Methodenartikel

Een eenvoudige en flexibele inentingsmethode voor het nauwkeurig beoordelen van echte meeldauw-infectie fenotypen van Arabidopsis en andere planten

DOI:

10.3791/62287

⸱

9 maart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor het bouwen van een eenvoudig sporenverdelingssysteem bestaande uit een inentingsdoos met een gaas van ~ 50 μm en een transparante plastic kamer. Dit kan worden gebruikt om planten gelijkmatig in te enten met echte meeldauwsporen, waardoor een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van ziektefenotypen van bestudeerde planten mogelijk wordt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verminderen van gewasverliezen als gevolg van schimmelziekten vereist een beter begrip van de mechanismen die de immuniteit van planten en schimmelpathogenese regelen, wat op zijn beurt een nauwkeurige bepaling van ziektefenotypen van planten vereist bij infectie met een bepaalde schimmelpathogeen. Nauwkeurige ziektefenotypering met niet-culturele biotrofe schimmelpathogenen zoals echte meeldauw is echter niet gemakkelijk te bereiken en kan een snelheidsbeperkende stap van een onderzoeksproject zijn. Hier hebben we een veilig, efficiënt en gemakkelijk te bedienen ziektefenotyperingssysteem ontwikkeld met de Arabidopsis-echte meeldauwinteractie als voorbeeld. Dit systeem bestaat voornamelijk uit drie componenten: (i) een houten inentingsdoos uitgerust met een afneembaar deksel gemonteerd met een roestvrijstalen of nylon gaas van ~ 50 μm poriën voor het inenten van een flat van planten met schimmelsporen, (ii) een transparante plastic kamer met een kleine opening aan de voorkant voor het minimaliseren van sporenvlucht tijdens het uitvoeren van inenting binnenin, en (iii) een sporenontwrichtende en distributiemethode voor gelijkmatige en effectieve inenting. De hier beschreven protocollen omvatten de stappen en parameters voor het maken van de inentingsdoos en de plastic kamer tegen lage kosten, en een videodemonstratie van hoe het systeem te gebruiken om zelfs inenting met echte meeldauwsporen mogelijk te maken, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van ziektefenotypering wordt verbeterd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Echte meeldauw is een van de meest voorkomende en belangrijke ziekten van talrijke voedselgewassen en sierplanten1. Studies naar echte meeldauwziekten zijn erg populair, zoals blijkt uit meer dan 10.500 publicaties als zoekresultaat met "echte meeldauw" als sleutelwoord op het Web of Science (vanaf november 2020). Inderdaad, echte meeldauw (vertegenwoordigd door Blumeria graminis) wordt beschouwd als een van de top 10 schimmelpathogenen door het journal of Molecular Plant Pathology2. Kwantificering van ziektegevoeligheid is een noodzakelijke stap in de karakterisering van plantengenen die bijdragen aan ziekteresistentie of gevoeligheid, of functionele identificatie van kandidaat-effectorgenen in echte meeldauw. Betrouwbare ziektefenotypering is echter veel uitdagender met echte meeldauw in vergelijking met die met de meeste andere schimmelpathogenen, deels omdat, in tegenstelling tot sporen van de laatste, sporen van echte meeldauwsoorten (zoals Golovinomyces cichoracearum UCSC1 op basis van onze laboratoriumervaring) een verminderde levensvatbaarheid vertonen na het doorlopen van een watersuspensieproces 3,4 . Ontoereikende en/of ongelijke inenting van testplanten met een bepaald echte meeldauwpathogeen kan leiden tot onnauwkeurige fenotyperingsresultaten.

