Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Samenvatting

Primaire hepatocyten worden veel gebruikt in fundamenteel onderzoek naar leverziekten en voor toxiciteitstests in vitro. De tweestaps collagenaseperfusieprocedure voor primaire hepatocytenisolatie is technisch uitdagend, vooral bij portale adercannulatie. De procedure is ook gevoelig voor incidentele verontreiniging en variaties in perfusieomstandigheden als gevolg van problemen bij de assemblage, optimalisatie of onderhoud van de perfusie-opstelling. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor een verbeterde tweestaps collagenaseperfusieprocedure met multiparameterperfusiecontrole. Primaire rattenhepatocyten werden met succes en betrouwbaar geïsoleerd door de nodige technische voorzorgsmaatregelen te nemen bij kritieke stappen van de procedure, en door de operationele moeilijkheid te verminderen en de variabiliteit van perfusieparameters te verminderen door de toepassing van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslang, temperatuurregeling en real-time monitoring- en alarmsysteem. De geïsoleerde primaire rattenhepatocyten vertonen consequent een hoge cel levensvatbaarheid (85%-95%), opbrengst (2-5 x 10⁸ cellen per 200-300 g rat) en functionaliteit (albumine, ureum en CYP-activiteit). De procedure werd aangevuld met een geïntegreerd perfusiesysteem, dat compact genoeg is om in de laminaire stromingskap te worden geïnstalleerd om een aseptische werking te garanderen.

Inleiding

Primaire hepatocyten zijn belangrijke hulpmiddelen voor levergerelateerd fundamenteel onderzoek, ziektebehandeling en toepassing zoals het testen van geneesmiddelen. De huidige gouden standaard voor primaire hepatocytenisolatie is de tweestaps collagenaseperfusieprocedure ^1,2,3 geïntroduceerd door Seglen in de jaren 1970⁴. Deze procedure is echter technisch uitdagend en heeft een hoog faalpercentage wanneer uitgevoerd door beginnende chirurgen. Zelfs wanneer een perfusie als succesvol wordt beschouwd, kunnen drastische verschillen in levensvatbaarheid van hepatocyten (typisch 60% -95%) en opbrengst (0,5-5 x 10⁸ per 200-300 g rat) worden waargenomen tussen isolaties. Dit beïnvloedt de kwaliteit en schaal van downstream experimenten. Afgezien van de technische procedure, is de perfusie-opstelling die wordt gebruikt voor de isolatie, commercieel verkrijgbaar of op maat gemaakt, een bijdragende factor. Er moet aandacht worden besteed aan de montage, optimalisatie en het onderhoud van de perfusie-opstelling. Het doel van dit protocol is om het succespercentage en de stabiliteit tussen isolaties van primaire rathepatocyten te verbeteren door middel van multiparameter perfusiecontrole van de technische procedure en perfusie-instelling van de tweestaps collagenaseperfusieprocedure.

Vanuit het technische aspect is de moeilijkste stap in de procedure de portaaladercannulatie. Wat de andere stappen betreft, als goede praktijken in acht worden genomen en algemene voorzorgsmaatregelen worden genomen, kan de stabiliteit van de isolatie worden verbeterd. Daarom is het belangrijk om de redenering voor elke stap te begrijpen, zodat de chirurg kan reageren op verschillende variabelen die tijdens de procedure kunnen optreden.

