratoria moeten mogelijk 2D histologische en immunohistochemische technieken en antilichaamconcentraties optimaliseren volgens hun eigen behoeften.

Beide methoden leveren waardevolle biologische informatie op. 3D-kleuring van de hele montage en confocale microscopie bieden visuele informatie over cellulaire samenstelling en ruimtelijke positie met een scherpte van diepte tot 200 μm (figuur 3B). 2D-secties zijn echter handig voor grotere 3D-structuren om gedetailleerde cellulaire morfologische kenmerken in het hele gedeelte van 3D-structuren te onthullen die anders een uitdaging kunnen zijn om in situ te observeren vanwege lichtverstrooiing die de resolutie in grotere monsters in gevaar brengt. Bovendien kunnen beide technieken kwantitatieve gegevens opleveren. De verkregen resolutie maakt inderdaad de toepassing van cellulaire en subcellulaire segmentatiealgoritmen mogelijk voor de kwantificering van het aantal cellen en de detectie van de aanwezigheid van verschillende celmarkers in verschillende cellulaire subtypen (figuur 3F en figuur 4). Samenvattend zijn de hier beschreven beeldvormingstechnieken reproduceerbaar, eenvoudig en complementair en vertegenwoordigen ze waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van cellulaire heterogeniteit.