Een aantal inentingsmethoden werden gerapporteerd voor echte meeldauwstudies. Deze omvatten (i) het borstelen van sporen rechtstreeks van geïnfecteerde bladeren om planten te testen5, (ii) het spuiten van een sporensuspensie om planten te testen6, (iii) het blazen van sporen met behulp van een vacuümbewerkte bezinktoren naar planten op de bodem van de toren7, en (iv) sporenafgifte door het combinatorische gebruik van een nylon gaasmembraan en op geluid gebaseerde trillingen8 . De methode voor het borstelen (of afstoffen) van sporen is gemakkelijk uit te voeren, maar ongelijk van aard, dus het is mogelijk niet nauwkeurig voor kwantitatieve beoordeling. Sporenspuiten is handig en gelijkmatig, maar zoals hierboven vermeld, kan dit leiden tot een slechte sporenkieming4. De laatste twee (d.w.z. iii-iv) zijn sterk verbeterde methoden die in staat zijn om zelfs inenting te bereiken; beide zijn echter niet flexibel in het aanpassen van hun inentingscapaciteit in termen van het aantal planten dat in één gebeurtenis moet worden ingeënt, waardoor beide apparaten niet triviaal zijn en hun werking beperkt is tot laboratoriumgebieden waar een vacuüm- en / of elektriciteitsbron is.

Ons lab werkt al meer dan 20 jaar met plant-echte meeldauw interactie 9,10. In het afgelopen decennium hebben we een aantal inentingsmethoden getest en onlangs een eenvoudige en toch effectieve echte meeldauwinentingsmethode ontwikkeld. Deze op mesh gebaseerde sporenborstelmethode kan zorgen voor een gelijkmatige inenting en is eenvoudig en schaalbaar, dus moet gemakkelijk worden overgenomen door elk laboratorium dat met echte meeldauw werkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het maken van een standaard inentingsdoos met een verwijderbaar bovendeksel gemonteerd met een gaas

  1. Koop een rol van 50 μm nylon membraangaas of 48 μm roestvrijstalen gaas (aanbevolen) bij winkels. Zorg ervoor dat u voldoende bestelt om in meerdere stukken van 14 in x 26 te snijden voor vervanging van versleten gaas.
  2. Koop een 1/4 in x 2 ft x 4 ft vezelplaat met gemiddelde dichtheid of multiplex en snijd twee 24-1/2 in x 10 in stukken en twee 12 in x 10 in stukken voor het maken van een inentingsdoos. Gebruik 8 hoekklemmen om de vier zijden te ondersteunen.
    OPMERKING: Als u naar de brede kant van de behuizing kijkt, is de linkerzijde 12 in x 10 permanent bevestigd en de rechter 12 in x 10 in zijde is een verwijderbare deur die op zijn plaats wordt gehouden door vier magnetische vangsten (figuur 1A, B).
  3. Plaats vier 2-in hoekbeugels twee in elke binnenhoek van de linkerkant, een inch van de bovenkant en een inch van de onderkant, markeer en boor een gat. Gebruik schroeven om de linker korte kant permanent aan twee lange zijden (voor- en achterkant) te bevestigen. De binnenste afstand tussen de twee lange zijden moet 12 in zijn en niet 11-1/2 in.
  4. Met de hoekklemmen nog steeds op hun plaats en de juiste uitlijning van de rechterdeur, markeert en boort u de locatie van de 4 magnetische vangsten om de juiste afneembare deur op zijn plaats te houden. Installeer een knopknop op de deur. De bovenkant van de deur vangt onder het bovenste deksel (figuur 1A,B).
  5. Om een afneembaar bovendeksel met een gaas te maken, snijdt u de lange houten vierkante deuvel in 2 sets van 26 in en 12-3/4 in. Lijm en spijker de vier stukken op zo'n manier dat het rond de doos past - de binnenafmetingen van het frame zijn iets groter dan de buitenafmetingen van de doos, omdat het schermgaas aan dit frame wordt bevestigd.
  6. Knip het schermgaas tot iets minder dan 14 in x 26 in. Laat het scherm niet voorbij het frame uitsteken om scherpe randen te voorkomen. Heb hulp om het scherm op het frame uit te rekken. Houd het gaas met het frame vast door klemmen (figuur 1C) en gebruik een nietpistool met de juiste nietjes om het scherm aan het frame te bevestigen.
  7. Knip twee sets kortere houten vierkante deuvel (21 inch en 9 inch) en gebruik schroeven om het gaas langs het frame stevig te sandwichen met behulp van de 4 kortere stukken houten vierkante deuvel (figuur 1C, D).