Verschillende protocollen voor de isolatie van hepatocyten en lever niet-parenchymale cellen van rat en muis zijn gepubliceerd 1,2,5,6,7,8,9. De perfusie-opstellingen die in deze protocollen worden gebruikt, hadden verschillende nadelen, waaronder het hergebruik van perfusiebuizen, problemen met temperatuurregeling, behoefte aan routinematige optimalisatie van perfusieparameters en / of gebruik van ongeschikt type intraveneuze (IV) katheter voor portale aderconnulatie. Het hergebruik van perfusiebuizen vergroot de kans op besmetting, zeker als de slang niet goed gereinigd en gedesinfecteerd is. Hergebruik van buizen zonder routinematige vervanging zal de perfusie-opstelling ook blootstellen aan problemen zoals lekkende buizen of connectoren, verstopte bellenvanger en vernauwde slangen, die allemaal de perfusaatdruk en stroomsnelheid aanzienlijk zullen verminderen, waardoor de efficiëntie van de leververtering wordt beïnvloed. Zonder een constante warmtebron in sommige opstellingen voor temperatuurregeling, zullen voorverwarmde buffers na verloop van tijd afkoelen, wat leidt tot een lage collagenase-activiteit en spijsvertering. Hoewel andere opstellingen een glazen condensor met mantel gebruiken die is aangesloten op een watercirculatiepomp om de buffer te verwarmen, zijn ze omvangrijk en moeten ze zorgvuldig worden gereinigd. Temperatuur, druk en debiet van de buffer die de katheter verlaat, moeten vóór het begin van de isolatie worden gemeten en geoptimaliseerd om een stabiele perfusieconditie te verzekeren. Zelfs na optimalisatie kunnen de parameters nog steeds halverwege de isolatie veranderen als gevolg van de acties van de operator, wat leidt tot suboptimale perfusie en spijsvertering. De meeste soorten IV-katheters zijn niet geschikt voor poortader cannulatie omdat ze geen continue perfusie tijdens cannulatie toestaan. Ze zijn niet in staat om de chirurg onmiddellijk te informeren wanneer de cannulatie succesvol is. Bovendien is het een uitdaging om de poortader op de zachte katheter vast te zetten zonder deze te vervormen.

Hier pakken we deze problemen aan met behulp van gestandaardiseerde steriele wegwerpbuizen, een siliconen verwarmingsmantel voor nauwkeurige en stabiele temperatuurregeling, real-time bewaking en alarmsysteem met gegevensopslag en -beheer en gebruik van een speciale IV-katheter, die continue perfusie mogelijk maakt tijdens het doorboren van de poortader tijdens cannulatie. Voor zover we weten, zijn we de eerste groep die al deze functies combineert in een geïntegreerd perfusiesysteem (IPS) dat compact is, waardoor het zeer draagbaar is en in een laminaire stroomkap kan worden geplaatst om een aseptische werking te garanderen.

Protocol

Alle procedures en huisvesting van dieren werden uitgevoerd onder protocolnummers R15-0027 en R19-0669 in overeenstemming met de vereisten van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National University of Singapore.

1. Bereiding van oplossingen en chirurgische instrumenten

1. Bereid buffers en celkweekmedia in tabel 1 voor met ultrapuur water.
2. Verwarm de calciumvrije buffer en collagenasebuffer voor gebruik tot 37 °C in een waterbad.
3. Autoclaaf de volgende chirurgische instrumenten en laboratoriumapparatuur: een scherpe chirurgische schaar, een stompe chirurgische schaar, een gebogen chirurgische schaar, twee paar tandweefseltangen, twee paar gebogen tangen, twee paar gebogen tangen, twee aderclips, een 5 cm lange 3-0 zijden chirurgische hechting, een nylon mesh-filter van 100 μm, een bekerglas van 400 ml, en een trap (zwevend microcentrifugebuizenrek).

2. Het IPS instellen (zie figuur 1)

1. Veeg de laminaire stromingskap af met 70% ethanol. Veeg het IPS af met 70% ethanol en plaats het in de laminaire stroomkap. Steriliseer door UV gedurende >15 minuten voordat u de kap inschakelt.
   LET OP: Blootstelling aan UV-licht kan pijnlijke ogen en brandwonden op de huid veroorzaken. Zorg ervoor dat de vleugel volledig gesloten is wanneer het UV-lampje wordt ingeschakeld.
2. Monteer een nieuwe set wegwerpslangen op de IPS. Wikkel de slang stroomafwaarts van de peristaltische pomp in een siliconen kachelmantel. Monteer de perfusiemonitor op de slang stroomafwaarts van de siliconen kachelmantel.
3. Zorg ervoor dat de rolklemmen voor beide buisinlaten volledig zijn losgemaakt. Sluit elke buisinlaat aan op het taps toelopende uiteinde van een steriele 2 ml aspiratiepipet. Laat beide aspiratiepipetjes (inlaten) en de iv-katheter (uitlaat) in een fles van 1 liter met calciumvrije buffer om recirculatie van de buffer mogelijk te maken tijdens de daaropvolgende primingstappen.