Figuur 3: Representatieve resultaten voor 3D-hele mount, beeldvorming en analyses van 3D- en 2D-optische secties. (A) Confocale beelden van menselijke (h) hoogwaardige glioomsferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Olig2 (geel) en Actine (rood) (20x waterobjectief). Voor alle verkregen beelden werden microscoopinstellingen vastgesteld met behulp van een positieve controle (boven) en vervolgens werd de negatieve controle in beeld gebracht met identieke instellingen om het gebrek aan fluorescentie te beheersen in afwezigheid van primair antilichaam (onder). (B) Orthogonale 3D-weergave van Ki67-kleuring uitgevoerd in (h) hoogwaardige glioma-sferoïde gekweekt gedurende een week (glycerol-fructose-clearing; 20x waterobjectief, confocaal). (C) Confocale beelden van (h) hoogwaardige glioom sferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Olig2 (geel) en Phalloidine-488 (groen) (glycerol-fructose clearing; 20x waterdoelstelling). (D) Confocale beelden van menselijke (h) rabdomyosarcoom (boven) en muis (m) neurale crest cell (onderste) sferoïden gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw), Actine (rood) en Ki67 (groen), respectievelijk (glycerol-fructose clearing; 20x droog doel). (E) Confocale beelden van (h) hoogwaardige glioom sferoïde gekweekt gedurende een week en gelabeld met Hoechst (blauw) en Ki67 (groen) (glycerol-fructose clearing; 40x water objectief) (linksboven). Gesegmenteerde beelden op het Hoechst-kanaal en Ki67-positieve (+) nucleaire regio's op het groene kanaal werden gegenereerd met behulp van high-content analysesoftware (zie aanvullende figuur 1 en tabel met materialen) (onder). De gegeven output is het percentage Ki67⁺ kernen per gesegmenteerde 3D-structuur (rechtsboven). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten voor beeldvorming en analyses van 2D optische secties. (A, D) 2D-sectiebeelden van een 3D-celmodel (menselijke rhabdomyosarcoom-sferoïden gekweekt gedurende een maand) verkregen met een digitale diascanner en geanalyseerd op een platform voor snelle digitale kwantitatieve analyse. (A) H&E-kleuring en detectie van cellen op basis van hun grootte. Schaalbalk = 500 μm. (B) Histogram toont percentage cellen < 100 μm² en > 100 μm² gedetecteerd met behulp van software voor snelle digitale kwantitatieve analyse (links: Halo) of handmatig tellen (rechts: MC). (C) Ki67 kleuring en detectie van cellen op basis van de intensiteit van hun 3,3'-diaminobenzidine (DAB) signaal. Negatief (blauw), zwak positief (geel), positief (rood). Schaalbalk = 500 μm. (D) Histogram toont percentage Ki67-negatieve, zwak positieve en positieve cellen. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; MC = handmatig tellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Overzicht van de stappen in de software voor beeldvormingsanalyse. Analyses zijn gebaseerd op de associatie van bouwstenen. Elke bouwsteen die overeenkomt met een functiesegmentatie, berekening, associatie, uitvoerdefinitie en biedt meerdere algoritmen en variabele selecties die overeenkomen met het biologische monster dat wordt afgebeeld. De software biedt meerdere RMS (Ready Made Solution) analyseprotocollen die eenvoudig kunnen worden gebruikt en aangepast. Geïntegreerde beeldanalyseprotocollen kunnen worden opgeslagen, toegepast op verschillende gegevenssets en worden gedeeld tussen gebruikers. In het kort impliceert het analyseprotocol sequentiële objectsegmentatie: sferoïde, kernen en ten slotte Ki67-pockets (A488). Vervolgens wordt de gemiddelde intensiteit van de Ki67-pockets berekend om de positieve gebeurtenissen verder te discrimineren. Ten slotte worden kernen die Ki67-positieve pockets omvatten positief geselecteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Overzicht van de procedurestappen van de kwantitatieve analysesoftware. Stap 1. Upload de bestanden via het tabblad Studies . Bestanden worden geopend in het gedeelte Afbeeldingsacties . Stap 2. Open het tabblad Annotaties en klik vervolgens op Laagacties om een nieuwe laag rondom de structuur te ontwerpen met behulp van het cirkelgereedschap van de werkbalk. Voor niet-cirkelvormige structuren kan in plaats daarvan het pengereedschap worden gebruikt. Stap 3. De werkbalk kan worden gebruikt om annotaties te ontwerpen en de kwantificering met de tool te visualiseren. Stap 4. Open het tabblad Analyse en selecteer de beste omstandigheden voor de analyse van het monster (hier kunnen verschillende onderzoeken nodig zijn). Stap 4.1. Gebruik het gedeelte Vlekselectie om de kleuringsconditie in te stellen. In het geval van meerdere vlekken kunnen deze worden toegevoegd en hernoemd en kan de virtuele kleur worden gewijzigd. De lokalisatiedetectie kan gespecificeerd-nucleair of cytoplasmakleuring zijn. Stap 4.2. Gebruik de sectie Celdetectie om de celdetectie in te stellen. Dit gedeelte zal het belangrijkst zijn voor de analyse. De sectie Nucleaire contrastdrempel maakt detectie van alle kernen mogelijk. Er moet aandacht worden besteed aan het geval er meerdere populatiegroottes zijn, de software kan meerdere cellen detecteren in plaats van een unieke grote. Nucleaire grootte en nucleaire segmentatie agressiviteit secties kunnen worden gebruikt om celgrootte populatiebereiken te kwantificeren. Stap 5. Beschrijving van het uitvoeren van voorbeeldanalyse. Volg de stappen in de afbeelding. In de sectie Annotatielaag wordt de instelling alleen op deze dia uitgevoerd. De kwantificering kan worden gevisualiseerd met behulp van de tool. Herhaal stap 4.1-5 totdat de juiste kwantificering is bereikt. Stappen 6-6.1. Met deze stappen kunt u een figuur tekenen met behulp van de software. Stap 7. Kwantificeringsgrafieken verkregen via software kunnen worden opgeslagen. Stap 8. Gegevens kunnen worden geëxporteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Celkweek is een onmisbaar hulpmiddel om fundamentele biologische mechanismen bloot te leggen die betrokken zijn bij weefsel- en orgaanontwikkeling, functie, regeneratie en verstoring, en ziekte. Hoewel monolayered 2D-celcultuur de overhand heeft gehad, is recent onderzoek verschoven naar culturen die 3D-structuren genereren die meer reflecteren op in vivo cellulaire reacties, met name als gevolg van extra ruimtelijke organisatie en cel-celcontacten die genexpressie en cellulair gedrag beïnvloeden en dus meer voorspellende gegevens kunnen opleveren⁷. Niettemin blijven er veel uitdagingen bestaan, waaronder de behoefte aan gebruiksvriendelijke kleurings- en beeldvormingstechnieken voor gedetailleerde microscopische visualisatie en evaluatie van complexe 3D-structuren op cellulair en subcellulair niveau. In die context zijn gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen verstrekt om kleuring en cellulaire en subcellulaire resolutie beeldvorming uit te voeren van vaste in vitro 3D-celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters groot.