2. Het maken van een inentingskamer

  1. Koop duidelijke acrylvellen en hardware-items bij geschikte winkels. Snijd een 7 in x 20 in het openingsvenster op de voorzijde acrylplaat van de doos zoals weergegeven in figuur 2C.
  2. Monteer de linker- en rechterkant, de voorste (met venster) en de achterste acrylplaten in een doos met behulp van 8 hoekklemmen zoals weergegeven in figuur 2A. Zorg ervoor dat de binnenmaten van de kamer gelijk zijn aan de afmetingen van de bovenplaat.
    OPMERKING: De rechterkant is er voor ondersteuning en wordt niet bevestigd aan de voorste of achterste vellen. Het is expres 1/2 korter dan de andere vellen. Deze rechterkant wordt een "draw down" "flap" deur die op zijn plaats wordt gehouden door een haaks scharnier aan de onderkant en twee magnetische vangsten aan de bovenkant zoals weergegeven in figuur 2C, D.
  3. Gebruik hoekbeugels om de panelen aan elkaar te bevestigen (figuur 2B,C). Houd de beugel op zijn plaats, markeer met een sharpie marker, centreer de pons en boor vervolgens het gat.
    OPMERKING: Het boren van acryl is anders dan het boren van iets anders, niet forceren of de zijkant van het gat tegenover de boor kan barsten. Gebruik klinknagels of schroeven. Draai de schroeven niet te strak vast, anders kan het acrylaat na verloop van tijd barsten.
  4. Draai de behuizing aan de achterkant en verwijder de 4 hoekklemmen en plaats de bovenplaat op zijn plaats. Markeren en boren.
  5. Installeer het haakse scharnier, gemaakt van een 3/4 hoekbeugel. Gebruik een nylon borgmoer als scharnierstang. Niet aanspannen, laat een opening zodat de deur op dit scharnier draait.
  6. Markeer, centreerpons, boor en bevestig de twee magnetische deurmagneten met # 6-32x3 / 4 "pankopschroeven. Bevestig vervolgens de vangplaten met #6-32x3/8" platte kopschroeven, zie figuur 2C,D.

3. Inenting van planten in flats

  1. Bereid verse echte meeldauwsporen als ent (bijv. Arabidopsis echte meeldauw Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Kweek schone Arabidopsis immuungecompromitteerde pad4-1 mutante planten 11 in een groeikamer (22 °C, 65% relatieve vochtigheid gedurende 6-8 weken) en ent een of half plat pad4-1 planten in om voldoende verse echte meeldauwsporen op te bouwen (figuur 3A).
  2. Kweek de planten voor het bepalen van infectiefenotypen in standaard 11 in x 21 in x 2,5 in flats.
    OPMERKING: Arabidopsis-planten die gedurende zes tot acht weken onder korte dag (8 uur licht, 16 uur donker; 22 °C) worden gekweekt, zijn goed voor infectietests met echte meeldauw.
  3. Wanneer verse echte meeldauwsporen van geïnfecteerde planten op 8-10 dagen na inenting (dpi) beschikbaar zijn, verplaats dan een platte planten voor infectietest in de inentingsdoos in de inentingskamer (figuur 1B, 2C).
  4. Snijd 15-20 zwaar geïnfecteerde Arabidopsis-bladeren (of 4-6 geïnfecteerde rozetten, afhankelijk van de blad/ rozetgrootte en het niveau van inenting), laat de bladeren drogen als er gecondenseerd water is.
  5. Pak 1-2 bladeren of een rozet met een lange tang met één hand en kijk de bladeren ondersteboven. Steek vervolgens beide handen door de opening van de kamer en sla voorzichtig met een schaar op de arm van de tang terwijl u langzaam de bladeren / rozet boven het gaas beweegt dat op de inentingsdoos is gemonteerd (figuur 3B). Herhaal dit totdat alle bladeren of rozetten zijn gebruikt.
    OPMERKING: Volwassen sporen zullen gemakkelijk loskomen van conidioforen van de geïnfecteerde bladeren. Probeer sporen op het gaas zo gelijkmatig mogelijk los te maken.
  6. Gebruik een of twee fijne fan-blenderborstels om de sporen voorzichtig door het gaas te borstelen (figuur 3C). Zorg ervoor dat u het volledige oppervlak van het gaas vier of meer keer in verschillende richtingen borstelt om de gelijkmatige verdeling van sporen op de planten op de bodem van de inentingsdoos te maximaliseren (figuur 3D). Dep het gaas een paar keer voorzichtig met de borstels om de sporen die in het gaas vastzitten af te schudden.
  7. Laat de sporen een halve minuut bezinken. Verplaats vervolgens de flat met de geënte planten uit de inentingsdoos. Bedek de flat met een plastic koepel en plaats deze in een groeikamer (22 °C, 65% relatieve vochtigheid). Ziektefenotypering kan worden uitgevoerd bij 5, of 8 tot 12 dpi 12.