Figuur 2: Zelftestinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Schakel de IPS in. Voer de volgende bewerkingen uit op het bedieningspaneel van het aanraakscherm. De software voert elke keer dat deze wordt gestart een uitgebreide zelftest uit.
   LET OP: De IPS is een elektrisch apparaat dat is aangesloten op een externe voedingsbron. Gemorste vloeistoffen op de IPS- of stroomkabels kunnen elektrische gevaren veroorzaken.
   1. Zorg ervoor dat de zelfteststatus op het scherm wordt weergegeven (afbeelding 2). Onderdelen die de zelftest hebben doorstaan, worden in het groen weergegeven; degenen die zijn mislukt, worden in het rood weergegeven. Tik na rectificatie op het pictogram Testen om de zelftest opnieuw te herhalen of tik op het pictogram Systeem invoeren om rechtstreeks in de bedieningsinterface te komen.
   2. Tik ergens op het scherm om in te loggen op de bedieningsinterface.
   3. Tik in de linkerbovenhoek van de bedieningsinterface (figuur 3) op een van de cirkelvormige pijlpictogrammen om de draairichting voor de peristaltische pomp in te stellen. Tik in het rechterdeelvenster van de interface op de pijl-omhoog / omlaag-pictogrammen om waarden in te stellen voor de bijbehorende parameters. Stel de stroom in op de constante stroommodus; temperatuur van de verwarmingsmantel tot 42 °C (in te stellen om ervoor te zorgen dat de temperatuur van het perfusaat op 37 °C wordt gehouden); en pompsnelheid tot 38 rpm voor een debiet van ~33 ml/min.
   4. Controleer in het rechteronderpaneel van de bedieningsinterface op de status van het bellenalarm, het perfusiestopalarm en het mute-pictogram.
   5. Controleer op de temperatuur, druk en stroomsnelheid van het perfusaat in het linkerpaneel. Stel de intervallen handmatig in door op de pijlen omhoog en omlaag boven en onder in de kolommen te klikken. Controleer op de realtime gegevens die als waarden in het midden van de kolommen worden weergegeven. De kleur van de kolom verandert van groen naar rood als de realtime gegevens buiten het ingestelde bereik gaan.
   6. Zoek de pictogrammen om de perfusie te starten, te pauzeren en te stoppen, en het pictogram om over te schakelen van realtime gegevensweergave naar grafiekmodus in het middelste deelvenster. Tik op het startpictogram om de perfusie te starten en de slang te primen met een calciumvrije buffer. Er wordt een nieuw logboek gemaakt. Voer de bestandsnaam en gebruikersnaam in het pop-upvenster in (afbeelding 4).

Figuur 3: Bedieningsinterface. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Pop-upvenster waarin wordt gevraagd om bestandsnaam en gebruikersnaam. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5. Vul de druppelkamer tot halfvol. Zorg ervoor dat er tijdens het primen geen opgesloten luchtzakken in de slang zitten.
6. Verwijder elke bel die zich stroomafwaarts van het bellenfilter vormt door op de slang te vegen om de bel los te maken en uit te spoelen.
   OPMERKING: Bubbels kunnen zich langs de slang vormen als de buffer wordt opgewarmd door de kachelmantel.
7. Vul een bekerglas van 400 ml met 200 ml collagenasebuffer. Zet het podium bovenop het bekerglas. Zonder lucht in de slang te brengen, spant u de rolklem voor een van de buisinlaten volledig aan en verplaatst u de aspiratiepipet voor de inlaat in het bekerglas.