Deze procedure presenteert twee verschillende strategieën om om te gaan met een grote verscheidenheid aan maten en soorten in vitro 3D-celkweekmodellen. De keuze van de ene (3D whole-mount analyse) of de andere (2D sectioning analyse) hangt af van het gebruikte model en de onderzochte kwestie. 3D whole-mount analyse door confocale microscopie maakt de visualisatie mogelijk van cellen met een veld van diepte tot 200 μm, ongeacht de totale grootte van de 3D-structuur, terwijl 2D-secties van toepassing zijn op monsters van elke grootte, maar visualisatie blijft 2D-dimensionaal. Hieronder vindt u enkele suggesties voor het oplossen van problemen en technische overwegingen.

Verlies van 3D-structuren tijdens de workflow is het meest voorkomende nadeel. Ze kunnen aan de uiteinden en buizen blijven kleven, daarom is het voorcoaten van tips en buizen met PBS-BSA 0,1% oplossing van cruciaal belang. Bovendien is het cruciaal om de 3D-structuren te laten bezinken tussen reagensveranderingen en om alle pipetteringen zeer zorgvuldig uit te voeren. Zoals vermeld in de procedure, kunnen voor alle stappen, als de sedimentatie van de 3D-structuur te lang is, cellen voorzichtig worden gesponnen met 50 × g gedurende 5 minuten bij RT. Afhankelijk van het doel van de studie, moeten de voor- en nadelen van een dergelijke draaiende stap worden overwogen, omdat centrifugatie de vorm van de 3D-structuren in gevaar kan brengen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat deze morfologie tijdens de fixatiestap behouden blijft, omdat cystische organoïden de neiging hebben om in te storten. Bevestigingsconstructies met een grootte van minder dan 400 μm moeten structurele veranderingen voorkomen.

Voor optimale immunolabeling is herstel van organoïden uit hun 3D-matrices een cruciale stap. De 3D-matrix kan adequate penetratie van antilichamen belemmeren of leiden tot hoge achtergrondkleuring vanwege niet-specifieke binding aan de matrix. ECM-verwijdering kan de morfologie van de buitenste segmenten van organoïden veranderen (met name in het geval van kleine cellulaire uitsteeksels die zich uitstrekken van bestudeerde 3D-structuren) en analyses gedeeltelijk belemmeren. Voor dergelijke 3D-structuren kan de matrix gedurende de hele procedure worden behouden; de kweekomstandigheden moeten echter zorgvuldig worden aangepast om cellen in een minimale hoeveelheid matrix te laten groeien om onvoldoende penetratie van oplossingen en antilichamen te voorkomen en om opeenvolgende wasstappen te voorkomen die gericht zijn op het verminderen van overmatig achtergrondgeluid ^6,8.

De optische clearingstap die in dit protocol wordt beschreven in de 3D whole mount-kleuringssectie is relevant voor de beeldvorming van 3D-structuren tot 150-200 μm diep in plaats van 50-80 μm zonder clearing. In vergelijking met andere clearingmethodologieën die vaak enkele weken nodig hebben en waarbij toxische clearingmiddelen worden gebruikt, is in dit protocol een eerder gepubliceerde snelle en veilige clearingstap gebruikt ^4,9. Bovendien is deze opruimstap omkeerbaar en kunnen nieuwe antilichamen worden toegevoegd aan de initiële kleuring zonder verlies van resolutie of helderheid⁴. Niettemin, afhankelijk van het bestudeerde 3D-celkweekmodel, is een diepte van 150-200 μm mogelijk niet voldoende om de 3D-structuur op een informatieve manier in beeld te brengen, en dit clearingprotocol kan veranderingen veroorzaken in de algemene morfologie van bolvormige, monolayered organoïden met grote^{lumens 4}. Gebruikers moeten hun experiment zorgvuldig ontwerpen en indien nodig de timing van de permeabilisatie / blokkeringsstap optimaliseren (om penetratie van antilichamen en oplossing mogelijk te maken), de clearingstap (om dieper dan 200 μm door te dringen, monsters moeten volledig worden gewist) en beeldacquisitie. De twee meest voorkomende technologieën die beschikbaar zijn in kernfaciliteiten zijn lichtplaat en confocale microscopie. Gebruikers moeten zorgvuldig een technologie kiezen op basis van de grootte van hun 3D-structuren en hun biologische vraag¹⁰. In vergelijking met confocale microscopie blijft de resolutie van lichtplaatmicroscopie die wordt verkregen voor dergelijke diepe structuren echter suboptimaal voor het verkrijgen van subcellulaire resolutie.