4. Ent planten met kleinere inentingsboxen

OPMERKING: In gevallen waarin minder planten moeten worden ingeënt, kan de standaard inentingsbox nog steeds worden gebruikt. Zorg ervoor dat je de planten in het midden van de doos plaatst. Verwijder en borstel sporen in het gebied van het gaas dat de planten bedekt om ervoor te zorgen dat alle planten worden ingeënt terwijl ent wordt bespaard. Als alternatief, en bij voorkeur, kunnen kleinere inentingsdozen worden gebruikt (zoals hieronder beschreven).

  1. Converteer kartonnen dozen naar een inentingsdoos. Verwijder eenvoudig de boven- en onderkant van de doos, plak de hoek vast om deze indien nodig stevig te maken en monteer een gaas van 50 μm op de juiste grootte aan de bovenkant door te lijmen of nieten (figuur 4A, B).
  2. Verplaats de flat met de planten in de inentingskamer, plaats de kleinere inentingsdoos bovenop de flat om de planten te bedekken.
  3. Verjaag en borstel sporen zoals hierboven beschreven.

5. Ent losse bladeren in petrischalen

OPMERKING: In gevallen waarin (i) verse poederachtige meeldauwsporen zeer beperkt zijn en/of (ii) planten schoon moeten worden gehouden terwijl ziektefenotypen en/of eiwitsubcellulaire lokalisatie in geïnfecteerde cellen moeten worden beoordeeld, kunnen losgemaakte bladeren worden gebruikt voor infectie in MS-agarplaten.