3. Dierprocedure

1. Bereid een jongvolwassen mannelijke Wistar-rat voor op ongeveer 200-300 g lichaamsgewicht.
   OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor ratten met een lichaamsgewicht van ongeveer 200-300 g. Mannelijke ratten hebben de voorkeur omdat hormonale veranderingen tijdens de oestruscyclus bij vrouwelijke ratten de hepatocytenfunctie zullen beïnvloeden.
2. Anesthesie
   1. Trek het vereiste volume antistollingsmiddel heparine (5.000 IE/ml; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) en rattenanesthesie ketamine/xylazinecocktail (37,5 mg/ml ketamine, 5 mg/ml xylazine; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) op in spuiten van 1 ml met een naald van 27 g.
      LET OP: Anesthesie en heparine zijn schadelijke stoffen. Wees voorzichtig bij het hanteren van scherpe voorwerpen.
   2. Houd de rat in bedwang. Injecteer intraperitoneaal heparine gevolgd door ketamine / xylazinecocktail in het kwadrant rechtsonder in de buik.
      OPMERKING: Het caecum heeft een grotere kans om zich aan de linkerkant te bevinden. Vermijd het doorboren van het caecum tijdens de injectie om het risico op besmetting te verminderen.
   3. Controleer na 10 minuten de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex op beide voeten van de rat te beoordelen. Blijf van tijd tot tijd controleren en wacht tot de rat niet langer reageert op teenknijpen. Extra anesthesie kan indien nodig worden geïnjecteerd.
3. Plaats de rat in rugligging met uitgestrekte ledematen op een met aluminiumfolie bedekt polystyreenplatform bovenop een dienblad. Plak de poten van de rat vast en speld de tape stevig op het platform met 27 G-naalden.
4. Desinfecteer de borst en buik door ze te besproeien en te drenken met 70% ethanol. Scheren voorafgaand aan desinfectie is optioneel. Zet de rat in de motorkap. Ga verder met de volgende stap terwijl de vacht nog nat is.
   OPMERKING: Drenken met 70% ethanol houdt ook huidschilfers en bontstof tot een minimum beperkt.
5. Scheid de huid van de spier.
   1. Met een paar tandweefseltangen in één hand, til de huid op in de buurt van de basis van de buik. Knip met een scherp-stompe chirurgische schaar in de andere hand de tenthuid. Duw het scherpe uiteinde van de schaar onder de huid en maak een middellijnincisie op de huid van net boven de achterpoten tot net onder de voorpoten.
   2. Terwijl u de huid optrekt en licht uitrekt met de tang, snijdt u elk bindweefsel af dat de huid op de spier in de borst en buik houdt. Om het risico op besmetting te verminderen, voorkomt u dat losse vacht op de spier valt. Om opgebouwde losse vacht op de schaar te verwijderen, veegt u ze af aan de gedesinfecteerde buitenkant van de huid.
   3. Maak laterale incisies op de huid, van de middellijn tot beide zijden van de rat iets boven de achterpoten en iets onder de voorpoten. Duw de flappen van de huid naar de zijkanten om de spier bloot te leggen.
6. Snijd de buikspier open om de organen bloot te leggen.
   1. Met een nieuw paar tandweefseltangen in één hand, til de spier op in de buurt van de basis van de buik. Met een stompe chirurgische schaar in de andere hand, snijd voorzichtig door de spier zonder een van de organen te snijden. Maak een middellijnincisie op de spier van iets boven de achterpoten tot aan het borstbeen.
   2. Maak laterale incisies op de spier, van de middellijn naar beide zijden van de rat iets boven de achterpoten en net onder de ribbenkast, zonder een van de organen te snijden. Duw de spierflappen naar de zijkanten om de organen bloot te leggen. Zorg ervoor dat de laterale incisies van de huid en spier de zijkanten van de rat bereiken, zodat bloed en buffers bij latere stappen uit de buikholte kunnen stromen.
7. Portalader cannulatie
   1. Duw met de achterkant van een gebogen tang de darmen voorzichtig naar rechts. Klap de leverlobben voorzichtig omhoog om de poortader bloot te leggen.
   2. Gebruik een 3-0 zijden chirurgische hechting om een zeer losse ligatuur te maken rond de poortader dicht bij de lever, net voordat de ader zich links en rechts in verschillende leverkwabben vertakt. Span de ligatuur niet aan om te voorkomen dat de bloedstroom door de poortader wordt verstoord. Een zeer dun membraan onder het galkanaal moet worden doorbroken met de punt van de gebogen tang voordat de hechting eronder kan passeren en rond de poortader (en galweg) kan worden gelust.
   3. Gebruik de uiteinden van twee paar gebogen tangen om voorzichtig een gat door het weefsel onder de poortader te prikken, zonder de poortader te beschadigen. Doe dit ongeveer 2-3 cm stroomopwaarts van de eerste ligatuur, vlak voordat de maagader zich vertakt van de poortader. Het weefsel is dunner op deze specifieke locatie.
   4. Rek het gat voorzichtig groter uit met de tang. Met dit gat kan de tang de poortader ondersteunen tijdens de cannulatie.
   5. Verlaag de pompsnelheid tot 4 rpm voor een debiet van ~3 ml/min. Zorg ervoor dat de uitstroom van calciumvrije buffer uit de IV-katheter wordt teruggebracht tot een langzaam infuus.
      OPMERKING: Drukopbouw in de lever zal de dood van hepatocyten veroorzaken. Een lagere stroomsnelheid zou de drukopbouw in de lever moeten vertragen bij het succesvol inbrengen van de canule in de poortader bij een latere stap.
   6. Ondersteun de poortader voorzichtig met een tang. Houd met de andere hand de infuuskatheter vast met de schuine kant van de naald naar boven gericht. Richt de naald in een hoek van 10-20° in de poortader en ga langzaam vooruit totdat de hele schuine kant zich in de ader bevindt. Zodra de naald correct in de poortader is ingebracht, begint de lever te blancheren en verliest hij zijn donkerrode kleur.