Hier is een gedetailleerd en robuust proces gerapporteerd dat is gewijd aan paraffine-inbedding van afzonderlijke monsters. Interessant is dat Gabriel et al. onlangs een protocol hebben ontwikkeld dat 3D-celculturen in paraffine insluit met een verhoogde doorvoer. Ze gebruikten een polydimethylsiloxaan (PDMS) -mal om 96 3D-structuren in een microarraypatroon in één blok op te sluiten, waardoor nieuwe perspectieven werden geboden voor studies over 3D-tumormodellen die meer groepen, tijdspunten, behandelingsomstandigheden en replicaties^{omvatten 11}. Deze methode vereist echter uitgebreide vaardigheden en machines, met name voor de fabricage van de premold die wordt gebruikt om PDMS-mallen te maken.

Samenvattend beschrijft dit artikel twee verschillende, complementaire en aanpasbare benaderingen die het mogelijk maken om nauwkeurige en kwantitatieve informatie te verkrijgen over architecturale en cellulaire samenstelling van 3D-cellulaire modellen. Beide parameters zijn cruciaal voor het bestuderen van biologische processen zoals intratumorale cellulaire heterogeniteit en de rol ervan in resistentie tegen behandelingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uitrusting
Biopsy pad Q Path blauw	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin wit	VWR	720-2183
Chemische kap	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fijne tang	Pyramid innovation	R35002-E
Vlakbodem glazen buisjes met PTFE gevoerd 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Uitstekend  voor omgevings    monsters,    farmaceutica en diagnostische reagentia. PTFE is ontworpen voor de ultieme veiligheid van producten. PTFE biedt een volledig inert binnenste afdichting en oppervlak dat de monster of het product raakt.
Glasbodem schaalplaat 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontaal roeren	N-BIOTEK	NB-205
Incubator voorverwarmd tot 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox mallen 15x15	VWR	720-1918
Microscoopglazen Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	deze glazen worden gebruikt voor een betere hechting van secties
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panorama scan II	3dhistech	2397612
Paraffine inbeddingsapparatuur	Leica	EG1150C
Plastiek pipet Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Goed voor omgevings    monsters,    farmaceutica en diagnostische reagentia. Polypropyleen (PP) zijn stijf,  solide, bieden uitstekende  spanning  kraak  en  impact  weerstand en hebben een  goede olie en alcohol barrière en chemische weerstand. PE-beklede dop is stress kraakbestendig en biedt  uitstekende  afdichting  kenmerken.
Set van micropipetten  (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 omgekeerde confocale microscoop	Leica	LSM780
Weefsel cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscoop	Leica	SIP 60549
Reagens
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfaat (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	VOORZICHTIG: giftig en ontvlambaar. Dampen kunnen irritatie veroorzaken. Hanteer in een dampkap. Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen, beschermende oogbescherming.
Eosine waterig 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	VOORZICHTIG: Veroorzaakt ernstige oogirritatie. Ontvlambare vloeistof en damp. Veroorzaakt irritatie van de luchtwegen. Hanteer in een dampkap. Draag beschermende oogbescherming.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	VOORZICHTIG: Veroorzaakt ernstige oogirritatie. Ontvlambare vloeistof en damp. Veroorzaakt irritatie van de luchtwegen. Hanteer in een dampkap. Draag beschermende oogbescherming.
Formaline 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	VOORZICHTIG: Formaline bevat formaldehyde dat gevaarlijk is. Hanteer in een dampkap. Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen en beschermende oogbescherming.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylinen type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	VOORZICHTIG: Verdacht van het veroorzaken van genetische defecten.  Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen en beschermende oogbescherming.
Normaal ezelsserum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffine Wax tek III	Sakura	4511
Fosfaat Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	VOORZICHTIG: Triton X­100 is gevaarlijk. Vermijd contact met de huid en ogen.
Xyleen	Sigma-Aldrich	534056	VOORZICHTIG: Xyleen is giftig en ontvlambaar. Dampen kunnen irritatie veroorzaken. Hanteer in een dampkap. Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen, beschermende oogbescherming.
Oplossingen
Clearing oplossing	Glycerol-Fructose clearing oplossing is 60% (vol/w) glycerol en 2,5 M fructose. Om 10 mL van deze oplossing te bereiden, meng 6 mL glycerol en 4,5 g fructose. Compleet tot 10 mL met dH2O. Gebruik een magnetische roerder overnacht. Brekingsindex = 1,4688 bij kamertemperatuur (RT: 19–