  1. Maak een mini-inentingsdoos die maar iets groter is dan een petrischaaltje.
  2. Bereid 1/2-sterkte Murashige en Skoog (MS) medium agar (1,5%) platen. Voeg thiabendazool (40 mg / L) toe om schimmelbesmetting indien nodig te verminderen. Bewaar de borden bij 4 °C in een koelkast tot gebruik.
  3. Snijd een of twee volledig geëxpandeerde bladeren van de basis van de bladsteel voor elke individuele plant die moet worden getest. Steek de bladsteel van de losgemaakte bladeren in een agarmedium onder een hoek van ~30°.
    OPMERKING: Elke plaat kan 20-40 bladeren bevatten, afhankelijk van de grootte van de bladeren en de gebruikte plaat (figuur 4C).
  4. Ent de bladeren in de inentingskamer zoals hierboven beschreven. Verplaats de plaat met het deksel naar een groeikamer.
  5. Snijd een klein deel van een blad en controleer de subcellulaire lokalisatie van eiwitten op specifieke tijdstippen.
  6. Breng voor het beoordelen van infectiefenotypen de bladeren over naar een verse aseptische MS-agarplaat met 4 of 5 dpi. Snijd de basis van de bladsteel voordat u de bladeren in het verse agarmedium steekt. Beoordeel de fenotypen van de ziekte op 8 of 9 dpi.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een nieuwe poederachtige meeldauw sporeninentingsmethode die eenvoudig te bereiden, te bedienen en aan te passen is. Figuur 1 toont de assemblage van de standaard inentingsdoos met de nadruk op het merk van het verwijderbare deksel gemonteerd met een membraangaas van 50 μm. Figuur 2 toont de assemblage van de inentingskamer. Figuur 3 illustreert de belangrijkste stappen van het inentingsproces met behulp van dit ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze meshed-box-gebaseerde inentingsmethode heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere inentingsmethoden. Ten eerste kan het een gelijkmatige verdeling van sporen bereiken als het op de juiste manier wordt gebruikt, zoals aangetoond in figuur 5. Ten tweede kan het gebruik van ~ 50 μm mesh, plus sporenontwrichting door zacht schudden van geïnfecteerde bladeren, planteninfectie door trips of andere plant-infecterende insecten die aanwezig zijn in bronplanten verminderen. Ten derde k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd ondersteund door de National Science Foundation (IOS-1901566) aan S. Xiao. De auteurs willen F. Coker en C. Hooks bedanken voor het onderhoud van de plantengroeifaciliteit en Jorge Zamora voor technische hulp bij de fabricage van de inentingsdoos en -kamer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 48 µm roestvrijstalen gaasscherm; Maat: 24" X 48" AmazonNAVoor het maken van het deksel van een inoculatiebox
#6-32 x ¾" machine schroeven, platte ringen en moeren Home DepotNAVoor het maken van een inoculatiekamer
#6-32 verzinkte nylon borgmoer (4-Pack)Home DepotNAVoor het maken van een inoculatiekamer
#6-32x3/8” Phillips platte kop machine schroeven, platte ringen en moeren Home DepotNAVoor het bevestigen van magnetische deurgreeplakken
#8-32x1/2" machine schroeven, platte ringen en moerenHome DepotNAVoor het bevestigen van hoekstukken en deurhinge
0.250 dik transparante geëxtrudeerde acryl folie-gemaskeerde plaat;  Maat: 17 ½" X 20"Professional PlasticsSACR.250CEFVoor het maken van een inoculatiekamer
0.250 dik transparante geëxtrudeerde acryl folie-gemaskeerde plaat; Maat: 18" X 20"  Professional Plastics SACR.250CEFVoor het maken van een inoculatiekamer
0.250 dik transparante geëxtrudeerde acryl folie-gemaskeerde plaat; Maat: 18" X 30" Professional PlasticsSACR.250CEFVoor het maken van een inoculatiekamer
0.250 dik transparante geëxtrudeerde acryl folie-gemaskeerde plaat; Maat: 20" X 29 ½ "Professional PlasticsSACR.250CEFVoor het maken van een inoculatiekamer
1-5/8" kastdeuren magnetische witte greepHome DepotModel #P110-WVoor het maken van een inoculatiekamer
2" stalen verzinkte hoekstuk (8-Pack) Home Depot Model #13611 Voor het maken van een inoculatiebox & kamer
3" HoekklemHarbor Freight ToolsSKU 63653, 1852, 60589Voor het maken van een inoculatiekamer
3/4"  staal verzinkte hoekstuk (4-Pack)Home DepotModel #13542Voor het maken van een inoculatiebox & kamer
4-7/8" verzinkte lichte deurgreepHome DepotModel #15184Voor het maken van een inoculatiebox
Fijne ventilator-blender borstelsMichaels StoreM10472846 Voor inoculatie
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" houten vierkante bout Home DepotNAVoor het maken van het deksel van een inoculatiebox
Medium dichtheid vezelplaat (1/4" x 2' x 4'); Home DepotModel# 1508104Voor het maken van een inoculatiebox
Ronde glazen dekglasjes met een 500 µm rasteribidi USA Inc.10816Voor het bepalen van  spore dichtheid

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369(1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
  11. Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ziektefenotyperingspore inoculatieArabidopsis infectieinoculatieboxmesh inoculatieplantimmuniteitschimmelpathogeneseisolatie van epidermale cellen

Gerelateerde artikelen