      OPMERKING: De hele schuine kant van de naald moet in de ader worden ingebracht om een gat te maken dat groot genoeg is voor het inbrengen van de canule. Steek de naald echter niet te diep in om te voorkomen dat de ader te veel wordt doorboord.
   7. Breng de canule over de naald en in de ader. Trek vervolgens de naald terug totdat deze 2-3 mm achter de canule is; net genoeg zodat de scherpe punt veilig in de canule zit. Gebruik de duim en middelvinger om de katheter vast te houden en gebruik de wijsvinger om de vleugel terug te trekken om de naald in te trekken.
   8. Bevestig de poortader snel op de katheter met een aderclip. Klem niet direct op het zijgat van de naald om te voorkomen dat de perfusaatstroom wordt verstoord. Klik er in plaats daarvan onder.
   9. Snijd onmiddellijk de infrahepatische inferieure vena cava (IVC) om drukopbouw in de lever te voorkomen. Inmiddels zullen de infrahepatische IVC en aangrenzende bloedvaten worden verduisterd door bloed uit de poortader. Om ervoor te zorgen dat de IVC correct werd gesneden en afgehakt, moet u letten op bloed dat in pulsen uitspat; bloed zal alleen uit aangrenzende bloedvaten druppelen.
      OPMERKING: Het duurt te lang om de infrahepatische IVC te snijden na cannulatie of het niet snijden voordat u doorgaat naar de volgende stap, zal de dood van de hepatocyt veroorzaken. Het dier wordt onder narcose geëuthanaseerd door exsanguinatie (door het snijden van de IVC) tijdens deze stap. De procedure moet worden voortgezet terwijl het bloedverlies aan de gang is. De dood kan worden bevestigd door visuele observatie van het stoppen van de hartslag / ademhaling wanneer de borstholte bij een latere stap wordt geopend.
   10. Verhoog de pompsnelheid tot 38 rpm voor een debiet van ~33 ml/min. Spoel de lever drie keer door de IVC met een tang voor 2-3 s (maar niet te lang) te sluiten en opnieuw te openen.
       OPMERKING: Tijdens het spoelen zal de lever iets uitzetten voordat deze weer normaal wordt. Spoelen vergemakkelijkt de permeatie van perfusaat in de hele lever. Na het spoelen moet de lever volledig lichtbruin van kleur zijn.
   11. Zorg ervoor dat de canulepunt vóór het punt wordt geplaatst waar de poortader zich vertakt in verschillende leverlobben, om perfusie van alle leverlobben te garanderen. Maak indien nodig de poortader los en pas de positie van de canule aan. Achteraf opnieuw knippen.
   12. Span de losse ligatuur rond de poortader aan, iets stroomopwaarts van het vertakkingspunt. Maak drie knopen op de plaats waar de zachte canule wordt ondersteund door de harde metalen naald, tussen de schuine kant en het zijgat. Zorg ervoor dat de knopen de canule op zijn plaats bevestigen, vastzetten aan de poortader en terugstroming van buffers voorkomen.
8. Reseceer de hele lever intact.
   1. Perfuseer de lever met een calciumvrije buffer met een stroomsnelheid van ~ 33 ml / min gedurende de volgende 12 minuten (zie figuur 5A). Voer in de tussentijd leverresectie uit. De perfusietijd kan indien nodig worden verlengd, maar zorg ervoor dat de calciumvrije buffer niet opraakt.
   2. Maak met een gebogen schaar de poortader voorzichtig los van de darmen door het mesenterium te knippen dat ze met elkaar verbindt. Prik niet in het maagdarmkanaal (slokdarm, maag en dunne en dikke darm) om ervoor te zorgen dat er geen besmetting optreedt.
      OPMERKING: Dit is om te voorkomen dat de poortader scheurt wanneer de lever tijdens de resectie wordt verplaatst.
   3. Maak de lever los van het maagdarmkanaal door bindweefsels, pancreas en mesenterium te snijden dat de lever verbindt met het maagdarmkanaal. Om los te maken, knip altijd met een schaar en trek niet om te scheuren. Nogmaals, niet inkeping of snijd het maagdarmkanaal.
   4. Draai de lever voorzichtig naar beneden om het middenrif bloot te leggen. Knip het diafragma langs de wanden van de ribben. Zorg ervoor dat het grootste deel van het diafragma verbonden blijft met de lever. Pas op dat u de lever niet prikt of kneuzen.
   5. Zodra de borstholte is geopend, zijn twee kanalen te zien: de witachtige suprahepatische IVC aan de linkerkant en de gelige slokdarm aan de rechterkant. Klem de suprahepatische IVC en knip deze net boven de clip. Het knippen van de suprahepatische IVC is optioneel. Het voorkomt dat de borstholte onder water komt te staan.
      OPMERKING: Visueel observeren voor het stoppen van de hartslag / ademhaling om de dood van dieren te bevestigen.
   6. De slokdarm is omgeven door het middenrif. Om de slokdarm van het diafragma te isoleren, snijdt u het diafragma van rechts naar de slokdarm. Snijd alle resterende bindweefsels die de slokdarm en maag verbinden met de lever en het middenrif.
   7. Duw het maagdarmkanaal naar rechts weg. Breng de aderclip over van de suprahepatische IVC naar de infrahepatische IVC; buffer zal nu perfuseren uit de suprahepatische IVC.
      OPMERKING: Tijdens de perfusie worden de canule en infrahepatische IVC bedekt door de lever. Sterke bufferuitstroom van de suprahepatische IVC zal de chirurg helpen om perfusielekkages uit te sluiten.
   8. Snijd het resterende diafragma af dat de lever verbindt met de borstholte. Snijd weefsels af die de lever verbinden met de buikholte. Zorg ervoor dat u de infrahepatische IVC boven de clip niet snijdt om te voorkomen dat de clip van de lever wordt losgemaakt.
   9. Om ervoor te zorgen dat de lever volledig wordt gereseceerd, tilt u de lever voorzichtig op door het middenrif met een tang vast te houden. Als er resterende weefsels zijn die de lever met de buikholte verbinden, snijd ze dan af. Als de nier en milt nog steeds verbonden zijn met de lever, maak ze dan los.

4. Leverperfusie en spijsvertering

1. Als de resectie vroeg is voltooid, wacht dan tot de lever gedurende 12 minuten is doordrenkt met calciumvrije buffer.
2. Verander de perfusiebuffer in collagenasebuffer. Maak de rolklem voor collagenasebuffer volledig los voordat u de rolklem volledig aanspant voor een calciumvrije buffer (zie figuur 5B). Zodra de collagenasebuffer de lever bereikt via de slang, spoelt u de lever drie keer door de suprahepatische IVC gedurende 2-3 s te sluiten en opnieuw te openen.
3. Verplaats de lever voorzichtig naar het stadium bovenop het bekerglas voor recirculatie van collagenasebuffer. Beweeg de lever door het diafragma vast te houden met een tang terwijl u de katheter ondersteunt. Vermijd trekken aan de katheter om onbedoeld losmaken van de katheter te voorkomen.
   OPMERKING: Als de katheter losraakt en de poortader te beschadigd is voor herkansing, cannulaat dan de suprahepatische IVC en laat de buffer uit de poortader doordringen. Zorg ervoor dat de infrahepatische IVC geknipt blijft.
4. Verteer de lever gedurende 12 min. Let op het verschijnen van doorschijnende vlekken / netwerk als de lever zijn gladde bruine textuur begint te verliezen. De lever wordt groter en zachter naarmate het wordt verteerd. Zodra de lever een papperige consistentie heeft, stop dan met de perfusie. De verteringstijd kan indien nodig worden verlengd.
   OPMERKING: Als de Glisson-capsule is gebroken, kan de collagenasebuffer in het bekerglas troebel worden als gevolg van ontsnapte levercellen.

5. Hepatocytenisolatie

1. Verwijder de canule voorzichtig door de poortader af te snijden. Verwijder de clip voorzichtig. Breng de lever over in een schaal van 150 mm met 60 ml koude Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
2. Tik zachtjes op de lever met behulp van de achterkant van de gebogen tang om de capsule van de Glisson te breken en af te pellen. Zwaai vervolgens voorzichtig de lever zij aan zij in DMEM om levercellen vrij te geven. Blijf dit doen totdat levercellen volledig zijn gedissocieerd in de DMEM.
   OPMERKING: Af en toe wordt de hele lever of bepaalde lobben slechts gedeeltelijk verteerd. Door de lever niet te schrapen, die met geweld zal verwijderen en ongestoorde hepatocyten zal beschadigen, kan een hogere en consistentere levensvatbaarheid van de cel worden verkregen.
3. Schommel de 150 mm schaal voorzichtig totdat de levercellen goed verdeeld zijn in DMEM. Om weefselstukken en celklonten te verwijderen, giet u de celsuspensie door een nylon gaasfilter van 100 μm poriegrootte dat over een nieuwe schaal van 150 mm is geplaatst. Spoel de oude schaal af met 30 ml DMEM en breng de suspensie over naar het gaasfilter. Tik zachtjes op het gaasfilter om gevangen enkele levercellen door te laten.
4. Verwijder het gaasfilter en schommel de nieuwe 150 mm schaal voorzichtig totdat de levercellen goed verdeeld zijn. Verdeel de ophanging gelijkmatig in buizen van 4 x 50 ml. Spoel de schaal af met 30 ml DMEM en verdeel de suspensie gelijkmatig in dezelfde buizen. Zorg ervoor dat elke buis een gelijk volume celsuspensie heeft.
5. Centrifugeer de buizen van 4 x 50 ml celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Adem het supernatant voorzichtig op zonder de losse pellet te verstoren. Gooi het supernatant weg. Voeg 20 ml DMEM toe aan elke buis en schommel de buizen voorzichtig om de celkorrel opnieuw te conditioneren. Combineer de celsuspensie van vier buizen in twee.
6. Centrifugeer de buizen van 2 x 50 ml bij 20 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Voeg 20 ml DMEM toe aan elke buis en schommel de buizen voorzichtig om de celkorrel opnieuw te conditioneren. Combineer celsuspensie van twee buizen tot één. Houd de cellen op ijs tot gebruik.
7. Bereid trypan blauwe oplossing door 400 μL 1x PBS te mengen met 50 μL trypan blauw. Voeg 50 μL hepatocytensuspensie toe aan de trypanblauwe oplossing. Tel het aantal levensvatbare en dode hepatocyten met een hemocytometer onder de lichtmicroscoop.

6. Hepatocytencultuur

1. Voer alle celkweekstappen in de kap uit. Voeg 1 ml collageen coatingoplossing toe in een schaal van 35 mm en incubeer gedurende 4 uur. Spoel de vaat drie keer af met 1x PBS.
2. Verdun hepatocytensuspensie in hepatocytenkweekmedium tot een concentratie van 0,8 miljoen cellen/ml. Voeg 1 ml verdunde hepatocytensuspensie toe aan de schaal van 35 mm.
   OPMERKING: Hepatocyten zijn gevoelig voor schuifspanning tijdens het pipetteren. Overweeg het gebruik van pipetpunten met brede boring.
3. Schommel het gerecht om de hepatocyten gelijkmatig te verdelen. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 3-4 uur om de hepatocyten te laten hechten.
4. Voor de sandwichcultuur.
   1. Verwijder het medium hepatocytenkweek. Spoel eenmaal met 1 ml hepatocytenkweekmedium om niet-gehechte cellen te verwijderen. Voeg 1 ml collageenoverlay-oplossing toe. Voeg collageenoverlay-oplossing toe aan de wanden van de schaal om te voorkomen dat er bubbels in de oplossing komen.
   2. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende een nacht om collageengeilatie mogelijk te maken.
   3. Voeg 1 ml vers hepatocytenkweekmedium toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
5. Voor monolayer cultuur.
   1. Verwijder na stap 6.3 het medium van de hepatocytenkweek. Spoel eenmaal met 1 ml hepatocytenkweekmedium om de niet-aangebonden cellen te verwijderen.
   2. Voeg 1 ml vers hepatocytenkweekmedium toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
6. Beoordeel de zuiverheid en functie van hepatocyten door immunostaining uit te voeren voor hepatocytspecifieke marker- en functionele assays zoals eerder beschreven^10,11.

Resultaten

Een chirurg kan zien of de leverperfusie soepel verloopt door de uitkomst na bepaalde stappen te observeren. De eerste uitkomst kan worden waargenomen bij cannulatie, het snijden van de infrahepatische IVC en het herstellen van de perfusiestroomsnelheid. De lever moet volledig van kleur zijn veranderd van donkerrood naar bruin, met behoud van het volume. Als de lever er enigszins leeggelopen uitziet en een roodachtige tint of vlekken rood heeft, betekent dit dat de perfusiestroomsnelheid verkeerd is ingesteld (te laag) o...

Discussie

Er zijn een paar punten die bijzonder belangrijk zijn om in acht te nemen voor de tweestaps collagenaseperfusieprocedure in het algemeen. Ten eerste moet speciale zorg worden besteed bij het reseceren van de lever. Zorg ervoor dat het maagdarmkanaal niet wordt beschadigd, omdat lekkage van de inhoud zal leiden tot bacteriële besmetting. Vermijd bovendien beschadiging van de Glisson-capsule, die het oppervlak van de lever bedekt tijdens de dierprocedure. Als de scheur groot genoeg is, kan dit voortijdige afgifte van gedis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal/Uitrusting
1 mL spuit	Nipro
27G naald	Nipro
Zwarte gevlochten zijde niet-absorbeerbare, niet-steriele chirurgische hechting	Look	SP117
Bochem 18/10 roestvrijstalen pincet, scherpe punt bevat gebogen ronde punt	Bochem	10333511
Weggeefset voor perfusie	Vasinfuse	BPF-112
Zwevende cirkelvormige microcentrifugebuishouder 1,5 mL	Sigma-Aldrich	R3133
Duitse standaard weefselpincet, gekarteld / 1×2 tanden, 14,5cm	Walentech
Greiner Cellstar zuigpijp	Merck	GN710183
Hemocytometer
Geïntegreerd perfusiesysteem	Vasinfuse	IPS-001
Iris schaar gebogen, roestvrij, 11cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	CVD
Lichtmicroscoop met 10X lens	Olympus
Gaasplaat 100µM Nylon	Spectra-Teknic(s) Pte Ltd	06630-75
Operatieschaar, BL/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – BL/BL
Operatieschaar, SH/BL, 13cm	Optimal Medical Products Pte Ltd	STR – SH/BL
Omgekeerde kracht hemostatische clip	Shanghai Jin Zhong Pte Ltd	XEC230
Waterbad	Grant
Reagentia/Chemicaliën
10X Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma-Aldrich
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9056
CaCl2·2H2O	Merck	137101
Collageenase Type IV	Gibco	17104019
Dexamethason	TCI	D1961
DMEM	Gibco	31600-034
Glutamax	Gibco	35050061
HEPES	Invitrogen	11344-041
Insulin	Sigma-Aldrich	1-9278
KCl	VWR	VWRC26764.298
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
Linolzuur	Sigma-Aldrich	L9530
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NaOH	Merck	106462
Penicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333
Type I bovien collageen	Advanced BioMatrix	5005-100ml
William’s E Media	Sigma-Aldrich	W1878